CC BY
84
№ 4 - 2013 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки
УДК 615.014.47:577.112.7
ЭЛЕКТРОННО-ЛУЧЕВАЯ МОДИФИКАЦИЯ ПРЕПАРАТОВ БЕЛКОВОЙ ПРИРОДЫ ДЛЯ
УЛУЧШЕНИЯ ИХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ
СВОЙСТВ
12 12 1 1 1 П. Г. Мадонов ' , К. И. Ершов ' , А. В. Дубровин , Е. Н. Заполоцкий , П. Н. Мирошников ,
М. А. Шилова1, Д. Н. Киншт1'2 1ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологий» (г. Новосибирск)
2
ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава
России (г. Новосибирск)
Целью данного исследования являлось изучение фармакологических композиций, созданных с помощью технологии электронно-лучевого пегилирования гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), и гиалуронат-эндо-P-N-
ацетилгексозаминидазы при разных путях введения препаратов. Исследовали динамику содержания препаратов в крови и конфокальные снимки в тканях. Установлено, что исследуемые препараты демонстрируют высокую биодоступность при пероральном, ректальном и ингаляционном способах введения.
Ключевые слова: биодоступность, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гиалуронат-эндо-Р-Ы-ацетилгексозаминидаза, парентеральное введение, пегилирование.
Мадонов Павел Геннадьевич — доктор медицинских наук, заместитель директора по науке ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологий»; доцент кафедры педиатрии ФПК и 1111В ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 223-67-21, e-mail: madonov@scpb.ru
Ершов Константин Игоревич — кандидат биологических наук, заведующий лабораторией физиологии энтерального транспорта ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологий», ассистент кафедры фармакологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 226-19-25
Дубровин Андрей Владимирович — инженер-химик ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологий», e-mail: madonov@scpb.ru
Заполоцкий Евгений Николаевич — инженер-химик ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологий», e-mail: madonov@scpb.ru
Мирошников Павел Николаевич — заведующий химико-аналитическим отделом ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологий», e-mail: madonov@scpb.ru
Шилова Маргарита Анатольевна — инженер-химик ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологий», e-mail: madonov@scpb.ru
Киншт Дмитрий Николаевич — кандидат медицинских наук, заведующий информационно-аналитическим отделом ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологий», ассистент кафедры анестезиологии и реаниматологии ФПК и 1111В ГБОУ «Новосибирский государственный медицинский университет», e-mail: kin2@ngs.ru
Введение. Большинство лекарственных препаратов белковой природы в клинической практике применяются преимущественно парентерально в виду их низкой биодоступности при энтеральном приёме. Такими препаратами, например, являются гранулоцитарный колониеститмулирующий фактор (Г-КСФ) и гиалуронат-эндо-Р-Ы-ацетилгексозаминидаза (ГА), их фармакологические свойства хорошо изучены. В настоящий момент лекарственные препараты Г-КСФ и ГА широко представлены на рынке, и все они имеют инъекционный способ введения. Наряду с выраженными положительными свойствами, Г-КСФ и ГА обладают рядом нежелательных побочных эффектов [4]. Для их устранения эффективно использовать модификации биологически активных веществ путем их соединения с низкомолекулярными носителями [1, 2]. Так, в мировой практике успешно применяется технология химического пегилирования цитокина, которая обеспечивает не только лучшую переносимость, но и уменьшение кратности введения в организм посредством инъекций. Нами была поставлена задача синтезировать принципиально новые фармакологические композиции Г-КСФ и ГА с полиэтиленгликолем (ПЭГ) для создания наиболее комплаентных для пациента лекарственных форм и исследовать их фармакологические свойства. Для этих целей была использована технология электронно-лучевого пегилирования, принципиально отличающаяся от химического.
Цель исследования — изучить динамику содержания пэгилированных Г-КСФ и ГА (ПЭГ-Г-КСФ и ПЭГ-ГА) в крови при различных путях введения препаратов.
Материалы и методы. Для исследования фармакологических свойств модифицированных препаратов были выбраны композиция рчГ-КСФ с ПЭГ1500 и ГА с ПЭГ1500. Конъюгаты с ПЭГ получены посредством воздействия потока ускоренных электронов с энергией 2,5 МэВ, поглощенной дозой от 2 до 10 кГр и скоростью набора дозы 1,65 кГр/ч. Факт образования принципиально новых веществ — конъюгата ПЭГ-Г-КСФ и ПЭГ-ГА был установлен с помощью метода SEC-HPLC-хроматографии и ББЗ-ПААГ электрофореза.
Эксперимент по изучению фармакокинетики ПЭГ-Г-КСФ проведен на 160-ти мышах-самцах линии СВА/CaLac массой 18-20 г в возрасте 2-х месяцев. Животные, конвенциональные линейные мыши 1 -й категории, получены из питомника ГУ «НИИ фармакологии» ТНЦ СО.
