CC BY
111
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 614.7:553.982]:612.6.05.084
Ж. Ж. Гумарова1, А. Б. Бигалиев2, Г. К. Ерубаева2, Л. Ж. Гумарова2
ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ НЕФТИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ
воздействии на лабораторных животных
'Западно-Казахстанский государственный медицинский университет им. Марата Оспанова; 2Казахский национальный университет им. аль-Фараби, Республика Казахстан
С использованием метафазного метода анализа хромосом изучено мутагенное действие летучих фракций нефти при хронической интоксикации крыс. Полученные результаты показывают, что хроническое ингаляционное воздействие летучими фракциями нефти на крыс в различных концентрациях приводит к значимому увеличению частоты встречаемости клеток с хромосомными аберрациями в костном мозге в ряду поколений (до 2,5 раза по сравнению со спонтанным уровнем). Помимо нарушений структуры хромосом, происходят геномные изменения (анеуплоидии, полиплоидии). Обнаружена тенденция к увеличению частоты индуцированных нефтью аберраций хромосом в ряду поколений (Р, F1, F2) в клетках костного мозга крыс. Установлен максимальный мутагенный эффект летучих фракций нефти в концентрациях 10 и 100 мг/л при длительном хроническом воздействии на протяжении трех поколений (Р, F F2). Полученные данные свидетельствуют о мутагенном эффекте летучих фракций нефти, что, вероятно, обусловливает потенциальную опасность для биоты и здоровья населения загрязнения окружающей среды в зоне интенсивной добычи и переработки нефти.
Ключевые слова: загрязнение окружающей среды, нефть и нефтепродукты, мутагенный эффект, аберрации хромосом, цитогенетический эффект
Zh. Zh. Gumarova, A. B. Bigaliyev, G. K. Erubayeva, L. Zh. Gumarova — STUDY OF THE MUTAGENIC ACTIVITY OF PETROLEUM UPON CHRONIC EXPOSURE IN LABORATORY ANIMALS
Marat Ospanov Western Kazakhstan State Medical University, Al-Farabi Kazakh National University, Republic of Kazakhstan
A metaphase chromosome analysis method was used to evaluate the mutagenic activity of volatile petroleum fractions in chronically intoxicated rats. The findings indicate that chronic inhalation exposure of the rats to volatile petroleum fractions at different concentrations results in a significant (2.5-fold) increase, compared to the spontaneous level, in the occurrence of chromosomal aberrations in the bone marrow cells in a number of generations. In addition to chromosomal structural abnormalities, there are genomic changes (aneuploidy, polyploidy). There is a tendency towards an increased rate ofpetroleum-induced chromosomal aberrations in a number of generations (P, F, and FJ in the rat bone marrow cells. The maximum mutagenic effect of volatile petroleum fractions was found when used at concentrations of 10 and 100 mg/l upon long-term chronic exposure during three generations (P , F , and F2). The findings are indicative of the mutagenic activity of volatile petroleum fractions, which is likely to pose a potential risk from environmental pollution to biota and population health in the area of intensive oil extraction and refining.
Key words: environmental pollution, petroleum and its products, mutagenic effect, chromosomal aberrations, cytogenetic effect
введение
По данным ряда специалистов-экологов, в нефтегазоносном западном регионе Республики Казахстан, особенно на Тенгизе, имеются факторы, оказывающие негативное воздействие на экосистему в целом. За последние десятилетия резко увеличилось накопление отходов нефтедобычи и загрязнение нефтью и газами атмосферы, почвы и водных ресурсов [7, 11, 12]. Для оценки эколого-генетической опасности химических соединений особую значимость и актуальность имеет исследование влияния загрязняющего агента на наследственность, а именно тестирование мутагенного действия [1, 4]. Сложившаяся экологическая ситуация в нефтегазодобывающих областях Казахстана определила цель и задачи настоящего исследования - изучить
Гумарова Ж. Ж. - канд. биол. наук, доц., зав. каф. химических дисциплин ([email protected]); Ерубаева Г.К. - канд. биол. наук, доц. каф. экологии и ботаники ([email protected]); Бигалиев А. Б. - д-р биол. наук, проф., зав. каф. экологии и ботаники ([email protected]; [email protected]); Гумарова Л.Ж. - канд. биол.наук, доц. кафедры физиологии человека и животных и биофизики ([email protected]).
