CC BY
62
ИССЛЕДОВАНИЕ ОПТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И СТРУКТУРЫ МАТЕРИАЛОВ МИКРОФЛЮИДНЫХ ЧИПОВ Е.В. Бородина, А.А. Евстрапов, Е.А. Лизоркина
Введение
В настоящее время особое внимание уделяется разработке современного аналитического оборудования, в основе которого лежит так называемая концепция построения «лаборатории на чипе» («lab-on-a-chip» или «|-TAS» - micro-Total Analytical System), разработанная в 1990-1993 гг (Manz A., Harrison D.J., Ramsey J.M.). Сущность ее заключается в том, что все аналитические операции с образцом, включая дозирование (в объеме нано- и пико- литров) и подготовку пробы, смешивание с реагентами, химические реакции, разделение полученного продукта и детектирование, производятся на компактном устройстве - микрочипе (микрофлюидном чипе). Возможности создания микроканалов произвольного профиля, любой топологии и пространственного расположения, встраивания различных типов микрореакторов, насосов, фильтров, напыление электродов позволяют управлять потоками веществ, реализовать многостадийные аналитические реакции [1-6]. Методы получения микрочипов разнообразны и достаточно подробно изложены в [7-9].
Подобные микрофлюидные аналитические системы (МФАС) построены с использованием современных высокотехнологичных и «наукоемких» элементов микроэлектроники, оптики, гидравлики, пневматики и теплотехники. Можно отметить следующие тенденции развития микрофлюидных чипов (МФЧ): создание полимерных МФЧ, как правило, однократного применения [10], создание стеклянных МФЧ многократного применения [11, 12] и создание гибридных МФЧ с относительно невысокой стоимостью (например, полидиметилсилоксан-стеклянных [13]).
Результаты анализа на МФЧ могут регистрируются с помощью высокочувствительных системам детектирования (электрохимическими, фотометрическими, флуори-метрическими и др. [14]) - как специально разработанными для МФЧ, так и универсальными (например, микроскопами с устройствами анализа изображений).
Бесспорными преимуществами микрофлюидных аналитических систем по сравнению с классическими аналогами являются: сверхмалый объем анализируемой пробы и расход реагентов, резкое сокращение времени проведения анализа, высокая селективность и чувствительность, возможность полной автоматизации всех этапов анализа и организации замкнутого цикла при анализе.
Микрофлюидными технологиями занимаются такие известные фирмы, как Shimadzu Cor. (Япония), Agilent Technologies Inc и Caliper Technologies Inc (США), Nanogen Inc. (США), Aclara Biosciences Inc. (США), BioMicro Systems (США), Fluidigm Corporation (США), Mezzo Systems (США), Mildendo GmbH (Германия). С вышеперечисленными компаниями активно сотрудничают исследовательские центры и университеты. В настоящее время деятельность многих исследователей (например, в Harvard University) направлена на создание полимерных чипов, что позволит значительно снизить стоимость анализа и оперативно получать чипы заданной архитектуры.
Большое количество статей по микрофлюидным системам в журналах Electrophoresis, Analytical Chemistry, Analyst, Biosensors and Bioelectronics, Sensors and Actuators, Journal of Micromechanics and Microengineering, Clinical Chemistry, Luminescence, Lab on a Chip Miniaturisation for Chemistry and Biology и других свидетельствует об интересе зарубежных исследователей к МФАС.
В Институте аналитического приборостроения РАН ведутся работы по созданию аналитических приборов на основе микроразмерных устройств - микрофлюидных чипов. В результате этих работ был создан прототип МФАС, составной частью которой
является микрофлюидный чип [15]. На МФЧ осуществляется процесс электрофорети-ческого разделения исследуемого вещества с последующим детектированием компонентов методом лазер-индуцированной флуоресценции.
Конструктивно МФЧ представляют собой канализированные (на длину несколько сантиметров) и герметично соединенные между собой пластины из кремния, стекла, кварца или пластика с травленными, выплавленными или тиснеными камерами и каналами, глубина которых составляет десятки микрон.
Кремниевые и стеклянные чипы обычно изготовляются стандартными методами фотолитографии и травления, заимствованными из микроэлектроники. Для изготовления полимерных чипов используются горячее тиснение, инжекционное литье, лазерная абляция (испарение материала), а также глубокая рентгеновская литография (LIGA -технологии, обеспечивающие изготовление форм для литья полимеров - изготовления пластиковых чипов) [7].
Данная работа посвящена сравнительному анализу двух методов получения МФЧ: из стекла и полимера - полиметилметакрилата (ПММА).
