CC BY
26
I 1-2006
БЮЛЛЕТЕНЬ ВОЛГОГРАДСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАМН
:
ИССЛЕДОВАНИЕ ОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ НОВОГО ВЕЩЕСТВА С ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Л.И. Бугаева, Е.А. Лебедева
НИИ фармакологии ВолГМУ
В Волгоградском государственном медицинском университете проводятся исследования нового ряда соединений - производных 9-(2-феноксиэтил)адени-на. В ряду данных производных обнаружено вещество (ВМА-99-82) с противовирусной и антидепрессивной активностью [13, 4].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить профиль токсических свойств вещества ВМА-99-82 при однократном введении крысам.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проводили на 140 половозрелых крысах обоего пола массой 190-220 г, доставленных из питомника НИИГТиП г. Волгограда. Животные обеспечивались полноценными комбикормами, имели свободный доступ к автопоилкам и кормушкам. Содержались в пластиковых клетках по 5 особей одного пола. Освещение вивария в течение светового времени было естественным, температура воздуха поддерживалась на уровне 20-24 °С.
Весь комплекс исследований выполняли в три этапа. На первом этапе изучали острую токсичность, на втором исследовали влияние на функционально-поведенческий статус животных, на третьем рассчитывали терапевтический индекс, диапазоны безопасной и токсической активности.
При изучении острой токсичности субстанцию ВМА-99-82 вводили крысам с помощью металлического зонда внутрижелудочно в летальных дозах. Наблюдения вели в течение 15 дней. Отмечали клинику отравления и гибель крыс.
Расчет ЛД50 вещества проводили с использованием метода Литчфилда и Уилкоксона [5].
На втором этапе оценку влияния вещества на "психо-неврологический" статус животных проводили по шкале Ирвина [3] по показателям: поведенческая активность (эмоциональность, настороженность, пассивность, агрессия, груминг, локомоции, стереотипии, спонтанная двигательная активность), нервно-рефлекторные (судороги, тремор, подергивания, реакция на болевые раздражители) и вегетотропные реакции (зрачковые рефлексы, уринации, дефекации, саливации, дыхание, температура тела, цвет кожи). На третьем этапе результаты тестирования подвергали математической обработке [2]. По отраженным интегральным значениям на круговой диаграмме рассчитывали терапевтический индекс, уровни безоРЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ(ТУ) действия веществах ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе исследований выявлено, что после введения вещества ВМА-99-82 крысам развитие признаков отравления наблюдалось в течение первого часа, продолжительность симптоматики интоксикации - в течение 4-6 ч, реабилитация физического состояния у животных, оставшихся в живых, наступала через сутки. Характерным для клиники отравления веществом являлось: понижение подвижности, вплоть до полной обездвиженности, седация, снижение тактильной и болевой чувствительности, птоз, одышка, бледность кожных покровов. Гибели крыс предшествовали: боковое положение, отсутствие реакций на болевые и внешние раздражители, угнетение дыхания, тремор конечностей, переходящий в отдельные тонические судороги. На вторые сутки наблюдений у животных, оставшихся в живых, были восстановлены все виды чувствительности. Впоследствии зафиксирована тенденция положительной динамики прироста массы тела, отдаленной гибели не отмечено.
При расчете выявлено, что ЛД 50 вещества в среднем равно 4811,66 мг/кг, что позволяет по классификации токсичности веществ [5] отнести ВМА-99-82 в класс малотоксичных.