мутагенное действие нативной тенгизской нефти в опытах на лабораторных животных.
Материалы и методы
Объектом исследования были беспородные белые крысы массой 200-250 г в возрасте 6 мес (самцы и самки). Всего в общем эксперименте было изучено 210 особей (родительские особи для эксперимента и дополнительно для разведения - 10 самок и 2 самца, 1-е и 2-е поколения, особи в периоде восстановления, контрольные особи), в каждой группе выборка состояла из 5 особей. Группы экспериментальных животных формировались следующим образом:
Р - группа родительских форм - n = 60; контроль Р - n = 18;
F1 - особи 1-го поколения - n = 50; контроль F1 - n = 10;
F2 - особи 2-го поколения - n = 50; контроль F2 - n = 10.
В каждой группе животных оставляли по 5 особей для восстановительного периода, а в 1-м и 2-м поколениях были еще животные, которые подвергались воздействию нефти только в эмбриональном периоде. Так как для приготовления препаратов метафазных пласти-
69
[гиена и санитария 4/2012
нок костного мозга животных забивали, существовала дополнительная группа животных для разведения (скрещивания) - 10 самок и 2 самца.
Ранее авторы (Бигалиев А. Б., Ищанова Н. Е.) изучали влияние нефти на объекты окружающей среды (почва, вода, растения, животные) и установили, что для грызунов (большая песчанка) мутагеном является нефть в концентрации 0,1 мг/кг. Для подтверждения влияния нефти на выявленные автором хромосомные мутации в клетках костного мозга большой песчанки и исключения влияния других факторов (например, тяжелых металлов, изотопов) нами для исследования были взяты концентрации нефти на один, два и три порядка выше использовавшейся ранее (0,1 мг/кг). Животные подвергались хроническому воздействию в ингаляционной камере объемом 73 л 6 раз в неделю по 1 ч в день в концентрациях 1, 10 и 100 мг/л в течение 1, 3 и 6 мес. Одновременно в камеру помещали не более 10 экспериментальных животных. При этом во время затравки каждые 10-15 мин происходила равномерная подача исследуемых концентраций нефти в камеру с помощью механического устройства, по которому продвигался поршень шприца, наполненного образцом нефти определенной концентрации.
Самки родительской группы и групп 1-го и 2-го поколений подвергались воздействию исследуемых концентраций нефти в течение всего времени эксперимента (а также во время беременности). Для каждой группы было определено время воздействия (1, 3 и 6 мес). После 6 мес воздействия в каждой экспериментальной группе были отобраны животные, которые находились в восстановительном периоде в течение 1 мес.
Выбор исследуемых концентраций нефти и методика проведения затравки основаны на данных литературы [6]. Материалом для исследования были клетки костного мозга подопытных животных (для умерщвления животных использовали эфирный наркоз). Приготовление цитологических препаратов хромосом осуществляли по общепринятой методике для метафазного анализа с некоторыми модификациями [10, 14]. Статистические величины цитогенетических показателей обрабатывали общепринятыми биометрическими методами. Достоверность различий между двумя точками определяли по критерию Стьюдента [2, 9].
Результаты и обсуждение
Известно, что химический состав нефти зависит от района добычи. Тенгизские нефти сернистые и малосернистые, содержат сероводород и меркапта-новую серу, а также сульфидную и дисульфидную серу. В эксперименте использована нативная нефть из Тенгизского нефтяного месторождения, ее состав: нормальные углеводороды 27,72% (пропан, н-бутан, н-пентан, н-гексан, н-гептан), изопарафины 43,29%; арены 10,13% (бензол, толуол, этилбензол, п-ксилол, м-ксилол, о-ксилол, 1-метил-3-этилбензол), нафтены 18,55%, олефины 0,31%.