Микрофлюидные чипы: получение, герметизация, измерения
Одной из основных проблем при изготовлении МФЧ является проблема формирования герметичных каналов. Герметизация стеклянных МФЧ осуществляется применением специальных, нейтральных к биологическим пробам, скотчей (например, Optically Clear laminating Adhesives 8141, 8142 или аналогичных фирмы 3M, Великобритания); нанесением полимерных пленок; приклеиванием защитного стекла с помощью полимеров; методом глубокого оптического контакта и методом спекания с помощью легкоплавких стекол. Процесс герметизации каналов МФЧ из полимера осуществляется несколькими способами: применением специальных, нейтральных к биологическим пробам, скотчей; спеканием полимеров; склеиванием полимеров; применением полимерных фоторезистов; сваркой.
Стеклянные МФЧ были получены из фоторезиста ФП-617 методом фотолитографии и травления по стандартной технологии (ОАО «Светлана», Санкт-Петербург) с последующей герметизацией микроструктур методом глубокого оптического контакта с защитным стеклом марки К8 (ОАО «ЛОМО», Санкт-Петербург). Фотография стеклянного МФЧ приведена на рис. 1, а.
AÜ
б)
Рис. 1. Микрофлюидные чипы: а) стеклянные; б) полимерные (ПММА)
Так как МФЧ используются с детектором лазер-индуцированной флуоресценции, то изучали оптические свойства микрочипов. Измеряли светопропускание в спектральном диапазоне 450-650 нм и уровень фоновой флуоресценции в спектральном диапазоне 480-650 нм при возбуждении на длине волны 473 нм. При измерениях использовали спектрофотометр HITACHI U-3410 и спектрофлуориметр HITACHI F-4010 (Япония).
а)
Спектральная зависимость светопропускания МФЧ представлена на рис. 2, а. По результатам измерений определены оптические характеристики: показатель поглощения и оптическая плотность.
\
V
длина волны, нм
длина волны,нм
90
90
89-
89 -
88
88
87-
^ 87 -
86-
86
85
85
500
600
а) б)
Рис. 2. Спектральные зависимости светопропускания МФЧ: а) стеклянного;
б) полимерного (ПММА)
Были проведены исследования поверхности и профиля микроканалов на конфокальном сканирующем лазерном микроскопе Leica. Изучалась топология канала и проводились необходимые измерения: ширины канала на поверхности пластины (79,05 мкм), ширины дна канала (54,08 мкм), отклонения по ширине канала (0,3 мкм), глубины канала (60 мкм). Исследования показали, что выбранный метод изготовления микроструктур из стеклянных материалов (фотолитографии и травления) позволяет получить структуры, обладающие требуемой чистотой поверхности и однородностью.
Полимерные (ПММА) МФЧ были получены методом лазерной абляции (Центр лазерной технологии, Санкт-Петербург) с последующей герметизацией методом спекания полимеров при температуре 1020 С ' в течение 15-20 мин. Фотография ПММА МФЧ представлена на рис. 1, б.
Герметичность ПММА МФЧ проверяли неразрушающими оптическими методами. Определяли изменения оптических характеристик в зависимости от температуры спекания, затем сравнивали полученные характеристики с аналогичными для монолитного слоя. Если характеристики, полученные для МФЧ при некоторой температуре спекания, близки к соответствующим характеристикам монолитного слоя, то такая температура считалась наиболее приемлемой. Кроме того, проводили проверку герметичности МФЧ при заполнении каналов раствором флуоресцеина. В случае отсутствия герметичности наблюдалась диффузия раствора вне каналов чипа - по границе спекания. Этот эффект оценивался на оптическом микроскопе при освещении канала МФЧ с раствором флуоресцеина световым потоком в диапазоне длин волн 400-490 нм.
Воздействие температуры на профиль микроканала ПММА МФЧ изучали в диапазоне температур от 95 до 180 °С. Эксперименты показали, что профиль канала практически не изменился. Это объясняется тем, что канал сформирован методом разрушения материала под воздействием высокой температуры, поэтому поверхность канала является термоустойчивой
Для МФЧ из ПММА, как и для стеклянных МФЧ, измеряли светопропускание и уровень фоновой флуоресценции. Спектральная зависимость светопропускания МФЧ из ПММА представлена на рис. 2, б. По результатам измерений определяли оптические характеристики: показатель поглощения и оптическая плотность.
Обсуждение результатов
Полученные данные свидетельствуют о том, что светопропускание стеклянных МФЧ выше светопропускания МФЧ из ПММА, а уровень фоновой флуоресценции стеклянных МФЧ в 3-4 раза ниже чипов из ПММА.
Микроструктуры, сформированные из стекла методом фотолитографии и травления, отличаются высокой чистотой поверхности в отличие от микроструктур, полученных в ПММА методом лазерной абляции. Однако формирование микроструктур в стекле - более трудоемкий и длительный процесс, в отличие от аналогичного процесса для ПММА.
