CC BY
32
УДК 615.45
Д. В. Королев, канд. техн. наук, заведующий научно-исследовательской лабораторией, И. С. Усков, лаборант-исследователь, Д. Л. Сонин, канд. мед. наук, ст. научный сотрудник, Ю. Н. Григорова, лаборант-исследователь,
М. М. Галагудза, д-р мед. наук, директор института экспериментальной медицины,
ФГБУ «Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В. А. Алмазова», ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова» В. Н. Постнов, канд. хим. наук, ст. научный сотрудник, Е. Б. Наумышева, канд. хим. наук, мл. научный сотрудник,
ФГБУ «Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В. А. Алмазова», ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»
Исследование острой токсичности, биораспределения и биоэлиминации наночастиц органокремнезема1
Ключевые слова: биораспределение, биоэлиминация, наночастицы, органокремнезем, синтез, токсичность. Key words: biodistribution, bioelimination, nanoparticles, organosilica, synthesis, toxicity.
Работа посвящена исследованию острой токсичности, биораспределения и биоэлиминации наночастиц органокремнезема с целью оценить возможность применения данного носителя для таргетной доставки лекарственных веществ. Синтезированы наночастицы средним размером 3,8 нм, представляющие собой трехмерносшитый полимер органокремнезема. Внутривенное введение наночастиц показало отсутствие их острой токсичности. Показано, что введенные в организм частицы подвергались быстрой биоэлиминации путем прохождения через почечный фильтр.
Введение
Сегодня наноразмерные носители находят все более широкое применение в диагностике и терапии различных заболеваний. Ранее авторами были изучены физико-химические свойства наночастиц кремнезема диаметром 6—13 нм, а также предложен способ пассивной и активной адресной доставки лекарственных препаратов в поврежденный миокард на их основе [1—3]. Однако неорганические кремнеземные наночастицы могут накапливаться в организме, а в некоторых случаях и вызывать негативные побочные эффекты [4]. Поэтому особый интерес представляют органические кремнеземные
1 Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ по государственной поддержке ведущих научных школ (НШ-2359.2012.7).
материалы, которые должны обладать повышенной способностью к биодеградации.
Методы синтеза подобных материалов доступны и изучены. Известны результаты проведения реакции переэтерификации и ацилирования 3-ами-нопропиллтриэтоксисилана и 2-(аминоэтил)-3-(три-метоксисилил)пропиламина [5]. На этом примере показана возможность получения линейных и гетероциклических кремнийсодержащих продуктов независимо от числа атомов азота в молекуле. Здесь же предложены схемы процессов, протекающих при использовании синтезированных соединений на начальных стадиях получения наноструктурных полимерных материалов. В другой работе [6] были синтезированы гибридные органо-неорганические субмикро- и наночастицы, содержащие протоноак-цепторные и протонодонорные группы и на примере фенилмочевинного производного силикатных частиц изучены различные подходы к формированию гибридных органосиликатных частиц.
Возможные области применения органосили-катных наночастиц также весьма разнообразны. В работе [7] исследованы механизмы захвата флуоресцентных тиол-органосиликатных наночастиц клетками пейеровых бляшек тонкой кишки, показана возможность адресной доставки вакцин с помощью органосиликатов, исследована зависимость степени поглощения наночастиц в зависимости от их размеров в широких пределах от 95 до 1050 нм. Работа [8] посвящена исследованию возможности применения органосиликатов с размерами наночастиц 50—250 нм в качестве люминесцентных материалов для визуализации биологических проб. При этом вопросы биосовместимости и биоэлиминации нано-
биотехносфера
| № 1(2S)/2CT3
22
Бионанотехнологии и биоматериаловедение
частиц органокремнезема остаются неизученными. Настоящая работа посвящена исследованию острой токсичности, биораспределения и биоэлиминации наночастиц органокремнезема с целью оценить возможность применения данного носителя для таргетной доставки лекарственных веществ.
Синтез наночастиц органокремнезема
Реакцию проводили в ацетоне (10 мл), предварительно растворяя в нем двукратный избыток янтарного ангидрида, затем добавляя 1 мл 3-ами-нопропилтриэтоксисилана, на перемешивающем устройстве ЪБ 110 (ЪО1Р, Россия) в течение 1 ч.
Рис. 1 \ Схема синтеза органокремнеземов
Затем добавляли 0,5 мл воды для гидролизации непрореагировавших этоксигрупп. Через 30 мин выпаривали весь ацетон и заливали 10 мл воды. Для удаления избытка янтарного ангидрида препарат очищали на колонке с сильноосновным ани-онитом АВ-18 в гравитационном режиме. В результате получали трехмерносшитый полимер органокремнезема. Схема синтеза показана на рис. 1. Содержание карбоксильных групп, определенное методом титрования, составило 3,01 ммоль/г.