Результаты анализа частоты нарушений хромосом, анеуплоидии и полиплоидии в клетках костного мозга крыс (родительские формы Р), подвергнутых хроническому воздействию нефти в течение 1, 3 и 6 мес, представлены в табл. 1, из которой видно, что в группе животных, подвергавшихся воздействию нефти в концентрации 100 мг/л в течение 1 и 6 мес, достоверно увеличивалась частота встречаемости анеуплоидных
клеток в 2,2 и 2,11 раза (р < 0,05) по сравнению с контролем. Среди анеуплоидных клеток отмечено преобладание гипердиплоидных клеток. Также отмечено увеличение частоты встречаемости полиплодиных клеток по сравнению с контролем во всех вариантах эксперимента. Среди полиплоидных клеток встречаются тетра-, гекса- и октоплоидные клетки.
Во всех вариантах эксперимента наблюдалось увеличение частоты встречаемости клеток с хромосомными аберрациями по сравнению с контролем. При воздействии нефти в концентрации 10 мг/л в течение 6 мес частота встречаемости аберрантных клеток возросла в 1,92 раза и достоверно (р < 0,05) превысила контрольный показатель. Воздействие нефти в концентрации 100 мг/л в течение 1, 3 и 6 мес вызывало достоверное увеличение встречаемости клеток с хромосомными аберрациями в 2,03, 1,96 и 2,14 раза (р < 0,05) по отношению к контролю. В спектре нарушений хромосом обнаружены аберрации хромосомного и хроматидно-го типов с преобладанием последних. Таким образом, нефть выступает как классический химический мутаген продленного действия.
В восстановительном периоде (1 мес после воздействия различных концентраций нефти в течение 6 мес) в группе животных (родительские формы Р), которая не подвергалась дальнейшей интоксикации, отмечено некоторое снижение частоты встречаемости аберрантных, анеуплоидных и полиплоидных клеток, но оно все еще превышало уровень в контроле. В группе животных, которые подвергались воздействию нефти в концентрации 100 мг/л, в восстановительном периоде достоверно чаще выявляли полиплоидные клетки - в 1,77 раза по сравнению с контролем (р < 0,05). Увеличение частоты встречаемости полиплоидных клеток в экспериментальных группах при хроническом воздействии свидетельствует об изменении пролиферативной активности клеток костного мозга и о специфичности воздействия нефти на субклеточном уровне. В последующем это может привести к изменению адаптации организма к экстремальным факторам среды обитания. Во 2-й и 3-й группах обнаружено достоверное увеличение частоты клеток с хромосомными аберрациями - в 1,91 (р < 0,05) и 1,82 (р < 0,05) раза по сравнению с контролем. Уровни хромосомных аберраций в контрольной группе животных соответствуют данным литературы [3, 8, 13].
В табл. 2 представлены результаты анализа экогенетических нарушений хромосомного аппарата клеток костного мозга крыс 1-го (F1) и 2-го (F2) поколений. В группе животных (F1), подвергавшихся воздействию нефти в течение 3 мес в концентрациях 10 и 100 мг/л, отмечается достоверное увеличение частоты встречаемости полиплоидных клеток в 2,09 (р < 0,05) и 2,1 (р < 0,05) раза. При увеличении срока воздействия до 6 мес обнаружено достоверное увеличение частоты встречаемости клеток с аберрациями в 1,87 (р < 0,05) и 2,14 (р < 0,05) раза по сравнению с контролем. В этих группах также обнаружено достоверное увеличение частоты встречаемости полиплоидных клеток в 2,11 (р < 0,05) и 2,47 (р < 0,05) раза. Кроме того, во 2-й группе (100 мг/л) обнаружено также значимое увеличение частоты встречаемости анеуплоидных клеток - в 2,27 раза (р < 0,05) через 3 мес, в 2,56 раза (р < 0,05) через 6 мес по сравнению с контролем, среди которых преобладали гипердиплоидные клетки (в 2,93 раза; р < 0,05). Установлен
