CC BY
18УДК 57.086.833.4; 577.2 DOI: 10.37279/2224-6444-2020-10-3-39-42
ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОСАТЕЛЛИТНОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ В ПЕРВИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ НИЗКОДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ ГЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ
Ситковская А. О., Росторгуев Э. Е., Тимофеева С. В., Межевова И. В., Филиппова С. Ю., Шамова Т. В., Тимошкина Н. Н., Гвалдин Д. Ю.
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Минздрава России (ФГБУ «НМИЦ онкологии»), 344037, ул. 14-линия, 63, г. Ростов-на-Дону, Россия
Для корреспонденции: Ситковская Анастасия Олеговна, Лаборатория клеточных технологий, ФГБУ «НМИЦ онкологии», е-mail: grankina.anastasia@mail.ru
For correspondence: Sitkovskaya Anastasia O., Acting Head Cell technology laboratories, National Medical Research Center for Oncology, е-mail: grankina.anastasia@mail.ru
Information about authors:
Sitkovskaya A. O., https://orcid.org/0000-0002-6035-1756 Rostorguev E. E., https://orcid.org/0000-0003-4740-0274 Timofeeva S. V., https://orcid.org/0000-0002-5945-5961 Mezhevova I. V., https://orcid.org/0000-0002-7902-7278 Filippova S. Yu., https://orcid.org/0000-0002-4558-5896 Shamova T. V., https://orcid.org/0000-0002-4555-8556 Timoshkina N. N., https://orcid.org/0000-0001-6358-7361 Gvaldin D. Yu., https://orcid.org/0000-0001-8633-2660
РЕЗЮМЕ
Глиальные опухоли, в частности, состоящие из астроцитов, являются самой распространенной группой первичных опухолей головного мозга. Наиболее частой глиальной опухолью является астроцитома. Стандартно биологию глиальных опухолей изучали на иммортализованных клеточных линиях. Однако многочисленные пассажи приводят к потере клеточной гетерогенности. Поэтому все больше научных лабораторий в своих исследованиях начинают применять первичные клеточные линии, полученные непосредственно из нативного послеоперационного материала больного. Остается открытым вопрос о сроке генетической стабильности первичных клеточных линий. Особым типом генетической нестабильности является микросателлитная нестабильность, влияющая на микросателлиты, обнаруженные по всему геному. Микросателлиты имеют несколько аллелей, которые определяются изменением числа повторов единицы мотива. Микросателлитная нестабильность имеет большое значение в онкогенезе злокачественных новообразований. Целью работы было исследование микросателлитной нестабильности первичных клеточных линий низкодифференцированных глиальных опухолей на разных пассажах в сравнении с первичным опухолевым материалом больного. В качестве материала для исследования использовали опухолевые клетки первичных культур анапластической астроцитомы и глиобластомы на разных пассажах. В качестве контроля для микросателлитного анализа использовали залитые в парафин слайды, фиксированные формалином (FFPE). Микросателлитный анализ был выполнен на первичных культурах анапластической астроцитомы и глиобластомы с использованием следующих маркеров : D17S250, D2S123, D5S346, NR21, NR24, NR27, BAT25, BAT26 методом ПЦР В ходе микросателлитного анализа было показано, что первичные клеточные линии глиобластомы являются генетически более стабильными в сравнении с первичными клеточными линиями анапластической астроцитомы.
Ключевые слова: первичные клеточные линии глиальных опухолей, микросателлитная нестабильность.
RESEARCH OF MICROSATELLITE INSTABILITY IN PRIMARY CELL LINE LOW-DIFFERENTIED GLIAL TUMORS
Sitkovskaya A. O., Rostorguev E. E., Timofeeva S. V., Mezhevova I. V., Filippova S. Yu., Shamova T. V., Timoshkina N. N., Gvaldin D. Yu.
