CC BY
190
УДК 541.18.041.2:661.185
Е. М. Кулагина, Р. И. Юсупова, М. В. Потапова
ИССЛЕДОВАНИЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО ПОЛИАКРИЛАМИДА НА ТОКСИЧНОСТЬ И МУТАГЕННУЮ АКТИВНОСТЬ
Ключевые слова: полиакриламидные флокулянты, токсичность, мутагенная активность, грамположительные и
грамотрицательные бактерии.
Изучена токсичность и мутагенность модифицированного полиакриламида на суспензии грамположительных и грамотрицательных бактерий. Определены концентрации ПАА, при которых полимер не проявляет мутагенной активности и может использоваться в качестве флокулянта при очистке сточных вод.
Key words: polyacrylamide flocculants, toxicity, mutagenic activity, gram-positive and gram-negative bacteria.
Studied the toxicity and mutagenicity modified on polyacrylamide suspensions of gram-positive and gram-negative bacteria. The concentrations of PAA, in which the polymer does not exhibit mutagenic activity and may be used as a flocculant in wastewater treatment.
В последние десятилетия, особенно популярным стало использование полиакриламида (ПАА) и его производных, в качестве недорогих и эффективных флокулянтов для очистки сточных вод [1], возможно также применение в биотехнологии для интенсификации стадии выделения биомассы. При использовании полиакриламида, в качестве реагента для очистки сточных вод и седиментации микробных клеток в биосуспензиях [2,3] должна быть уверенность в их безопасности. Это значит, что полимер не должен проявлять токсичность и мутагенной активности.
Полиакриламид считается нетоксичным продуктом [4,5]. Однако при контакте он может вызвать раздражение глаз; при пролонгированном или повторном контакте с кожей - раздражение кожи и дерматит; при длительной или чрезмерной ингаляции - раздражение дыхательных путей, а при поглощении - раздражение пищевода. Вопросы токсичности всегда возникали при применении полиакриламидных материалов, что связано с деструкцией полимера или с присутствием в полимере неполимеризованного (остаточного) мономера - акриламида [6], поскольку акриламид является токсичным продуктом.
При поражении акриламидом возникают признаки и симптомы местного и системного действия. Местное действие выражается в раздражении кожи и мышечных мембран, характеризуется образованием волдырей и шелушением кожи пальцев рук и ног, их посинением. Системное действие включает воздействие на иммунную, центральную и периферическую нервные системы, при этом характерны чрезмерная утомляемость, сонливость, потеря памяти и головокружение. Признак общего воздействия - сильный отек конечностей. Акриламид в организме быстро и легко трансформируется. При оральном применении 10 мг/кг акриламида у крыс содержание его в крови сохранялось в течение 7 дней на уровне 12 % от исходной концентрации. В опытах in vitro было установлено, что акриламид ковалентно связывается с гемоглобином [7].
Связь токсичности полиакриламида с его деструкцией подтверждается в работе [8]. М. Errasfa и F. Russo-Marie установили, что инъецированный подкожно мышам полиакриламидный гель (BioGel P-4) притягивал нейтрофилы. Это приводило к клеточной миграции и ассимиляции протеина в месте воспаления, вызванного инъекцией [9].
Приведенные данные свидетельствуют, что ПАА не остается интактным в организме (не вовлеченным в физиологический процесс). Продукты взаимодействия ПАА со средой организма неизвестны.
Была поставлена задача: определить токсичность и мутагенность модифицированного
полиакриламида.
В работе использовался катионный полиакриламидный флокулянт немецкой фирмы BASF Sedipur CF-803 (КПАА), р = 56% -содержание ионогенных звеньев, ММ = 2700000 Da
CH.
-GH
с=о
NH
R
Рис. 1 - Структурная формула модифицированного полиакриламида
В качестве среды была использована суспензия грамположительных Bacillus subtilis B 917 и грамотрицательных бактерий Esherichia coli K 12 из коллекции промышленных микроорганизмов Казанского института биохимии и биофизики. Тестерным штаммом служила культура Salmonella typhimurium TA 98, генотип: his D3052, rfa, uvr-, pKm 101, bio-. Штамм ТА98 несет дополнительно плазмиду устойчивости к ампициллину pKm 101, а также ген umu C, что увеличивает вклад ошибочной репарации в процесс мутагенеза, и, следовательно, чувствительность штаммов [10]. Используемые среды: глюкозо-пептонная среда (ГПС): глюкоза - 5
г, пептон - 10 г, №С1 - 5 г, вода - 1000 мл, 2% глюкозо-пептонный агар (ГПА): ГПС + агар, 0,6% ГПА.