Получение стеклянных МФЧ требует использования разнопрофильных оборудования и технологических процессов (фотолитография, жидкостное травление, нанесение покрытий, глубокий оптический контакт). Все это влияет на конечную стоимость получения стеклянных МФЧ, которая оказывается в несколько раз выше стоимости ПММА МФЧ. Получение ПММА чипов методом лазерной абляции и спекания - более оперативная и дешевая процедура создания МФЧ, хотя при этом, на данный момент, получаются МФЧ более низкого качества (чистота поверхности, однородность канала и т.п.). С другой стороны, полимерные МФЧ, как правило, используются однократно (или ограниченное число раз). Стеклянные МФЧ могут быть использованы многократно для анализа веществ после процедуры промывки каналов.
Таким образом, можно констатировать тот факт, что и стеклянные, и полимерных МФЧ имеют свои преимущества и недостатки, свои области применения. Однозначно отдать пальму первенства какому-либо материалу невозможно. Скорее всего, будут развиваться и стеклянные, и полимерные МФЧ, тем более, что эти материалы находят широкое применение при анализе биологических веществ. Простота утилизации полимерных МФЧ и их дешевизна, наверное, будут существенным преимуществом этих МФЧ при анализе особо опасных инфекций и вредных веществ.
Работа выполнена при поддержке грантов Научной программы Санкт-Петербургского научного центра РАН «Аналитические приборы на основе микрофлюидных технологий (раздел 2, проект 2, 2003 г.) и Межведомственной научно-технической программа: «Вакцины нового поколения и диагностические системы будущего», «Новые принципы детекции и разработка на их основе приборов для автоматизации лабораторно-диагностических методов исследования» (ГК N43.269.11.0206, 2002-2006 гг.).
Литература
1. Reyes D.R., Iossifidis D., Auroux P-A., Manz A. Micro Total Analysis Systems// Anal. Chem. 2002. 74. P. 2623-2652.
2. Sanders G.H.W., Manz A. Chip-based microsystems for genomic and proteomic analysis // Trends in analytical chemistry. 2000. Vol. 19. №. 6. Р. 364-378.
3. Dolnic V., Liu S., Jovanovich S. Capillary electrophoresis on microchip // Electrophoresis. 2000. Vol. 21. Р. 41-54.
4. Khandurina J., Guttman A. Bioanalysis in microfluidic devices// Chromatography A.
2001. Vol. 924 (1-2), p. 233-238.
5. Carey L., Mitnik L. Trends in DNA forensic analysis // Electrophoresis. 2002. 23. P. 1386-1397.
6. Verpoorte E. Microfluidic chips for clinical and forensic analysis // Electrophoresis.
2002. Vol. 23. p. 677-712.
7. Chen Y., Pepin A. Nanofabrication: Conventional and nonconventional meth-ods)//Electrophoresis. 2001. Vol. 22. P.187-207,
8. Huang Y., Mather E.L.,. Bell J.L, Madou M. MEMS-based sample preparation for molecular diagnostics// Anal. Bioanal. Chem. 2002. 372. P. 49-65.
9. Proceeding of Micro Total Analysis Systems 2000./ Ed. Van den Berg A, Olthuis W & Bergveld P.. Academic Publisher, Dordrecht: Kluwer.
10. McDonald J. Et al. Fabricaton of microfluidic systems in polydimethilsiloxane // Electrophoresis. 2000. Vol. 21. P.27-40.
11. Attiya S, Jemere A.B., Tang T., Fitzpatrick G. et al. Design of an interface to allow microfluidic electrophoresis chips to drink from the fire hose of the external environment // Electrophoresis. 2001. Vol.22. P.318-327.
12. Lichtenberg J., Verpoorte E., Rooij N.F. Sample preconcentration by field amplification stacking for microchip-based capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2001. Vol.22. P.258-271.
13. Hong J.W., Fujii T., Seki M., Yamamoto T., Endo I. Integration of gene amplification and capillary gel electrophoresis on a polydimethylsiloxane-glass hybrid microchip// Electro-phoresis. 2001.Vol.22. P.328-333.
14. Swinney K., Bornhop D.J. Detection in capillary electrophoresis// Electrophoresis. 2000. Vol.21. P.1239-1250.
15. Евстрапов А.А., Беленький Б.Г., Курочкин В.Е., Суханов В.Л., Поздняков О.Ф., Бу-ляница А. Л., Филимонов В.В. Микрофлюидные аналитические системы на основе электрофоретических методов анализа // Новости науки и техники. Серия Медицина. Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2001. № 1. С.190-193.
