CC BY
50
№ 4 - 2013 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки
УДК 615.273.55.015.4-076.9
ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ БИОДОСТУПНОСТИ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ТРОМБОВАЗИМ ИЗ ТОЩЕЙ КИШКИ КРЫС
12 3
К. И. Ершов ' , А. А. Серяпина
1ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава
России (г. Новосибирск) 2ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН (г. Новосибирск)
3 ^
ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологий» (г. Новосибирск)
Целью данного исследования явилось изучение особенности всасывания препарата Тромбовазим из просвета тощей кишки крыс Wistar в систему кровь-лимфа. В работе использован метод инкубации (in situ) препарата, меченного FITC, в просвете дистального отдела тощей кишки. Установлено, что основной путь абсорбции Тромбовазима направлен в кровеносное русло (223,81 ± 129,83 mE/мл, p < 0,05). Также обнаружено, что Тромбовазим проникает в лимфатическую систему (19,47 ± 2,33 mE/мл, p < 0,05).
Ключевые слова: биодоступность, Тромбовазим, тощая кишка, всасывание, пегелирование, лимфа.
Ершов Константин Игоревич — кандидат биологических наук, ассистент кафедры фармакологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», старший научный сотрудник лаборатории лимфотропной терапии и лимфодиагностики ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН, e-mail: ershov_k@bk.ru
Серяпина Алиса Алексеевна — инженер-химик ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологий», e-mail: 1broadsword@mail.ru
Введение. Создание перорально доступных белковых препаратов и разработка систем их доставки длительное время являлось и остается постоянным вызовом фармакологам. В клинической практике используется много лекарственных препаратов белковой природы, которые применяются преимущественно парентерально ввиду их низкой биодоступности при энтеральном приёме.Парентеральный путь введения традиционный и, с одной стороны, не вызывает много проблем, но, с другой стороны, возможности энтерального приёма медикаментов отличаются лучшей восприимчивостью для пациента, меньшим количеством осложнений. Проблема низкой энтеральной биодоступности белковых лекарственных средствобъясняется рядом физико-химических
свойств самих белков, в том числе большим размером молекул, восприимчивостью к ферментативной деградации, коротким периодом полужизни в плазме крови, ионной проницаемостью, иммуногенностью, склонностью к агрегации, адсорбции и денатурации [5]. Кроме того, существует несколько физиологических переменных, которые также влияют на пероральную доставку белковых и пептидных препаратов — интенсивность опорожнения желудка, транзитное время, присутствие пищи, широкий диапазон изменения рН (1-8) в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), пищеварительные ферменты, кишечная микрофлора и эпителиальный транспорт. Установлено, что абсолютный уровень пероральной биодоступности большинства белков не более 1 %.
Всасывание белковых препаратов через ворсинки кишки может происходить либо в лимфатическую систему, либо в венулы. Определение и/или модуляция этого пути всасывания представляет огромный интерес для развития новых подходов пероральной доставки белков. Заинтересованность в проникновении препаратов в лимфу объясняется тем, что абсорбированный в лимфатическое русло фармакологический агент обходит первичный печеночный метаболизм, которому подвергаются препараты при всасывании из кишечника в кровь. Тем самым биодоступность лекарственного препарата повышается при попадании в лимфу [6].
В данной работе мы сосредоточили свое внимание на особенностях всасывания отечественного препарата Тромбовазим, который представляет собой фармакологическую композицию двух субтилизиновых протеиназ (сериновой и металлопротеиназы) с молекулярной массой 29 кДа, иммобилизованных посредством электронно-лучевого пегилирования. Как было сказано выше, нативные белковые молекулы обладают низкой биодоступностью. Электронно-лучевое пегилирование белковой молекулы повышает её гидрофильность и способствует защите от ферментативного расщепления в ЖКТ, тем самым увеличивая биодоступность при пероральном приёме.
Цель исследования — определить особенности всасывания иммобилизованных посредством электронно-лучевого пегилирования субтилизиновых протеиназ (Тромбовазим) из просвета тощей кишки крыс Wistar в систему кровь-лимфа.
Методы исследования. Наиболее удобным способом оценки всасывания белковых препаратов являются флуоресцентные методы исследования. Изотиоцианат флуоресцеина ^ГГС) нашел широкое применение в биологии и медицине для создания меток на молекулах пептидов, гормональных белков, ферментов и антител. С помощью этой универсальной метки можно изучить процесс проникновения лекарственных препаратов через ЖКТ. В данной работе перед нами стояла задача экспериментально определить пути транспорта через тощую кишку крыс Wistar протеиназ, меченных FГTC, входящих в состав препарата Тромбовазим, что играет важную роль для уточнения особенностей фармакокинетики препарата.
