CC BY
22
УДК 632.4.01/.08
Журавлева А.С., Шагаев А.А., Горюнова О.Б., Марквичев Н.С.
ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ РАЗВИТИЯ FUSARIUM OXYSPORUMHA ЛЕГКО- И ТРУДНОДОСТУПНОМ СУБСТРАТАХ
Журавлева Александра Сергеевна, бакалавр 4-го курса факультета биотехнологии и промышленной экологии, email: sashka.zhuravliova@vandex.ru;
Шагаев Антон Александрович, аспирант 2-го курса факультета биотехнологии и промышленной экологии;
Горюнова Ольга Борисовна к.т.н., генеральный директор ООО «БИОМ-ПРО»;
Марквичев Николай Семёнович, к.т.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева;
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия
125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20.
Была изучена динамика роста при глубинном культивировании фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum на легко- и труднодоступных субстратах. Получены данные о накоплении биомассы в культуральной жидкости. Также было проведено сравнение микроморфологии гриба при развитии на разных источниках углерода. Сделаны выводы о возможном пути развития фитопатогена в прикорневой зоне в условиях отсутствия экссудации.
Ключевые слова: корневые экссудаты, катаболитная репрессия, ферментные системы.
STUDY OF THE PECULIARITIES OF FUSARIUM OXYSPORUM DEVELOPMENT ON EASY-AND HARD-TO-REACH SUBSTRATES
Zhuravleva A.S., Shagaev A.A, Goryunova O.B., Markvichev N.S.
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia.
The growth dynamics was studied during deep cultivation of the pathogenic fungus Fusarium oxysporum on easy- and hard-to-reach substrates. The data of biomass accumulation in the culture liquid were obtained. A comparison of the micromorphology of the fungus during development at different carbon sources was also made. Conclusions about a possible way of the development of a phytopathogen in the root zone in the absence of exudation were done. Key words: root exudates, catabolite repression, enzyme systems.
Известно, что растения могут выделять в окружающую среду различные вещества. Особенно интенсивно выделение происходит на корневых волосках, где установлен постоянный массообмен, причём такие метаболиты называют корневыми экссудатами. Экссудация - выделение соединений в ризосферу, включая сахара, органические кислоты, аминокислоты, вторичные метаболиты и структурные углеводы. Корневой экссудат участвует в ряде биотических взаимодействий с другими растениями, ризосферными микробами и абиотическими компонентами почвы. Экссудаты могут быть важным источником углерода для бактерий и грибов. Они могут также увеличивать доступность некоторых питательных веществ, таких как фосфор (посредством выделения фосфатаз и хелатирования выделенными органическими кислотами, которые при взаимодействии с фосфором образуют его более доступные для поглощения растений формы) [1].
Значительную часть корневых экссудатов составляют противомикробные вещества, которые требуются растению для защиты от патогенов. Часть соединений в определённой концентрации выделяются в ризосферу конститутивно вне зависимости от присутствия рядом посторонней микрофлоры. Также защитный механизм растения обладает индуцибельными низкомолекулярными антимикробными соединениями, называемыми фитоалексинами, которые не обнаруживаются в здоровых растениях. Среди часто встречающихся и хорошо изученных можно выделить такие вещества, как момилактон, транскоричную, розмариновую,
салициловую кислоты, жасмонат и их производные и т. д. Композиционные изменения в корневых экссудатах происходят не только в ответ на экзогенные факторы, но также контролируются эндогенно. Например, бензоксазиноиды выделяются при появлении боковых и коронных корней у кукурузы. Эти соединения регулируются генетически, являясь защитным химическим барьером для предотвращения атаки патогенов в местах, которые находятся на стадии развития и поэтому являются более восприимчивыми к фитопатогенам. Соответственно, пик экссудации защитных веществ наблюдется непосредственно перед цветением и на более поздних этапах жизненного цикла растения, о чем свидетельствует увеличенное количество предполагаемых антимикробных фенольных соединений в ризосфере. Примечательно, что фенольные метаболиты также эффективно привлекают некоторые почвенные микроорганизмы и могут благотворно влиять на «родное» почвенное микробное сообщество. Было также отмечено, что молекулы, такие как аминокислота канаванин, могут действовать как стимулятор для одной группы микроорганизмов, так и в качестве ингибитора многих других почвенных бактерий [2].