Для изучения динамики содержания ПЭГ-Г-КСФ в сыворотке крови препарат вводили однократно внутривенно, подкожно, внутрижелудочно и ректально в дозировке 100 мкг/кг. Пробы крови у мышей отбирали методом декапитации через 0,17; 0,5; 1; 3; 5; 7; 12 и 24 ч после введения.
Исследование конъюгата ПЭГ-ГА проведено на 150-ти конвенциональных аутбредных крысах-самцах со средней массой тела 300 г стока CD разводки отдела экспериментальных биологических моделей ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН. Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986).
Иммобилизованную ПЭГ-ГА, предварительно меченную флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ), вводили животным однократно в дозе 300 ЕД/кг. Для исследования фармакокинетики препарат вводили однократно внутрижелудочно и болюсно внутривенно. Пробы крови у крыс отбирали до введения препарата и через 0,25; 0,5; 1; 2; 3; 5 и 7 ч после введения. Кровь отбирали через катетер из бедренной артерии у животных, находящихся под эфирным наркозом. Полученные образцы крови помещались в гепаринизированные пробирки и центрифугировались при 3000 об/мин в течение 10 мин, отбирали надосадок и измеряли флуоресценцию на спектрофлуориметре F-3000 (Hitachi, Япония).
Расчет фармакокинетических параметров проводили модельно независимым методом статистических моментов с помощью программного обеспечения M-Ind.
Для демонстрации биодоступности препарата ПЭГ-ГА при парентеральном способе введения проводился эксперимент с инкубацией раствора препарата в тощей кишке [3] и при ингаляционном способе введения. После 30 мин инкубации ПЭГ-ГА меченного ФИТЦ производился забор фрагментов тощей кишки и легких, материал фиксировали в течение 40 мин в 4 % формалине при +4 °С, промывали в растворе фосфатно-солевого буфера и замораживали при -20 °С. Затем фрагменты ткани нарезали на криостате. Дальнейшие исследования проводили на приборе LSM 510 META (Zeiss, Германия) методом конфокальной микроскопии с использованием фильтров BP 505-530, LP 615.
Результаты исследования и их обсуждение. Абсолютная биологическая доступность (F) препаратов при изучаемых путях введения рассчитывалась по формуле:
F = AUCt/AUCp х 100 %,
где AUCt — площадь под фармакокинетической кривой при внутривенном введении препарата, а AUCp — площадь под фармакокинетической кривой в сыворотке при изучаемом пути введения.
Наиболее существенная биодоступность ПЭГ-Г-КСФ при указанных путях введения наблюдается при подкожном использовании препарата — 79,5 % (рис. 1). Подкожное введение ПЭГ-Г-КСФ, по данным исследования, является наиболее адекватной альтернативой внутривенного введения за исключением параметра Tmax, значение которого составляет 1 ч. Величины остальных параметров — период полувыведения, клиренс, площадь под фармакокинетической кривой — либо соответствуют, либо приближаются к таковым при внутривенном введении препарата.
ё а
о
зооо
250 D
2Q0Ü
I50Ü
I0OC
J0Ü
1 1 г 1
1
! г 1 1 ( =ч
к 1 1 1 1 1
к ¡V... 1 1 ■ * -■ '
А т.... .........
10
—• ш ПЭГ-Г-КСФ i/v ■ * " ПЭГ-Г-КСФ р*
15
Эр»^ ч
■■ ггаг.г.ксФ р/о
— рчГ-КСФ^
20
2J 30
- ПЭГ-Г-КСФ tic
Рис. 1. Фармакокинетические профили ПЭГ-Г-КСФ в сыворотке крови мышей после однократного введения: i/v — внутривенное введение; p/o — внутрижелудочное; s/c —
подкожное; p/r — ректальное введение
При пероральном введении биодоступность составляет 4,3 %, что значительно превышает биодоступность нативных белков, которая, по данным R. I. Mahato [5], не превышает 1 %.
При ректальном введении ПЭГ-Г-КСФ достаточно быстро попадает в системный кровоток ТШах — 1 ч, при этом максимальная концентрация (Cmax) достигает значения 2400 пг (что сопоставимо с максимальными значениями при внутривенном введении препарата) и относительно (по сравнению с внутрижелудочным введением) длительно циркулирует в крови. Так, концентрация препарата при данном способе введения к 5-му часу снижалась до исходного уровня (Т1/2 = 3,3 ч). При этом значение F составляло 32,1 %.