Распределение наночастиц по размерам
Для определения размера наночастиц в приготовленных суспензиях использовали прибор Zetasizer Nano (Malvern Instruments, Великобритания) методом динамического рассеяния света (фотонная корреляционная спектроскопия) с использованием технологии неинвазивного обратного рассеяния. Результаты измерений приведены в табл. 1 и на рис. 2, 3.
Распределение наночастиц по интенсивности рассеяния является бимодальным, то есть в суспензии присутствуют две фракции со средними гидродинамическими диаметрами 3,839 и 2155,0 нм. По-видимому, второй пик связан с агрегацией небольшого количества органокремнезема. При пересчете распределения на объемное 100 % суспензии составляет фракция наночастиц размером 3,839 нм.
20
, 15
в н Н
10
100
80
40
20
10
100
Размер, нм
1000
0
10 000
К
р
w
р
60 s
в
н н« и
и о
Рис. 2
Распределение интенсивности рассеяния наночастиц органокремнезема по размерам: i I — интенсивность; - — нарастающий итог
5
0
1
Рис. 3
Распределение обьема наночастиц органокремнезема по размерам: i i — объем; - — нарастающий итог
№ 1(25)/2013~[
биотехносфера
Таблица 1 Размеры наночастиц органокремнезема
Параметр Номер пика
1 2
Гидродинамический диаметр, нм 3,839 2155,0
Интенсивность, % 41,0 59,0
Ширина пика, нм 0,8591 374,5
П р и м е ч а н и е. Точность измерения приведена для логарифмической шкалы.
Исследование гемодинамических эффектов при введении органокремнезема
Все эксперименты проводили на крысах самцах линии Wistar массой 250—300 г. Группа включала 5 животных. В качестве наркоза использовался хлоралгидрат в дозировке 480 мг/кг.
В ходе эксперимента осуществлялось внутривенное введение органокремнезема в физиологическом растворе в концентрации 16 мг/мл, что соответство-
вало концентрации исследованного ранее раствора аэросила А-380 с концентрацией 2 мг/мл [1, 2].
Инфузию проводили в количестве 1 мл в течение 10 мин три раза (I, II и III введение препарата).
Гемодинамический ответ на введение наноча-стиц в процессе эксперимента регистрировали в течение 2 мин в различных временных точках:
• за 2 мин до начала инфузии;
• в начале инфузии;
• после окончания инфузии;
• через 10 минут после окончания инфузии.
Гемодинамический ответ оценивали по следующим показателям:
• частота пульса;
• среднее артериальное давление (АД);
• систолическое АД;
• диастолическое АД;
• пульсовое АД.
Гемодинамические показатели, полученные в ходе эксперимента, приведены в табл. 2. Статистически значимые изменения анализируемых показателей не выявлены. Отсутствие изменения вариабельности сердечного ритма после введения препарата показаны на рис. 4.
Артериальное давление, мм рт. ст. 140
110
161:02
161:13
t, мин : с
Рис. 4 Отсутствие изменения вариабельности сердечного ритма после введения препарата
Таблица 2
Гемодинамические показатели, рассчитанные по результатам эксперимента
Время
Частота пульса,
Артериальное давление, мм рт. ст.
среднее
систолическое
диастолическое
пульсовое
За 2 мин до начала
361
I введение 106,0
119,0
92,0
27,0
Начало (2 мин)
364
114,0
124,0
97,7
26,3
После окончания (2 мин)
372
121,0
132,0
110,0
22,0
Через 10 мин (2 мин)
373
116,0
128,0
104,0
24,0
За 2 мин до начала
374
II введение 114,0
126,0
101,0
25,0
Начало (2 мин)
381
119,0
130,0
106,0
24,0
После окончания (2 мин)
390
125,0
136,0
114,0
22,0
Через 10 мин (2 мин)
391
124,0
135,0
111,0
24,0
За 2 мин до начала
422
III введение 132,0
161,0
116,0
45,0
Начало (2 мин)
427
131,0
167,0
115,0
52,0
После окончания (2 мин)
408
120,0
131,0
104,6
26,4
Через 10 мин (2 мин)
403
115,0
127,0
103,0
24,0
I № 1(25)/2013
биотехносфера
Бионанотехнологии и биоматериаловедение
Биораспределение и биоэлиминация органокремнезема
Для оценки биораспределения и динамики биоэлиминации органокремнезема проводилось внутривенное введение раствора наночастиц в физиологическом растворе в концентрации 16 мг/мл.