На втором этапе исследований в профиле токсикологической активности вещества в дозах до 40 мг/кг, выявлено слабое влияние на функционально-поведенческий статус животных, отмечена тенденция увеличения частоты дыханий, реакций на раздражители, повышения (в среднем на 0,5 °С) ректальной температуры. Более существенными оказались эффекты вещества в диапазоне доз 75-300 мг/кг. При этом у крыс отмечено дозозависимое повышение настороженности, груминга, спонтанной двигательной активности, болевой и тактильной чувствительности, тонуса конечностей. Со стороны вегетативных эффектов наблюдалось: усиление дыхательной активности, прогрессирующее повышение ректальной температуры. У животных под действием вещества в дозе 300 мг/кг ректальная температура повышалась в среднем на 2-2,5 °С, а частота дыханий возросла в 2 раза. Иная динамика токсикологических эффектов прослеживалась у крыс под действием вещества в дозах от 600 до 4800 мг/кг. Отмечалось угнетение поведенческих реакций, нервно-мышечной возбудимости, ректальная температура понижалась в среднем на 1,5-2 °С, дыхание урежалось (до 5-10 актов в мин у крыс в дозе 4800Пи;/кг) математической обработки этих данных были получены интегральные значения, которые отразились в виде "дозовой траектории" на круговой диаграмме (см. рис. 1). Как видно из результатов, дозовая траектория вещества ВМА-99-82 охватывает все три сектора функционально-поведенческого статуса крыс. Характерные изломы на указанной траектории отражают в интегральном виде эффекты вещества на качественную основу состояния животных. Анализируя расположение дозовых точек на
ф| 20 |ф
БЮЛЛЕТЕНЬ ВОЛГОГРАДСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАМН
интегральной траектории, предположили, что в диапазоне доз от 18,7 до 4800 мг/кг в действии вещества УМЛ-99-82 на психо-неврологический статус крыс прослеживаются четыре этапа. Этапы различной активности вещества отражены на интегральной "дозо-вой траектории" резко преломляющимися траекториями. Первый этап действия соответствует зонам точек 1-11, второй - Ш-У, третий - УГ-УП и четвертый - УШ-1Х. При этом в первой и второй зонах отчетливо прослеживаются нарастающие дозозависимые интегральные эффекты. На "дозовой траектории" это точки 1-5 (соответственно дозы вещества от 18,7 до 300 мг/кг), расположеннные по вертикали рядом. В данном плане влияние испытуемого вещества на психо-
1-2006 I
неврологический статус крыс можно рассматривать как эффективное и безопасное. Третью зону активности вещества УМЛ-99-82 в диапазоне доз, расположенных на траектории в точках 5-7 (соответствует 300-1200 мг/кг), также можно отнести к диапазону безопасной активности вещества ВМЛ-99-82. При этом у вещества безопасная фармакологическая (вероятно - терапевтическая) активность дозозависимо снижается за счет прогрессирующей динамики предикторов побочных эффектов, формирующих токсические свойства. Четвертая зона, соответствует токсическому диапазону активности вещества в дозах 2400 и 4800 мг/кг.
Рис. Интегральная оценка острого влияния вещества УМЛ-99-82 на функционально поведенческий
статус крыс:
Римские цифры на "дозовой траектории" от I до IX соответствуют дозам вещества - 18,7; 37,5; 75,0; 150,0; 300,0; 600,0; 1200,0; 2400,0 и 4800,0 мг/кг; цифры на круговой диаграмме: 1 - вокализации, 2 - настороженность, 3 - пассивность, 4 - стереотипия, 5 - беспокойство, 6 - агрессия, 7 - груминг, 8 - спонтанная двигательная активность, 9 - реакция на прикосновение, 10 - реакции на боль, 11 - реакции на стук, 12 - тремор, 13 - подергивание, 14 - судороги, 15 - расстройство походки, 16 - тонус конечностей, 17 - положение мигательной перепонки, 18 - размер зрачка, 19 - саливации, 20 - уринации, 21 - дефекации, 22 - температура, 23 - цвет кожи, 24 - частота дыханий
Учитывая выделенные на "дозовой траектории" интервалы фармакологической и токсической активности вещества ВМЛ-99-82, а также и величины ЛДз0, рассчитали терапевтический индекс (ТИ)
вещества, который оказался равным 257 у. е. В пределах данного интервала установили, что безопасный терапевтический потенциал вещества фиксируется на "дозовой траектории" в интервале от 18,7 до
I 1-2006
БЮЛЛЕТЕНЬ ВОЛГОГРАДСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАМН
:
300 мг/кг, что соответствует 16 у. е. В дальнейшем же предикторы побочных реакций нарастают, что сопряжено со снижением фармакологической эффективности вещества, но побочные эффекты вещества в диапазоне активности от 300 до 1200 мг/кг обратимы. Учитывая это, можно предположить, что вещество ВМЛ-99-82 безопасно в плане его энтерального введения крысам в дозах до 1200 мг/кг, а значит уровень его безопасного действия (диапазон точек 1-7 или от 18,7 до 1200 мг/кг) равен 64 у. е.
Токсическое действие у вещества прослеживается в дозах от 2400 до 4800 мг/кг. В данном диапазоне доз (8-9-е точки на интегральной "дозовой траектории") эффекты влияния вещества были необратимы, инвертированы диапазону активности 2 и 3, т. е. их можно расценивать как токсические (ТУ). При расчете (ТУ = 4800/18,7) установили, что достоверно токсический уровень вещества ВМЛ-99-82 оказался равным от 128 до 256 у. е.