Таким образом растения могут влиять на состояние почвенной микрофлоры. Однако не только факт присутствия растения важен в формировании почвенных микробных сообществ, но и вид растения влияет на состав консорциума микроорганизмов, которые колонизируют корни. Микроорганизмы в ризосфере растений воздействуют на круговорот
питательных веществ в системе «почва-растение». Кроме того, метаболиты растений влияют на структуру сообщества ризосферных микроорганизмов в зависимости от возраста, на разных этапах развития растения состав почвенной микрофлоры может меняться [3].
Сообщества микроорганизмов, находящиеся в прикорневой зоне, также значительно влияют на растение. Некоторые ризосферные микроорганизмы увеличивают способность растений усваивать питательные вещества из почвы путем увеличения протяженности корня или солюбилизации макроэлементов, таких как фосфор или сера. Почвенные микроорганизмы также влияют на взаимодействия растений и патогенов, которые также развиваются на растительных метаболитах в зависимости от их состава и концентрации в нём веществ защитного действия [4].
Однако несмотря даже на слаженные механизмы защиты от патогенов и регулирования состава микробного сообщества в ризосфере, в период стресса растение может быть подвержено атаке фитопатогенов. Неблагоприятные факторы внешней среды могут привести к изменению интенсивности экссудации и даже к её прекращению, из-за чего микробы не подвержены влиянию фитоалексинов. К тому же исчезновение доступного источника углерода, содержащегося в экссудатах, может индуцировать синтез комплекса гидролаз для разрушения растительной ткани у фитопатогенов, таких как грибы рода Fusarium. Эти микромицеты не являются биотрофами, поэтому Fusarium spp. выделяют токсичные вещества, такие как дезоксиниваленол, ниваленол, зеараленон и др., чтобы растительная клетка погибла и гриб продолжил развиваться на мёртвой органике. Фузариозы -зачастую очень быстро развивающееся заболевание, приносящее большой вред выращиваемым культурам и, соответственно, урожаю [5].
Исходя из имеющейся информации была поставлена цель исследовать процесс потребления разных (более и менее доступных) источников углерода фитопатогеном Fusarium oxysporum и обнаружить возможные различия в развитии при культивировании in vitro.
Для этого было решено провести эксперимент по глубинному культивированию фитопатогена на разных источниках углерода. Объектом исследования являлся штамм микромицета Fusarium oxysporum F2106. Исследование основывается на построении кривых роста фитопатогена на разных источниках углерода, моделирующих развитие микроорганизма в условиях отсутствия легкодоступных источников углерода (экссудатов), а также с их добавлением. В качестве модели клеточной стенки растения рассматривали микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ), в роли легкодоступного источника углерода, входящего в состав корневых экссудатов, использовали фруктозу.
Культивирование проводили в колбе Эрленмейера на питательной среде следующего состава : 5 г/л
МКЦ, 0,5 г/л дрожжевого экстракта в фосфатном буфере рН 5,59. В соответствии с результатом эксперимента по нахождению фазы
логарифмического роста на 53 часе в питательную среду с МКЦ была внесена фруктоза в таком количестве, чтобы в итоге ее концентрация была 5 г/л. Контролем являлось культивирование гриба в питательной среде без добавления фруктозы. Кривые роста строились по результатам измерений концентрации спор и мицелия методом раститровок по Коху. Результаты представлены на рис. 1.
Полученные в ходе эксперимента данные о динамике роста Fusarium oxysporum показывают, что концентрация мицелия и спор на стационарной фазе развития при культивировании на фруктозе больше, чем на микрокристаллической целлюлозе на порядок. Кроме того, значительно отличаются скорости роста микромицета: скорость роста фитопатогена на целлюлозе составляла около 8*103 КОЕ/(мл*час), а на целлюлозе совместно с фруктозой - около 33*103 КОЕ/(мл*час). При этом после внесения фруктозы в культуральную жидкость не было зафиксировано видимой лаг-фазы как периода адаптации к новому источнику углерода, график сразу начинает расти.
