CC BY
37
Исследование нейропротекторной активности гидропонического Teucrium Polium L в условиях овариэктомии
Чавушян В. А., Симонян К. В., Галстян А. М.
Исследование нейродегенеративных патологий, индуцированных гормональным дисбалансом и разработка их профилактики / превенции остается актуальной медико-биологической проблемой. Познавательная функция ЦНС находится под постоянным контролем со стороны женских половых гормонов [1]. Длительная депривация овариальных гормонов — овариэктомия (OBX) — приводит к значительному снижению плотности дендритных отростков у крыс самок, что указывает на необходимость половых стероидов для поддерживания нормальной структуры и пластичности зрелой клетки [2]. Гиппокампальная формация содержит рецепторы основных стероидных гормонов, трофических факторов и выделяется богатой иннервацией от холинэргических, серотонинэргических, катехоламинэр-гических и глутаматэргических систем [2]. Биологический эффект эстрогена включает транскрипционный ответ, осуществляемый через активацию протеинов ядерных эстро-геновых рецеторов а и В, а также более быстрый ответ, осуществляемый через мембранные рецепторы, активация которых потенциально может преобразовываться в синапто-генез, поскольку таковые сильно модулируют важнейшие внутриклеточные сигнальные пути [3]. Процесс синаптической пластичности (включая кратковременную и долговременную потенциацию и депрессию), рассматриваемый как клеточный коррелят обучения / памяти и многих нейроло-гических расстройств (в том числе ОВХ-индуцированных), сопровождаемых когнитивным дефицитом, проявляется аномальной синаптической функцией. С этой точки зрения интересно, что некоторые из гормонально активных фитофлавоноидов (лютеолин, изофлавоны) селективно связываются с рецепторами эстрогена [4]. При деменциях Альцгеймеровского типа идентифицирована терапевтическая эффективность для двух растений из семейства Lamiacea: Melissa officinalis и Salvia officinalis [5].
Целью данного изучения явилось электрофизиологиче-ское исследование нейропротекторной эффективности ги-дропонического Teucrium polium Lamiacea в условиях хронической нейродегенерации, индуцированной двусторонним удалением яичников.
Материал и методы
С целью получения экологически чистого урожая и программируемого химического состава — обогащение флаво-ноидными гликозидами (рутин, катехин, апигенин, лютеолин не менее 1,5%) и фенолгликозидами (вербаскозид, полиумозид, теуполиозид не менее 3%) — установлена целесообразность выращивания Teucrium polium в открытой гидропонике [6]. Согласно оптимальному соотношению токсичности и содержания биологически активных соединений в качестве терапевтической дозы приняты 5% от максимально переносимой дозы (400 мг/кг), что составляет 20 мг/кг, водной фракции этанольного экстракта гидропонического Teucrium polium [7]. У половозрелых крыс-самок Альбино под нембуталовым наркозом (35 мг/кг в/б) производили билатеральное удаления яичников. Спустя 3 недели после операции животные были произвольно разделены на 2 группы. Животные группы OBX+ Teucrium polium (n=6) получали Teucrium polium L в/м ежедневно в течение 3 недель; животные группы OBX плацебо-контроль (n=6) в том же режиме получали стерильный бидистилят.