Таким образом, полученные данные однозначно свидетельствуют о перспективности энтерального способа назначения ПЭГ-Г-КСФ, альтернативного парентеральному применению. При обсуждении вопроса о перспективности создания энтеральной формы Г-КСФ становится очевидно, что использование ПЭГ-Г-КСФ путем его введения per rectum обеспечивает значительно более существенное, чем per os, всасывание препарата в кровь. Также следует сказать, что полученные результаты указывают на возможность получения приемлемой лекарственной формы для использования per os посредством повышения биодоступности за счёт использования ПЭГ-Г-КСФ в кишечнорастворимых капсулах.
В ходе исследований иммобилизованной ПЭГ-ГА установлено, что при внутривенном введении препарата значение площади под фармакокинетической кривой (AUCt) составило 777,48 мкг*ч/мл, а при внутрижелудочном введении (AUCp) 367,3 мкг*ч/мл. Таким образом, абсолютная биодоступность для меченой ПЭГ-Г составила 47,2 %. Максимальные концентрации препарата (Ттах) в плазме крови при per os введении достигаются к 2-м чесам, что указывает на достаточно быстрое всасывание иммобилизированного препарата через эпителий желудочно-кишечного тракта с высокой биодоступностью.
Снимки, полученные с помощью конфокальной микроскопии (эксперимент in situ), позволяют получить наглядное представление о степени и особенностях абсорбции препарата (рис. 2). Слабая автофлуоресценция отмечается по всей длине ворсин слизистой оболочки в зеленом спектре после контрольной инкубации с фосфатно-солевым буфером (рис. 2А). ФИТЦ обеспечивает зеленое свечение меченных им препаратов ГА. Так, при инкубации обычной нативной Г, меченной FITC, видна адсорбция лишь на апикальном полюсе кишечных ворсин (рис. 2Б), в то время как пегилированный препарат активно адсорбируется на всей поверхности кишечной ворсины (рис. 2В), что указывает на более выраженную биодоступность конъюгата.
Рис. 2. Конфокальные снимки после 30 мин инкубации растворов в тонкой кишке крыс: А — фосфатно-солевой буфер; Б — нативная ГА, меченная ФИТЦ; В — конъюгат ПЭГ-
ГА с ФИТЦ
Также мы изучали ингаляционный способ введения ПЭГ-ГА. Животное в течение 30 мин вдыхало дисперсионно распыленный небулайзером препарат. В результате на конфокальных снимках контрольных крыс, которые вдыхали дисперсию на основе фосфатно-солевого буфера в альвеолярных мешочках, обнаруживается слабая зеленая автофлуоресценция (рис. 3А), а в бронхиолах отмечается ее лишь следовое присутствие (рис. 4А). После ингаляционного способа введения крысам ПЭГ-ГА на конфокальных снимках легких видны альвеолярные мешочки с флуоресценцией выше фоновой (рис. 3Б), что свидетельствует об абсорбции препарата из дисперсионной газовой среды в кровь. На рис. 4Б заметно сильное зеленое свечение на эпителии бронхиол после ингаляции препарата. Следовательно, абсорбция препарата при таком способе введения способна происходить как непосредственно через альвеолярные мешочки легких, так и через эпителиальную оболочку бронхиального древа.
Б
Рис. 3. Альвеолярные мешочки крыс после 30 мин ингаляции А — фосфатно-солевой
буфер; Б — конъюгат ПЭГ-ГА с ФИТЦ
Рис. 4. Бронхиолы крыс после ингаляции А — фосфатно-солевой буфер; Б — конъюгат
ПЭГ-ГА с ФИТЦ
Выводы
1. В ходе исследования установлено, что абсолютная биологическая доступность ПЭГ-ГКСФ составляет: 79,5; 4,3 и 32,1 % при подкожном, внутрижелудочном и ректальном введениях соответственно.
2. При введении per os ПЭГ-ГА максимальная концентрация препарата (Tmax) в плазме крови достигается к 2-м часам, и абсолютная биодоступность препарата составляет 47,2 %.
3. ПЭГ-ГА активно абсорбируется на всей поверхности кишечной ворсины. При ингаляционном введении препарата ПЭГ-ГА обладает выраженной биодоступностью как через альвеолярные мешочки легких, так и через эпителиальную оболочку бронхиального дерева.
4. Пегилирование фармакологически активных белковых молекул посредством применения электронно-лучевой технологии позволяет создать конъюгаты с модифицированными фармакокинетическими свойствами — прежде всего
с достаточно высокой степенью энтеральной биодоступности. Это позволит использовать их более широко в педиатрической практике за счёт снижения дозы введения и их токсических эффектов.
Списоклитературы
1. Фармакологические свойства пегилированного с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гранулоцитарного колониестимулирующего фактора / А. М. Дыгай [и др.] // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2011. — № 3. — С. 146-150.