В работе использовали 20 крыс-самцов Wistar в возрасте 6 месяцев. Все животные содержались при естественном освещении на стандартном рационе при свободном доступе к корму и воде.
Для исследования особенностей пути всасывания Тромбовазима у крыс животным под инъекционным наркозом (смесь ксилозина и золетила) после срединной лапаротомии в дистальном отделе тощей кишки с двух сторон фиксировали трубки (входящая, выходящая) для растворов. Длина выбранного фрагмента тощей кишки составляла 15 см, далее просвет промывали физиологическим раствором для удаления химуса и зашивали брюшную полость.
Перед инкубированием растворов в кишке повышали базальную температуру крысы с 34 до 37 °С путем нагревания тела крысы струей теплого воздуха [2].
Для перфузии использовали фосфатно-солевой буфер (ФСБ) c активностью Тромбовазима 0,1 Ед/мл (pH 7,4). После инкубации в тощей кишке в течение 1 ч при постоянной температуре 37,7 ± 1,0 °С из цистерны грудного протока набирали лимфу [3], забор крови осуществлялся из v. mesenterica(непосредственно прилегающей к тощей кишке, где осуществлялась инкубация раствора). Вышеперечисленные биологические жидкости набирали в присутствии гепарина, в дальнейшем их центрифугировали 10 мин на 3000 об./мин, отбирали надосадок и измеряли флуоресценцию на спектрофлуориметре F-3000 (Hitachi, Япония).
Также меченный препарат экстрагировали из прилегающей к области инкубации интерстициальной жидкости кишечника, слизистый слой которого был удален, и из паренхимы лимфатических узлов I порядка. Для этого фрагменты ткани выдерживали в течение суток в ФСБ при 4 °С, далее центрифугировали раствор, чтобы отделить его от остатков ткани и форменных элементов. В надосадочной жидкости определяли флуоресценцию с учетом изначальной массы образца ткани и процента содержащейся в нем воды [1]. В качестве контроля и для установления уровня автофлуоресценции в работе была использована группа интактных крыс (10 животных), с которыми проводили аналогичные хирургические манипуляции, но в качестве раствора для инкубации использовали только ФСБ.
От полученных значений по флуоресценции биологических жидкостей отнимали показатели автофлуоресценции (контрольная группа). Далее количество препарата определялось по калибровочным кривым.
Выведение животных из опыта проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 № 755).
Статистическая обработка результатов включала подсчет среднеарифметических значений (М) и их ошибки (m). Для выявления достоверности полученных значений применяли тест множественных сравнений Дункана (Duncan's test, ANOVA). В работе использовали пакет компьютерных программ STATISTICA (версия 6.0). Различия считали достоверными при p < 0,05.
Результаты исследования. При исследовании всасывания in situ установлено, что меченный Тромбовазим через 60 мин после начала инкубации в тощей кишке в основном детектируется в плазме крови (рис. 1), а не в лимфе (p < 0,01). Концентрация препарата в плазме крови из v. mesenterica в 10 раз выше, чем в лимфе из цистерны грудного протока.
Нас также интересовал уровень содержания меченного препарата в межклеточной жидкости. Концентрация Тромбовазима в межклеточной жидкости тощей кишки и в паренхиме узлов I порядка статистически не отличаются (рис. 2). Обнаружение протеиназ меченных FITC в лимфоузлах является дополнительным подтверждением пути всасывания препарата в лимфу. Таким образом, нами выявлено, что субтилиназы всасываются из дистального отдела тощей кишки как в системный кровоток, так и лимфатическое русло.
Рис. 1. Особенности всасывания и распределения Тромбовазима, меченного FITC, в биологических жидкостях; * — p < 0,05 отличия между биологическими жидкостями
Рис. 2. Содержание Тромбовазима в межклеточной жидкости кишки и в паренхиме
лимфатических узлов
Концентрация меченного Тромбовазима в межклеточной жидкости тощей кишки, лимфатических узлах и лимфе демонстрирует процесс поступления в лимфатическое русло,что является, на наш взгляд, объяснением колоколообразного типа фармакокинетической кривой, установленной в доклинических исследованиях этого лекарственного препарата [4].
Выводы
1. Установлено, что основной путь всасывания Тромбовазима из просвета тощей кишки направлен в кровеносное русло.
2. В исследовании установлено, что в межклеточной жидкости тканей тощей кишки и в паренхиме лимфатических узлов I порядка после 1 ч инкубации содержание Тромбовазима составило 10,60 ± 5,65 тЕд/мг.