Таким образом, по результатам проведенных исследований можно заключить, что по степени токсичности новое противовирусное средство относится к классу малотоксичных соединений. При этом установленные интегральным путем значения диапазонов терапевтического (16 у. е.) и токсического (256 у. е.) уровня действий отражают степень "пользы/риска" данного вещества и могут быть использованы в доклиническом обосновании критериев его безопасности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Петров В.И., Озеров А.А., Новиков М.С. и др. // Химия гетероциклич. соед. - 2003. - Вып. 9. - С. 1389-1397.
2. Петров В.И., Озеров А.А., Новиков М.С. // Тез. II Съезда Рос. науч. общ. фармакол. - М., 2003. - Ч. 2. - С. 79.
3. Irvin S. // Animal and Clinical Pharmacologic Techniques in Drug Evaluation. - Chicago, 1964.
4. Бугаева Л.И., Веровский В.Е., Иежица И.Н. и др. // Эксп. клин. фармакол. - 2000. - Т. 63, № 1. - С. 3-6.
5. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л: Медгиз, 1961. - 152 с.
ПРОТИВОСТРЕССОРНЫЕ И ИММУНО-МОДЕЛИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА МАЛЫХ ДОЗ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ГЕПАРИНА
М.В. Кондашевская, О.В. Макарова, В.Л. Ковалева
ГУ НИИ морфологии человека РАМН, Всероссийский научный центр биологически активных веществ, г. Москва
Эмоциональные стрессы, как сейчас бесспорно установлено, являются главной причиной иммуно-дефицитных состояний и повышения заболеваемости вирусными инфекциями. Для профилактики и лечения вирусных заболеваний следует включать препараты, оказывающие комплексное противовирусное, иммуномодулирующее и антистрессорное действие.
Мы предположили, что таким препаратом является высокомолекулярный гепарин (ВМГ), относящийся к классу гликозаминогликанов. ВМГ ингиби-рует инфицирование клеток многими разновидно-
стями вирусов, воздействуя на АТФ-азу и транскрипцию РНК в бактериальных клетках. Кроме того, ВМГ играет важную роль в воспалительных реакциях и иммунном ответе [5].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Настоящее исследование направлено на экспериментальную проверку гипотезы о возможности влияния высокомолекулярного гепарина на психоэмоциональные, поведенческие, когнитивные (познавательные) характеристики и функциональную активность нейтрофилов периферической крови крыс Вистар при курсовом введении в дозе ниже терапевтической.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проведены на самцах крыс аут-бредной линии Вистар с массой тела 250-280 г (n = 90), которых содержали в отдельных клетках группами по 10 особей. Опытная группа до обучения в многоальтернативном лабиринте получала ВМГ (фирма "Serva") в дозе 64 МЕ /кг (внутримышечно, 1 р/день, 5 сут.). Контролем служили интактные животные (ИК) и крысы, которым вводили 0,3 мл 0,9% физиологического раствора (ФР).
Для исследований функциональной активности нейтрофилов приготовляли мазки периферической крови, которые окрашивали по В.Е. Пигаревскому с соавт. [2]. Содержание лизосомально-катионных белков определяли полуколичественным методом, вычисляя средний цитохимический коэффициент.
Информационный стресс создавали в модельных условиях обучения в многоальтернативном лабиринте, где животные должны были по методике свободного выбора (без вмешательства экспериментатора) найти правило многократного получения пищи в течение опыта: после взятия пищи (семечки подсолнуха) в одной или двух кормушках из четырех, имеющихся в лабиринте, животные должны были самопроизвольно покинуть пищевую среду - выйти в свободное поле (не пищевую среду), для того чтобы, вновь зайдя в лабиринт, иметь возможность получить новую порцию корма в тех же кормушках. Регистрировали локомоторную активность, число заходов в лабиринт, количество подкреплений и ошибок, совершенных за опыт. Анализ психоэмоционального состояния крыс во время процесса обучения производили на основании подсчета безусловных реакций, которые затем подразделяли на активные и пассивные классы. Подробное описание поведенческой модели описано в ряде публикаций (Никольская К.А. с соавт., 1998). Обучение проводили ежедневно в течение 20 дней.
Регистрация и первичный анализ данных осуществлялись с помощью компьютерной программы "Labyrinth" [1]. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью статистического пакета "STATGRAF" для Windows 6.0. и "ANOVA", достоверность значений оценивали по критерию Колмогорова-Смирнова и /-критерию