Для нахождения эффективной концентрации полимера был использован метод контроля изменения оптической плотности биосуспензии во времени, что определяет скорость седиментации [3]. Была найдена минимальная концентрация полимерного флокулянта, которая дает заметное ускорение седиментации равная 0,000125%.
Для определения токсичности исследуемого ПАА проводили оценку токсичности по отношению к тестерному штамму. За 15 часов до проведения эксперимента делали пересев ночной культуры тестерного штамма с косяка в 5 мл ГПС для получения «ночной» культуры. Предварительно, в ГПС добавляли ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. Разведения «ночной» культуры делали в стерильной водопроводной воде. В пробирки с 3мл полужидкого 0,6% ГПА вносили 0,1 мл бактериальной суспензии 10-5 разведения и 0,1 мл вещества в исследуемой концентрации. Раствор наслаивали на 2% ГПА в чашки Петри. В негативный контроль вместо вещества добавляли 0,1 мл стерильной дистиллированной воды. Подсчет колоний в опыте и контроле проводился после 24 часов инкубации при 37оС, после чего вычисляли «процент выживания» или степень токсичности вещества. Опыт проводили в 5ти повторностях.
Оггчшв ;«МВИШ= ----100 №
Для определения токсичности СБ-803 использовали тест на токсичность по отношению к микроорганизмам. Токсичность оценивалась у растворов СБ-803 следующих концентраций 0,01%, 0,001%, 0,0001%. Процент выживания составил 6%; 59,3%; 94,8% соответственно.
Оценка токсичности препарата по отношению к тестерным штаммам должна обязательно предшествовать проверке на мутагенность для исключения возможности получения
ложноотрицательных результатов в испытаниях на мутагенность. Степень токсичности исследуемого препарата может быть оценена из сопоставления числа колоний в опыте и контроле.
Рис. 2 - Зависимость «процента выживания» от концентрации КПАА
КПАА в концентрации 0,01% проявил токсичность в степени равной 16%, а в концентрации 0,001% - 51%, концентрация 0,0001% токсического действия не оказала (рис. 2).
Для определения мутагенной активности исследуемого ПАА и его метаболитов использовали тест Эймса [10]. Сущность метода заключается в том, что тестерные штаммы бактерий Salmonella typhimurium ТА98 культивируют на специальной среде, на которой могут расти лишь мутанты этих штаммов. Без внешних воздействий такие мутации происходят с низкой частотой. Если в среду культивирования внести химический мутаген, то частота мутаций значительно увеличивается, что регистрируется по числу колоний микроорганизмов, выросших на данной селективной среде. Метод дает возможность исследовать мутагенность как исходного препарата, так и его метаболитов. Метаболические превращения происходят в слое полужидкого агара, в которой вместе с культурой вносят микросомную фракцию, полученную из клеток печени мышей, предварительно обработанных индукторами монооксигеназ смешанных функций.
Культуру с косяка переносили петлей в 5мл ГПС и инкубировали при 37оС. В ГПС вносили ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. В день постановки эксперимента 5 мл «ночной» культуры переносили в 20 мл свежего ГПС и инкубировали с принудительной аэрацией в течение 2 часов. Затем культуру переносили в стерильные пробирки и центрифугировали 20 минут при 4400 об/мин. Осадок ресуспендировали в 0,02М фосфатном буфере. Растворы исследуемых препаратов готовили в стерильной дистиллированной воде.
Получали микросомную фракцию из клеток печени самцов мышей. Для активации ферментов использовали раствор фенобарбитала в воде. Промытую печень помещали в чашки Петри и измельчали ножницами при охлаждении, затем гомогенезировали в 0,25М растворе сахарозы, содержащем 1мМ ЭДТА (pH 7,4). Гомогенат стерильно при охлаждении центрифугировали при 9000g в течение 20 мин. Супернатант использовался в приготовлении микросомной активирующей смеси (МАС).