3. Выявлено, что субтилиназы, меченные FITC, проникают также из просвета тощей кишки в лимфатическую систему. Лимфа, извлеченная из цистерны грудного протока, содержала 19,27 ± 2,33 тЕд.
Список литературы
1. Гареев Р. А. Методики исследования гематолимфатического обмена / Р. А. Гареев, И. Б. Беклемишев. — Алма-Ата : Галым, 1991. — 134 с.
2. Исследование пути всасывания флуоресцеина из тощей кишки крыс Wistar в систему «кровь-лимфа» / К. И. Ершов, В. В. Асташов, О. В. Казаков [и др.] // Вестн. Новосибирского государственного университета. Серия : Биология, клиническая медицина. — 2012. — Т. 10, вып. 4. — С. 41-46.
3. Кузнецов А. В. Новый способ забора лимфы у животных / А. В. Кузнецов // Бюл. эксперим. биологии. — 1993. — № 9. — С. 329-331.
4. Антитромботический и тромболитический эффекты нового отечественного протеолитического препарата Тромбовазима / М. Б. Плотников [и др.] // Бюл. эксперим. биологогии. — 2009. — Т. 147, № 4. — С. 418-421.
5. Emerging trends in oral delivery of peptide and protein drugs / R. I. Mahato, A. S. Narang, L. Thoma, D. D. Miller // Therapeutic Drug Carrier Systems. — 2003. — Vol. 20 (2&3). — P. 153-214.
6. O'Driscoll C. M. Lipid-based formulations for intestinal lymphatic delivery / C. M. O'Driscoll // Eur. J. Pharm. Sci. — 2002. — Vol. 15 (5). — P. 405-415.
RESEARCH OF FEATURES OF BIOAVAILABILITY OF FERMENT PREPARATION TROMBOVAZIM IN JEJUNUM OF RATS
12 3
K. I. Ershov ' , A. A. Seryapina
1SBEIHPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health» (Novosibirsk c.)
2FSBE «Novosibirsk scientific research institute of clinical and experimental lymphology»
SB RAMS (Novosibirsk c.)
CJSC «Siberian Center of Pharmacology and Biotechnologies» (Novosibirsk c.)
The objective of the research was studying the feature of Trombovazim absorption from a lumen of jejunum at Wistar rats in system blood lymph. The method of incubation (in situ) of preparation, labeled FITC, in lumen of distal department of jejunum is used in the work. It is established that the main way of Trombovazim absorption is referred to the vascular course (223,81 ± 129,83 mE/ml, p < 0,05). It is also revealed that Trombovazim gets into lymphatic system (19,47 ± 2,33 mE/ml, p < 0,05).
Keywords: bioavailability, Trombovazim, jejunum, absorption, pegylation, lymph.
About authors:
Ershov Konstantin Igorevich — candidate of biological sciences, assistant of pharmacology chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», senior research associate of lymphotropic therapy and lymphodiagnostic laboratory at FSBE«Novosibirsk scientific research institute of clinical and experimental lymphology» SB RAMS, e-mail: ershov_k@bk.ru
Seryapina Alisa Alekseevna — chemical engineer at CJSC «Siberian Center of Pharmacology and Biotechnologies», e-mail: 1broadsword@mail.ru
List of the Literature:
1. Gareyev R. A. Techniques of research of hematolymphatic exchange / R. A. Gareyev, I. B. Beklemishev. — Alma-Ata: Galym, 1991. — 134 P.
2. Research of way of absorption of fluoresceine from jejunum of Wistar rats in blood lymph system / K. I. Ershov, V. V. Astashov, O. V. Kazakov [etc.] // Bull. Novosibirsk state university. Series: Biology, clinical medicine. — 2012. — V. 10, Iss. 4. — P. 41-46.
3. Kuznetsov A. V. New way of fence of lymph at animals / A. V. Kuznetsov // Bulletin the exper. biology. — 1993. — № 9. — P. 329-331.
4. Antithrombotic and thrombolytic effects of new domestic proteolytic preparation of Trombovazim / M. B. Carpenters [etc.] // Bulletin the experim. Biology. — 2009. — V. 147, № 4. — P. 418-421.
5. Emerging trends in oral delivery of peptide and protein drugs / R. I. Mahato, A. S. Narang, L. Thoma, D. D. Miller // Therapeutic Drug Carrier Systems. — 2003. — Vol. 20 (2&3). — P. 153-214.
6. O'Driscoll C. M. Lipid-based formulations for intestinal lymphatic delivery / C. M. O'Driscoll // Eur. J. Pharm. Sci. — 2002. — Vol. 15 (5). — P. 405-415.