На интактных половозрелых крысах-самках (n=4), а также в группах OBX плацебо-контроль и OBX+ Teucrium
polium по истечении 6 и 8 недель после OBX в микроэлек-трофизиологических исследованиях производили экстра-клеточную регистрацию фоновой и вызванной спайковой активности единичных нейронов гиппокампа (Г) при высокочастотной стимуляции (ВЧС) ипсилатеральной энто-ринальной коры (ЭК). В остром эксперименте под хлора-лозным наркозом (1,1 мг/кг) раздражающий биполярный электрод погружали в ЭК по стереотаксическим координатам AP-9, L+3.8, DV+4.0 мм, а стеклянный регистрирующий микроэлектрод с диаметром кончика 1 мкм, заполненный 2М раствором NaCl многократно погружали в Г по координатам AP-3.2-3.5, L+1.5-3.5, DV+3.0-4.0 мм согласно стереотаксическому атласу [8]. ВЧС (100 Гц в течение 1сек) осуществляли прямоугольным током амплитудой 0,16 мА. В онлайн режиме импульсный поток единичного нейрона после селекции посредством амплитудного дискриминатора подвергался программному анализу, с последующим выводом перистимульных временных гистограмм (разработчик программы В. С. Каменецкий). Целью анализа является определение статистической достоверности различий межспайковых интервалов до, после и на время действия ВЧС. Для решения этой задачи строятся гистограммы межспайковых интервалов, определяются основные параметры распределения спайкинга — средние значения частоты, моды, дисперсии — для отдельных нейронов и/или усредненных для всей популяции нейронов с данным типом ответов. Традиционным методом проверки однородности двух независимых выборок являлся t-критерий Стью-дента. Для повышния надежности статистических оценок применяли также непараметрический метод проверки с использованием двухвыборочного критерия Вилкоксона, учитывающего асимптотическую нормальность данного критерия и позволяющего сравнивать расчетные значения с табличными значениями стандартного нормального распределения (при уровнях значимости 0.05, 0.01 и 0.001). Для избираемых сравниваемых групп спайкинга нейрональной активности программно строили усредненные диаграммы с цифровыми значениями средней частоты спайков в реальном времени 20 сек до ВЧС (Мпре-), 20 сек после ВЧС (Мпост-) и на время ВЧС в течение 1 сек (Мвчс), демонстрирующие выраженность ответов на время тетанизации (Мвчс) и постстимульное время (Мпост-) по сравнению со средней частотой фоновой / престимульной спайковой активности (Мпре-).
Результаты и обсуждение
В целях определения статистической достоверности изменения спайковой активности единичного нейрона Г на ВЧС ЭК анализируются длительности межспайковых интервалов до и после действия ВЧС. Согласно математикостатистическим терминам в результате анализа выявляются различия между двумя независимыми выборками. Уменьшение длительности межспайковых интервалов, т. е. учащение спайкового потока оценивается как возбуждение или потенциация, и, наоборот, увеличение длительности межспайковых интервалов, т.е. урежение спайкового потока — как торможение или депрессия. На ВЧС ЭК указанные эффекты могут иметь место в реальном времени на период ВЧС (тетанизации) и постстимульный временной отрезок. Согласно нашим экспериментальным данным, на ВЧС ЭК на время ВЧС в нейронах гиппокампа регистрируются ответы в виде тетанической потенциации (ТП) и депрессии
(ТД), а на посттетаническое время — в виде посттетаниче-ской потенциации (ПТП) и депрессии (ПТД). У интактных крыс в норме при ВЧС ЭК в отдельных нейронах (n=157) Г зарегистрирован следующий баланс типов ответов: ТП, ПТП, ТП+ПТП (в 26 из 157 нейронов - 16,56%); ТД, ПТД, ТД+ПТД (в 67 из 157 нейронов — 42,67%) и ТД+ПТП (в 64 из 157 нейронов — 40,76%) (Рис. А). В плацебо-контрольной группе к 6 и 8 неделе OВX в общем числе (n=143 и n=122 соответственно) зарегистрированных нейронов 65 единиц (45,45%) и 26 единиц (21,31%), соответственно, проявляли ареактивность на ВЧС ЭК, в то время как в норме таковые отсутствовали (Рис. А). В группе ОВХ+Teucriumpolium доля ареактивных единиц Г составила 8,06% (15 из 186) на 6 неделе с отсутствием таковых на 8 неделе. В резком уменьшении доли ареактивных нейрональных единиц в группе OВX+ Teucrium polium, возможно, немаловажную роль имеет активация нейрональной дифференциации и нейрогенеза апигенином [9]. Процентная