70
Таблица 1
Анализ изменчивости экогенетических нарушений хромосомного аппарата клеток костного мозга подопытных животных в условиях длительного воздействия нефти у родительских форм (р)
Группа животных Концентрация нефти, мг/л Время воздействия, мес Изучено метафаз Частота встречаемости клеток
с аберрациями анеуплоидных полиплоидных
абс. М ± т, % абс. М ± т, % абс. М ± т, %
Контроль - 1 1100 16 1,45 ± 0,36 14 1,27 ± 0,34 12 1,09 ± 0,31
3 1150 17 1,48 ± 0,36 14 1,22 ± 0,32 12 1,04 ± 0,30
6 1250 21 1,68 ± 0,36 17 1,36 ± 0,33 18 1,44 ± 0,34
1-я опытная 1 1 695 10 1,44 ± 0,45 11 1,58 ± 0,47 10 1,44 ± 0,45
3 900 15 1,67 ± 0,43 15 1,67 ± 0,43 16 1,78 ± 0,44
6 880 19 2,16 ± 0,49 16 1,82 ± 0,45 19 2,16 ± 0,49
2-я опытная 10 1 710 15 2,11 ± 0,54 13 1,83 ± 0,50 12 1,69 ± 0,48
3 850 22 2,59 ± 0,54 18 2,12 ± 0,49 20 2,35 ± 0,52
6 930 30 3,23 ± 0,58* 20 2,15 ± 0,48 22 2,36 ± 0,50
3-я опытная 100 1 715 21 2,94 ± 0,63* 20 2,80 ± 0,62* 18 2,52 ± 0,59*
3 1000 29 2,90 ± 0,53* 20 2,00 ± 0,44 24 2,40 ± 0,48*
6 975 35 3,59 ± 0,60** 28 2,87 ± 0,53* 30 3,08 ± 0,55*
1-я опытная 1 755 20 2,65 ± 0,58 15 1,99 ± 0,51 16 2,12 ± 0,52
2-я опытная Восстановительный период 1 920 26 2,83 ± 0,55* 17 1,85 ± 0,44 19 2,06 ± 0,47
3-я опытная 1 980 30 3,06 ± 0,55* 24 2,45 ± 0,49 25 2,55 ± 0,50*
Примечание. * - р < 0,05 при t > 1,96; ** - р < 0,01 при t > 2,58.
максимальный мутагенный эффект летучих фракций нефти в концентрациях 10 и 100 мг/л при хроническом воздействии в течение 6 мес.
В восстановительный период (1 мес) в группе животных (F1), которая не подвергалась дальнейшей интоксикации, наблюдается тенденция к снижению частоты встречаемости аберрантных, анеуплоидных и полиплоидных клеток, но он все еще превышает уровень в контроле. В группе животных (F2), подвергавшихся хроническому воздействию нефти в течение 3 мес в концентрациях 10 и 100 мг/л, наблюдали достоверное увеличение частоты встречаемости клеток с аберрациями в 2,22 (р < 0,05) и 2,23 (р < 0,05) раза, а также полиплоидных клеток в 2,9 и 2,99 раза относительно контроля (р < 0,05). При воздействии нефти в течение 6 мес обнаружено достоверное увеличение частоты встречаемости клеток с аберрациями в 2,23 (р < 0,05) и 2,5 (р < 0,01) раза, а также с анеуплоидными наборами хромосом в 2,53 (р < 0,05) и 2,88 (р < 0,05) раза и полиплоидными - в 2,41 (р < 0,05) и 2,96 (р < 0,05) раза.
В восстановительный период (1 мес) в группе животных (F2) наблюдали некоторое снижение частоты встречаемости аберрантных, анеуплоидных и полиплоидных клеток, но оно все еще превышало контрольные значения. Возможно, это происходит потому, что определенная часть нефтепродуктов, поступившая в материнский организм, способна преодолевать плацентарный барьер и индуцировать хромосомные мутации у плода, что наиболее ярко проявилось при воздействии нефти в концентрациях 10 и 100 мг/л в течение 6 мес. Кроме того, нами было проведено цитогенетическое исследование клеток костного мозга потомства животных из групп 2-го и 3-го поколений, которые не подвергались интоксикации. Как показали результаты исследований,
Рис. 1. Клетки костного мозга крысы с аберрациями. а - концевая делеция, 2п = 41; б - парные фрагменты, 2п = 42, указаны стрелками. Окраска по Романовскому-Гимзе. Ув. 900.