2. Гепатопротекторные эффекты иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы и механизмы их развития / А. М. Дыгай [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 2011. — Т. 151, № 1. — С. 86-88.
3. Исследование пути всасывания флуоресцеина из тощей кишки крыс Wistar в систему «кровь-лимфа» / К. И. Ершов, В. В. Асташов, О. В. Казаков [и др.] // Вестн. Новосибирского государственного университета. Серия : Биология, клиническая медицина. — 2012. — Т. 10, вып. 4. — С. 41-46.
4. Anderson J. A. Allergic reactions to drugs and biological agents / J. A. Anderson // JAMA. — 1992. — Vol. 268 (20). — P. 2844-57.
5. Emerging trends in oral delivery of peptide and protein drugs / R. I. Mahato, A. S. Narang, L. Thoma, D. D. Miller // Therapeutic Drug Carrier Systems. — 2003. — Vol. 20 (2&3). — P. 153-214.
ELECTRON-BEAM MODIFICATION OF PREPARATIONS OF THE ALBUMINOUS NATURE FOR IMPROVEMENT OF THEIR PHARMACOLOGICAL PROPERTIES
P. G. Madonov1,2, K. I. Ershov1,2, А. V. Dubrovin1, Е. N. Zapolotsky1, P. N. Miroshnikov1,
М. А. Shilova1, D. N. Kinsht1,2
1CJSC «Siberian Center of Pharmacology and Biotechnologies» (Novosibirsk c.)
2SBEIHPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health» (Novosibirsk c.)
The objective of the research was studying the pharmacological compositions created by means of technology of electron beam pegylation of granulocytic colony stimulating factor (G-CSF) and hyaluronate -endo-P-N-acetylhexosaminedase at different ways of introduction of preparations. Dynamics of preparation content in bloods and confocal pictures in tissues was investigated. It is established that investigated preparations demonstrate high bioavailability at peroral, rectal and inhalation ways of introduction.
Keywords: bioavailability, granulocytic colony stimulating factor, hyaluronate -endo-ß-N-acetylhexosaminedase, parenteral introduction, pegylation.
About authors:
Madonov Pavel Gennadevich — doctor of medical sciences, deputy director on science at CJSC «Siberian Center of Pharmacology and Biotechnologies»; assistant professor of pediatrics chair of FAT and PDD at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 223-67-21, e-mail: madonov@scpb.ru
Ershov Konstantin Igorevich — candidate of biological sciences, head of laboratory of enteral transport physiology at CJSC «Siberian Center of Pharmacology and Biotechnologies», assistant of pharmacology chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 226-19-25
Dubrovin Andrey Vladimirovich — chemical engineer at CJSC «Siberian Center of Pharmacology and Biotechnologies», e-mail: madonov@scpb.ru
Zapolotsky Evgeny Nikolaevich — chemical engineer at CJSC «Siberian Center of Pharmacology and Biotechnologies», e-mail: madonov@scpb.ru
Miroshnikov Pavel Nikolaevich — head of chemical analysis department at CJSC «Siberian Center of Pharmacology and Biotechnologies», e-mail: madonov@scpb.ru
Shilova Margarita Anatolyevna — chemical engineer at CJSC «Siberian Center of Pharmacology and Biotechnologies», e-mail: madonov@scpb.ru
Kinsht Dmitry Nikolaevich — candidate of medical sciences, head of information and analytical department at CJSC «Siberian Center of Pharmacology and Biotechnologies», assistant of anesthesiology and emergency medicine chair of FAT and PDD at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», e-mail: kin2@ngs.ru
List of the Literature:
1. Pharmacological properties of electron beam synthesis of granulocytic colony stimulating factor pegylated by means of nanotechnology / A. M. Dygay [etc.] // Cellular technologies in biology and medicine. — 2011. — № 3. — P. 146-150.
2. Hepatoprotective effects immobilized by means of nanotechnology of electron beam synthesis of Hyaluronidasum and mechanisms of their development / A. M. Dygay [etc.] // Bulletin the experim. biology and medicine. — 2011. — V. 151, № 1. — P. 86-88.
3. Research of fluoresceine absorption from jejunum of Wistar rats to blood lymph system / K. I. Ershov, V. V. Astashov, O. V. Kazakov [etc.] // Bull. of Novosibirsk state university. Series: Biology, clinical medicine. — 2012. — V. 10, Iss. 4 . — P. 41-46.
4. Anderson J. A. Allergic reactions to drugs and biological agents / J. A. Anderson // JAMA. — 1992. — Vol. 268 (20). — P. 2844-57.
5. Emerging trends in oral delivery of peptide and protein drugs / R. I. Mahato, A. S. Narang, L. Thoma, D. D. Miller // Therapeutic Drug Carrier Systems. — 2003. — Vol. 20 (2&3). — P. 153-214.