доля нейронов с возбудительным типом ответов (ТП, ПТП, ТП+ПТП) уменьшается от 16,56% в норме до 11,47% (14 из 122 единиц) в плацебо-контрольной группе к 8 неделе, а в группе ОВХ+Teucrium polium отмечается резкое увеличение таковых до 52,15% (97 из 186) к 6 неделе и соответствующие норме 16,10% (24 из 149) к 8 неделе ОВХ (Рис. А). В те же сроки число нейронов с тормозным типом ответов (ТД, ПТД, ТД+ПТД) в плацебо-контроле уменьшается от 42,67% в норме до 22,13% (27 из 122), и восстанавливается до 36,24% (54 из 149) в группе OВX+ Teucrium polium. Доля нейронов с ТД+ПТП типом ответов увеличивается как в плацебо-контрольной группе 45,08% (55 из 122), так и в группе OВX+ Teucrium polium (47,65% - 71 из 149) по сравнению с нормой (41,40%). Согласно диаграммам средней частоты для нейронов с тормозным типом ответов Мпре- в норме составляет 6,53 спайк/сек, в группе ОВХ — 6,39 , а в группе OВX+ Teucrium polium — 9,23 спайк/сек. Торможение на время ВЧС в указанных группах выражено 8,59 раз (6,53 : 0,76), 3,45 раз (6,39 : 1,85) и 41,95 раз (9,23 : 0,22), соответственно. Усредненные ТП ответы в норме выражены в 4 раза (32,45 : 8,11 спайк/сек ), а в группе OВX+ Teucrium polium — 14,82 раза (12,75 : 0,86 спайк/сек) по сравнению со слабыми ТП ответами (10,71 : 3,42 спайк/сек = 3,13 раза) в группе OВX плацебо-контроль. Ослабление ответоспособности нейронов на время ВЧС свидетельствует о нарушениях в процессах нейромедиации в условиях ОВХ и, наоборот, определенное воспроизведение частотного стимула — показатель восстановления нейромедиаторного статуса под воздействием Teucrium polium. Данные свидетельствуют, что активность синаптического аппарата под воздействием Teucrium polium восстанавливается по сравнению с характерным для дегенерирующих нейронов истощением спайкинга в группе OВX плацебо-контроль. Согласно литературным данным лю-теолин в состоянии повышать базальную синаптическую трансмиссию и облегчать индуцирование долговременной потенциации в зубчатой извилине гиппокампа крыс [10]. Обнаружено, что эффект лютеолина на долговременную потенциацию и память может осуществляться активацией протеина CREB (cAMP response element-binding), что указывает на потенциал лютеолина как терапевтический агент для протектирования синаптической функции и улучшения памяти при нейродегеративных нарушениях [10]. Результаты электрофизиологических экспериментов указывают, что механизмы, лежащие в основе модуляции ио-
нотропных ГАМК-рецепторов флавоноидами (в частности апигенином) отличаются от таковых классических для бен-зодиазепиновой модуляции [11]. Возросший в последнее время интерес к флавоноидам растительного происхождения обусловлен их модуляторной функцией на рецепторы ГАМК(А) в головном мозге [12]. Область интересов включает 1) флумазенил-нечувствительную модуляцию ГАМКА рецепторной функции флавоноидами; 2) способность некоторых флавоноидов действовать как модуляторы второго порядка для модуляции первого порядка бензодиазепина-ми; 3) идентификация различных сайтов воздействия флавоноидов в ГАМКА рецепторных комплексах. Возникает интерес к вопросу активации ГАМКА рецепторов в отсутствии ГАМК и сравнительно ригидная форма флавоноидов — потенциальная предпосылка для терапевтических агентов нового поколения [12].
Таким образом, результаты электрофизиологиче-ских экспериментов относительно восстановления синаптической функции в нейронной цепи ЭК-Г в группе OВX+ Teucrium polium по сравнению с группой плацебо-контроль свидетельствуют о нейропротекторной эффективности Teucrium polium в условиях ОВХ. Учитывая, что в результате лишения трофической поддержки (в частности, в результате деприваци эстрогена), рост и дифференциация аксонов, дендритов и синапсов мобилизуются благодаря повышенной чувствительности эстрогеновых рецепторов [2], можно предположить, что представленные результаты могут пролить свет на выявление эстроген-ре-цептор-обусловленных механизмов воздействия Teucrium polium в регулировании OВX-индуцированных нейродеге-неративных нарушений.
Список использованных источников
1. Dohanich G.P. Gonadal steroids, learning and memory. In: Pfaff D.W., Arnold A.P., Etgen A.M., Fahrbach S.E., Rubin R.I., eds. Hormones, brain and behavior. 2002, San Diego: Academic Press; P. 265-327.