В пробирки разливали 0,6% верхний агар по 3 мл с микродобавками биотина и гистидина и ставили на водяную баню при 45оС. В верхний агар вносили 0,1 мл бактерильаной суспензии, 0,1 мл исследуемого соединения, и 0,5 мл МАС в случае с метаболической активацией. Все перемешивали и наслаивали на нижний селективный агар. Чашки переносили в термостат при 37оС. Негативным контролем (НК) служила стерильная дистиллированная вода. В качестве позитивного контроля (ПК) использовали нитрозометилмочевину (100 мкг/мл) в опытах без метаболической активации и в опытах с метаболической активацией - 2-аминофлуорен (30 мкг/мл). Учет результатов проводили через 48 часов инкубации. Сравнивали число колоний-ревертантов (колониеобразующие единицы КОЕ) в опыте и контроле.
Мутагенность оценивалась у растворов CF-803 следующих концентраций 0,01%, 0,001%, 0,0001%. Оценку мутагенной активности проводили по методике [11].
Если число колоний-ревертантов (колонии клеток - обратных мутантов, у которых полностью или частично восстанавливаются признаки исходного организма) в опыте и контроле достоверно различается менее чем в 2,5 раза, то делается заключение об отсутствии мутагенной активности. Если фиксируют превышение от 2,5 до 10 раз, то делается заключение о наличии мутагенной активности. Превышение от 10 до 100 раз говорит о средней мутагенной активности исследуемого соединения. Если фиксируют превышение более чем в 100 раз, - вещество обладает сильной мутагенной активностью.
Рис. 3 - Зависимость числа колоний-ревертантов от концентрации КПАА (без метаболической активации)
Как видно из рисунка 3 концентрация КПАА равная 0,01% обладает мутагенной активностью. Остальные концентрации мутагенной активности не проявили.
В тесте Эймса с метаболической активацией (рис. 4) концентрация КПАА равная 0,01% проявила себя как мутаген. При этом мутагенная активность данной концентрации оказалась сильнее, чем в аналогичных условиях без метаболической активации, что свидетельствует о более высокой мутагенной активности метаболитов, чем исходного соединения. Концентрации 0,001% и 0,0001% мутагенной активности не проявили.
Выводы
1. Показано, что при концентрации КПАА < 0,001% полимер не проявляет мутагенного и токсического действия.
2. Установлено, что метаболиты КПАА обладают более сильной мутагенностью, чем исходное соединение.
3. Возможно использование данного полиакриламида в качестве флокулянта.
Стоит особо указать, что для каждого случая применения полиакриламида необходима проверка на токсичность и мутагенность.
Литература
1. В.А. Мягченков, В.Е. Проскурина, Сополимеры акриламида с функцией флокулянтов. КГТУ, Казань, 2011. 296 с.
2. Е.М. Кулагина, Р.И. Юсупова, М.В. Потапова, Вестник Казанского технологического университета, 17, 10, 134 - 137 (2014)
3. Е.М. Кулагина, Р.И. Юсупова, М.В. Потапова, Вестник Казанского технологического университета, 18, 3, 59 -62 (2015)
4. F. Patty, Toxicology. Vol II, Intercilguep Publishers, New York, 1963. 1833р.
5. G. Doull, C.D. Klaassen, M.D Amdur, Acrylamide. Casarett and Doull's Toxicology. Macmillan Publishing Co, New York, 1980. 194 р.
6. D.J. King, R.R. Noss, Rev. Environ.Health, 8, 4, 3-16 (1989)
7. Acrylamide. TA:IARS Monographs on the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to humans, 60, 389-433 (1994)
8. Н.М. Перова. Автореф. дисс. канд. мед. наук,. I-й Моск. мед. ин-т им. И.М. Сеченова, Москва, 1977. 18с.
9. M. Errasfa, F. Russo-Marie, Agents Actions, 24, 2, 123-129 (1988)
10. B.N. Ames, F.D. Lee, W.E. Durston, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 3, 782 (1973)
11. Л.М. Фонштейн, Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем Методическое указание. Москва. 1985. 34 с.
Рис. 4 - Зависимость числа колоний-ревертантов от концентрации КПАА и его метаболитов (с метаболической активацией)
© Е. М. Кулагина - к.х.н., доцент кафедры физической и коллоидной химии института полимеров КНИТУ, [email protected]; Р. И. Юсупова - к.х.н., зав. лаб. той же кафедры; М. В. Потапова - к.х.н., доцент той же кафедры.
© E. M. Kulagina - associate Professor of physical and colloid chemistry, Institute of polymers KNRTU [email protected]; R. 1 Yusupova - head. lab. the same Department; M. V. Potapova - associate Professor of the same Department.