Кроме этого, были зафиксированы данные о различиях в микроморфологии фитопатогена в ходе похожего эксперимента.Fusarium oxysporum культивировали в 1 л жидкой питательной среды на целлюлозе (1 г/л дрожжевого экстракта, 0,5 г/л МКЦ на фосфатном буфере рН 5,59) и на глюкозе (1 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л глюкозы на фосфатном буфере рН 5,59). Микроскопия показывала, что несмотря на более интенсивный рост гриба на глюкозе, конидии быстрее образовывались в среде с целлюлозой. Кроме того, уже на 45м часе культивирования на МКЦ появились конидии и гифы с крупными включениями, а на 165 часе было большое количество хламидоспор. При культивировании на глюкозе конидий с крупными включениями было обнаружено значительно меньше, включения в гифах появляются в основном на 68м часе, а количество хламидоспор было значительно меньше, чем при росте на МКЦ, и относительно большое их количество появилось к 190му часу. Сравнение микроморфологии представлено на рис. 2 иЗ.
?sooooo
3 7ÜOOÜOO
§
« 1500000
S
I* 1ÜÜÜ00Ü
I
о
* SOOÖOO
о
О 20
Рис. 1. Сравнение кривых роста Fusarium oxysporum при культивировании на МКЦ и МКЦ с добавлением фруктозы
Вр»ЕЯ, Ч
100 120 1410
* мнц*фрунтозл
н. <
Ж
V4
Ш-
> ы
к >>-
/
}
*
т
.N -
- г
Рис. 2, 3. Сравнение микроморфологии Fusarium oxysporum, выращенном на глюкозе (слева) и на МКЦ (справа). 165
час культивирования, увеличение 400х
Исходя из полученных данных можно сделать вывод, что легкодоступность субстрата способствует большему накоплению биомассы, поэтому не исключено, что при нормальной экссудации концентрация резистентных к растительным антимикробным соединениям фитопатогенов может значительно увеличиваться. Это опасно при наступлении неблагоприятных для растения условий: в отсутствие легкодоступного источника углерода, содержащегося в экссудатах, микроорганизмы согласно явлению катаболитной репрессии начнут потреблять оставшийся субстрат, которым является растительная ткань. Как показывает эксперимент, Fusarium oxysporum может расти на целлюлозе, что происходит благодаря целлюлазному комплексу. Однако стоит заметить, что лаг-фаза при росте на МКЦ значительно продолжительнее, нежели на легкодоступных источниках углерода. Кроме всего, раннее появление большого количества включений, возможно, запасаемых веществ, и хламидоспор указывают на то, что потребление целлюлозы для данного штамма фитопатогена является неблагоприятным условием.
Список литературы
1. Lilia Cavaglieri, Julieta Orlando, Miriam Etcheverry Rhizosphere microbial community structure at different maize plant growth stages and root locations//Microbiological Research. - 2009. - 164. - P. 391—399
2. S.D. Siciliano, C.M. Theoret, J.R. de Freitas, P.J. Hucl, and J.J. Germida Differences in the microbial communities associated with the roots of different cultivars of canola and wheat//Canadian Journal of Microbiology. - 1998. - 44(9). - P. 844-851
3. Ulrike Baetz, Enrico Martinoia Root exudates: the hidden part of plant defense//Trends in Plant Science. -2014. - Vol. 19. - №. 2. - Р. 90-98
4. Catherine Preece, Josep Penuelas A Return to the Wild: Root Exudates and Food Security//Trends in Plant Science. - 2019
5. J.M. Wagacha, J.W. Muthomi Fusarium culmorum: Infection process, mechanisms of mycotoxin production and their role in pathogenesis in wheat//Crop Protection. - 2007. - 26. - P. 877-885.