2. McEwen B. Estrogen actions throughout the brain. Recent Progress in Hormone Research 2002, V. 57, p. 357-384.
3. Levin E.R. Cellular functions of plasma membrane estrogen receptors. Steroids 2002, V. 67, P. 471-475.
4. Jarry H., Spengler B., Porzel A., Schmidt J., Wuttke W., Christoffel V. Evidence for estrogen receptor beta-selective activity of Vitex agnus-castus and isolated flavones. Planta Med. 2003, V. 69, N. 10, P. 945-947.
5. Dos Santos-Neto L.L., de Vilhena Toledo M.A., Medeiros-Souza P., de Souza G.A. The use of herbal medicine in Alzheimer's disease-a systematic review. Evid Based Complement Alternat Med. 2006, V. 3, N. 4, P. 441-445.
6. Galstyan H.M., Revazova L.V., Topchyan H.V. Digital indices and microscopic analyses of wild growing and overgrowing of Teucrium polium L. in hidroponic conditions. The new Armenian medical journal, v.4, N 3, 2010, p.104.
7. Chavushyan V.A., Simonyan K.V., Galstyan H.M. Toxicity studies of Teucrium polium Lamiaceae growing in nature and in culture. The second international symposium "BI0PHARMA-2010: from science to industry" Yerevan, Armenia May 17-20, 2010, P.11.
8. Paxinos G. , Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 2005 Acad. Press, New York, 5th ed.
9. Taupin P. Apigenin and related compounds stimulate adult neurogenesis. Expert Opin Ther Pat. 2009, V. 19, N. 4, P. 523-527.
10. Xu B., Li X.X., He G.R., Hu J.J., Mu X., Tian S., Du G.H.
Luteolin promotes long-term potentiation and improves cognitive functions in chronic cerebral hypoperfused rats. Eur J Pharmacol. 2010, V. 10, N. 627 (1-3), P. 99-105
11. Goutman J.D., Waxemberg M.D., Donate-Oliver F., Pomata P.E., Calvo D.J. Flavonoid modulation of ionic currents mediated by GABA(A) and GABA(C) receptors. Eur J Pharmacol. 2003 Feb 14, V. 461(2-3), p. 79-87.
12. Hanrahan J.R., Chebib M., Johnston G.A. Flavonoid modulation of GABA(A) receptors. British Journal of Pharmacology 2011, V.163(2), p.234-245.
13. STUDY OF NEUROPROTECTIVE ACTIVITY OF HYDROPONIC TEUCRIUM POLIUM L IN CONDITION OVARIECTOMY
14. Chavushyan V. A.1, Simonyan K. V.1, Galstyan H. M.2
15. 1L. A. Orbeli Institute of physiology NAS RA, Yerevan, Armenia
16. 2 G. S. Davtyan Institute of problems of hydroponics NAS RA, Yerevan, Armenia
17. Сведения об авторах
18. Чавушян В.А. - зав. лаб. нейроэндокринных взаимоотношений Института физиологии им. Л.А.Орбели НАН Республики Армения, д.б.н.
19. Симонян К.В. - младший научный сотрудник лаборатории нейроэндокринных взаимоотношений Института физиологии им. Л.А.Орбели
20. Галстян А.М. - научный сотрудник Института проблем гидропоники им. ГС.Давтяна НАН Республики Армения, к.фарм.н.
Рисунок 1. А - Долевое процентное соотношение числа нейронов гиппокампа с ареактивными, возбудительными, тормозными и ТД+ПТП типами ответов при высокочастотной стимуляции энторинальной коры в норме и спустя 6, 8 недель
после овариэктомии (ОВХ) в группах ОВХ (плацебо контроль) и ОВХ+Теиспит роИит. Б - диаграммы средней частоты спайков для каждой группы, с указанием цифровых значений средней частоты спайкинга (спайк/сек) в реальном времени 20 сек до ВЧС (Мпре-), 20 сек после ВЧС (Мпост-) и на время ВЧС в течение 1 сек (Мвчс).