71
[гиена и санитария 4/2012
Таблица 2
Анализ изменчивости экогенетических нарушений хромосомного аппарата клеток костного мозга подопытных животных в условиях длительного воздействия нефти в 1-м и (Ft) и 2-м (F2) поколениях
Группа животных Концентрация нефти, мг/л Время Изучено ме- Частота встречаемости клеток
воздей- с аберрациями анеуплоидных полиплоидных
мес тафаз абс. М ± т, % абс. М ± т, % абс. М ± т, %
1-е поколение (Fj)
Контроль - 3 850 14 1,65 ± 0,44 10 1,18 ± 0,37 12 1,41 ± 0,40
6 835 15 1,80 ± 0,46 12 1,44 ± 0,41 13 1,56 ± 0,43
1-я группа 10 3 645 16 2,48 ± 0,61 15 2,33 ± 0,59 19 2,95 ± 0,67*
3э 670 13 1,94 ± 0,53 13 1,94 ± 0,53 13 1,94 ± 0,53
6 700 23 3,29 ± 0,67* 19 2,71 ± 0,61 23 3,29 ± 0,67*
6э 694 14 2,02 ± 0,53 15 2,16 ± 0,55 16 2,30 ± 0,57
2-я группа 100 3 710 19 2,68 ± 0,61 19 2,68 ± 0,61* 21 2,96 ± 0,64*
3э 680 15 2,21 ± 0,56 14 2,06 ± 0,54 13 1,91 ± 0,52
6 650 25 3,85 ± 0,75* 24 3,69 ± 0,74** 25 3,85 ± 0,75**
6э 640 15 2,34 ± 0,61 15 2,34 ± 0,60 15 2,34 ± 0,60
1-я группа 1 667 14 2,10 ± 0,55 14 2,10 ± 0,55 15 2,25 ± 0,57
2-я группа Восстано- вительный период 1 700 18 2,57 ± 0,60 18 2,57 ± 0,60 19 2,71 ± 0,61
2-е поколение (F2)
Контроль - 3 760 12 1,60 ± 0,46 7 0,93 ± 0,35 5 0,67 ± 0,30
6 726 13 1,79 ± 0,49 7 0,96 ± 0,36 6 0,83 ± 0,34
1-я группа 10 3 620 22 3,55 ± 0,74* 12 1,94 ± 0,55 12 1,94 ± 0,55
3э 640 13 2,03 ± 0,56 8 1,25 ± 0,44 6 0,94 ± 0,38
6 700 28 4,00 ± 0,74* 17 2,43 ± 0,58* 14 2,00 ± 0,53*
6э 715 15 2,10 ± 0,54 9 1,26 ± 0,42 7 0,98 ± 0,37
2-я группа 100 3 700 25 3,57 ± 0,70* 10 1,43 ± 0,45 14 2,00 ± 0,53*
3э 675 16 2,37 ± 0,58 8 1,1 ± 0,42 8 1,18 ± 0,42
6 649 29 4,47 ± 0,81** 18 2,77 ± 0,64* 16 2,46 ± 0,61*
6э 635 17 2,68 ± 0,64 7 1,10 ± 0,41 10 1,57 ± 0,49
1-я группа Восстано- вительный период 1 654 18 2,75 ± 0,64 10 1,53 ± 0,48 8 1,22 ± 0,43
2-я группа 1 690 21 3,04 ± 0,65 9 1,30 ± 0,43 12 1,74 ± 0,50
Примечание. э - животные, подвергавшиеся воздействию нефти только в эмбриональный период; * - p < 0,05 при t >1,96; ** - p > 2,58 при t > 2,58.
частота встречаемости клеток с аберрациями хромосом незначительно превышала спонтанный уровень. Увеличение общей частоты встречаемости аберрантных клеток происходило главным образом за счет клеток с аберрациями хроматидного типа. Аберрации хромосомного типа были представлены кольцами и парными фрагментами хроматидного типа - одиночными фрагментами, изохроматидными делениями (рис. 1). Этот факт свидетельствует о широком спектре мутагенного действия нефти, выступающей в качестве химического мутагена пролонгированного воздействия [5].