Инфузия раствора наночастиц проводилась в количестве 1 мл в течение 10 мин Затем была предусмотрена выдержка в течение 10 мин, 1, 3, 24 ч, 2, 3, 7 сут в зависимости от группы. В каждой группе было по 5 животных.
После этого животные выводились из эксперимента, у них забирали печень, сердце, почку, селезенку, головной мозг, легкое. Также была исследована контрольная группа животных для определения фонового содержания кремния в тканях. Забранные образцы тканей доводились до постоянной массы в сухожаровом шкафу при температуре 90 °С в течение 24 ч, затем измельчались до порошкообразного состояния и растворялись в серной кислоте. Анализ полученного сернокислого раствора на содержание кремния проводился атом-но-эмиссионным методом с индуктивно связанной плазмой по стандартной методике.
O,lOO
O,OBO
O,OOO
б
-Cl.
0
-О
0 20 40 б0 B0 100 120 140 1б0
Bpei^, ч
Рис. 5
Coдepжaнue кремния в mкaнях вo времени:
—О----печень; —— — сердце; —•--почки;
вoe удержание
— фoнo-
0,0б0
Si
0,040
O,O2O
0,000
0 20 40 б0 BO 100 120 140 1б0
Bpei^, ч
Рис. б
Coдepжaнue кремния в mкaнях вo времени:
—О----селезенка; — <<>— — легкие; —♦--мозг,
■ — фoнoвoe удержание
Данные по динамике изменения содержания кремния в различных органах показаны на рис. 5, 6. Обращает на себя внимание существенный прирост содержания кремния в почке через 10 и 60 мин после инфузии. Содержание кремния в других органах не отличалось от содержания в контрольной группе на протяжении всего эксперимента. Следовательно, использованные нано-частицы быстро выводятся из организма с мочой, проходя через почечный фильтр.
Выводы
В настоящей работе апробирована методика синтеза наночастиц органокремнезема, в результате применения которой были синтезированы частицы, имеющие средний размер 3,8 нм. Внутривенное введение данных частиц не сопровождается значимыми изменениями параметров системной гемодинамики, что свидетельствует об отсутствии острой токсичности. Введенные в организм частицы подвергаются быстрой биоэлиминации (в течение 1 ч) путем прохождения через почечный фильтр. Для дальнейшей оценки применимости на-ночастиц органокремнезема в качестве платформы для направленной доставки препаратов требуется исследование наночастиц большего диаметра.
Литература
1. Galagudza M. M., Korolev D. V., Sonin D. L. et al. Targeted drug delivery into reversibly injured myocardium with silica nanoparticles: surface functionalization, natural biodistribution, and acute toxicity // International Journal of Nano-medicine. 2010. N 5. P. 231-237.
2. Galagudza M., Korolev D., Sonin D. et al. Targeted drug delivery to ischemic heart with use of nanoparticulate carriers: Concepts, pitfalls and perspectives // Journal of Manufacturing Technology Management. 2010. Vol. 21, N 8. P. 930-949.
3. Galagudza M., Korolev D., Postnov V. et al. Passive targeting of ischemic-reperfused myocardium with adenosine-loaded silica nanoparticles // International Journal of Nanomedi-cine. 2012. N 7. P. 1671-1678.
4. Ivanov S., Zhuravsky S., Yukina G. et al. In Vivo Toxicity of Intravenously Administered Silica and Silicon Nanoparticles // Nanotoxicology. 2012. Vol. 5. Spec. Iss. Materials. P. 1873-1889.
5. Коробова E. А., Гаврилова А. В., Белова Л. О. и др. Кар-бофункциональные кремнийазотсодержащие органические соединения — исходное сырье в синтезе линейных и гетероциклических продуктов // Вестник МИТХТ. 2009. Т. 4, № 3. С. 64-69.
6. Горбачук Вл. В., Якимова Л. С., Мостовая О. А. и др.
Синтез гибридных органосиликатных частиц, содержащих протоноакцепторные (C(O), P(O)) и протонодонорные (NH) группы // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. 2010. Т. 152, кн. 1. С. 38-50.
7. Awaad А., Nakamura М., Ishimura К. Imaging of size-dependent uptake and identification of novel pathways in mouse Peyer's patches using fluorescent organosilica particles // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 2012. Vol. 8, N 5. P. 627-636.
8. Wang L., Estévez M.-C., O'Donoghue M. et al. Fluorophore-Free Luminescent Organosilica Nanoparticles // Langmuir. 2008. Vol. 24. P. 1635-1639.
№ 1(25)/20Ü~[
биотехносфера