Полученные результаты исследований показывают, что хроническое ингаляционное воздействие на крыс летучими фракциями нефти в различных концентрациях вызывает значимое увеличение частоты встречае-
мости клеток с хромосомными аберрациями в костном мозге в ряду поколений (1,5-2,5 раза по сравнению со спонтанным уровнем). Помимо нарушений структуры хромосом, наблюдается увеличение частоты геномных изменений (анеуплоидии, полиплоидии) (рис. 2). Установлено максимальное мутагенное действие летучих фракций нефти в концентрациях 10 и 100 мг/л при длительном хроническом воздействии на протяжении трех поколений (F F2, F3). Полученные данные свидетельствуют о мутагенном эффекте летучих фракций нефти, что, вероятно, обусловливает потенциальную опасность для биологических объектов загрязнения окружающей среды в зоне интенсивной добычи и переработки нефти. Аналогичные результаты имеются в научной литературе [15].
72
Рис. 2. Полиплоидные клетки костного мозга крысы. Октоплоидный набор 4п = 168. Окраска по Романовскому-Гимзе. Ув. 900.
3 аключение
Нефть как загрязнитель окружающей среды обладает пролонгированным действием и представляет экологическую опасность в ряду поколений. Выявленное в результате проведенного исследования увеличение частоты встречаемости гипердиплоидных и полиплоидных клеток указывает на возможность перерождения клеток, т. е. развития злокачественных новообразований, что представляет канцерогенный риск для населения данного региона.
Полученные результаты свидетельствуют о реальной эколого-генетической опасности загрязнения природной среды нефтью и нефтепродуктами и необходимости проведения мониторинговых исследований, в частности генетического мониторинга.
Литер атур а
1. Бигалиев А. Б., Ищанова Н. Е., Виталиев А. А. // Материалы VI Международной науч.-практ. конф. «Тяжелые металлы и радионуклиды в окружающей среде». - Семей, 2010. - Т 1. -С. 66-69.
2. Гуцол А. А., Кондратьев Б. Ю. Практическая морфометрия органов и тканей / Под ред. Г. Г. Автандилова. - Томск: Изд-во Томского университета, 1988.
3. Дмитриев С. Г. // Экология. - 1997. - № 6. - С. 447-451.
4. Дубинин Н. П. Некоторые проблемы современной генетики.
- М., 1994.
5. ЕржановН. Т. // Материалы VI Международной науч.-практ. конф. «Тяжелые металлы и радионуклиды в окружающей среде». - Семей, 2010. - Т 2. - С. 374-376.
6. Ищанова Н. Е., Бигалиев А. Б. // Вестн. КазГУ Сер. экологическая. - 1998. - № 4. - С. 83-85.
7. Кенжегалиев А. К., Курмангалиев А. Экологическое состояние нефтегазовых месторождений Западного Казахстана. -Алматы: Гылым, 1998.
8. Крюков В. И. // Экология. - 1999. - № 4. - С. 309-312.
9. Рокицкий П. Ф. Введение в статистическую генетику. -Минск: Вышейшая школа, 1978.
10. Руководство по клинической лабораторной диагностике / Под ред. В. В. Меньшикова. - М., 1982.
11. Сериков Ф., Оразбаев Б. // Поиск. - 2002. - № 4. - С. 116122.
12. Чеботарев П. А., Апрасюхина Н. И., Яскевич В. В. и др. // Гиг. и сан. - 2003. - № 6. - С. 56-58.
13. Чеботарев А. Н., Бочков Н. П. // Генетика. - 2000. - Т. 37, № 6. - С. 848-853.
14. Шарипов И. К. Кариотип домашних и диких овец. - Алматы: Наука, 1989.
15. Rowler В. А., Gandley R. E., Conner E. A. // Mar. Environ. Res.
- 1989. - Vol.28, № 1-4. - P. 297-298.
Поступила 08.02.11
73