National Medical Research Center for Oncology, Rostov-on-Don, Russia
SUMMARY
Glial tumors, in particular those composed of astrocytes, are the most common group of primary brain tumors. The most common glial tumor is astrocytoma. The biology of glial tumors was routinely studied on immortalized cell lines. However, multiple passages result in a loss of cellular heterogeneity. Therefore, more and more scientific laboratories in their research are beginning to use primary cell lines obtained directly from the patient's native postoperative material. The question of the timing of the genetic stability of primary cell lines remains open. A special type of genetic instability is microsatellite instability, which affects microsatellites found throughout the genome. Microsatellites have
2020, т. 10, № 3
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
several alleles, which are determined by changes in the number of repetitions of a motif unit. Microsatellite instability is of great importance in the oncogenesis of malignant neoplasms. The aim of this work was to study the microsatellite instability of primary cell lines of poorly differentiated glial tumors at different passages in comparison with the patient's primary tumor material. Tumor cells of primary cultures of anaplastic astrocytoma and glioblastoma at different passages were used as material for the study. Formalin-fixed paraffin wax (FFPE) slides were used as a microsatellite control. Microsatellite analysis was performed on primary cultures of anaplastic astrocytoma and glioblastoma using the following markers: D17S250, D2S123, D5S346, NR21, NR24, NR27, BAT25, BAT26 by PCR. Microsatellite analysis has shown that primary glioblastoma cell lines are genetically more stable than primary anaplastic astrocytoma cell lines.
Key words: primary cell lines of glial tumors, microsatellite instability.
В последние годы исследованиям в области онкологии отводится особое место в области медицинских наук. В 2019 году в России стартовал национальный проект «Здравоохранение», особое место в структуре которого отводится федеральному проекту «Борьба с онкологическими заболеваниями».
Глиальные опухоли, в частности, состоящие из астроцитов, являются самой распространенной группой первичных опухолей головного мозга (50%) [1]. Наиболее частой глиальной опухолью является астроцитома. По уровню малигнизации астроцитарные злокачественные новообразования разделяются на: пилоид-ную (пилоцитарную) астроцитому, диффузную астроцитому, анапластическую астроцитому и глиобластому. К низкодифференцированным глиальным опухолям относят анапластическую астроцитому и глиобластому, при которой средняя продолжительность жизни составляет не более 15 месяцев [2].
Стандартно биологию глиальных опухолей изучали на иммортализованных (постоянных, бессмертных) клеточных линиях. Однако многочисленные пассажи приводят к потере клеточной гетерогенности, что дискредитирует данные о характере взаимодействия различных агентов на данные культуры клеток и затрудняет возможность их экстраполяции в клинические исследования [3]. Поэтому все больше научных лабораторий в своих исследованиях начинают применять первичные клеточные линии, полученные непосредственно из нативного послеоперационного материала больного [4]. Такие культуры клеток имеют ограниченное количество пассажей (8-12 пассажей) и сохраняют клеточную гетерогенность, характерную для опухоли in vivo [5]. Остается открытым вопрос о сроке генетической стабильности первичных клеточных линий.
Микросателлитные маркеры представляют собой полиморфные локусы ДНК с повторяющейся нуклеотидной последовательностью. Микросателлиты имеют несколько аллелей, которые определяются изменением числа повторов единицы мотива [6]. Принимая во внимание их мультиаллельные характеристики, они обладают
большей гетерозиготностью, чем однонуклео-тидные полиморфизмы [7]. Микросателлиты являются результатом вставок или делеций мотивов, возникающих из-за ошибок во время рекомбинации или репликации ДНК [8]. Особым типом генетической нестабильности является микросателлитная нестабильность (MSI), влияющая на микросателлиты, обнаруженные по всему геному [9]. MSI - имеют важное значение в онкогенезе злокачественных новообразований [10]. Таким образом, исследование MSI на первичных клеточных линиях глиальных опухолей даст понимание об их генетической стабильности в сравнении с опухолью больного.
Целью работы было исследование микроса-теллитной нестабильности первичных клеточных линий низкодифференцированных глиаль-ных опухолей на разных пассажах в сравнении с первичным опухолевым материалом больного.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В качестве материала для исследования использовали опухолевые клетки первичных культур анапластической астроцитомы и глио-бластомы на разных пассажах. В качестве контроля для микросателлитного анализа использовали залитые в парафин слайды, фиксированные формалином (FFPE). ДНК из слайдов выделяли с помощью набора для выделения ДНК GeneJET FFPE DNA Purification Kit (Thermo Scientific, США). ДНК из первично культивируемых клеток выделяли с помощью коммерческого набора (AmpliSens, Россия) согласно стандартному протоколу «Выделение ДНК из биологического материала животных» с дополнительным приложением для культивированных клеток.
Микросателлитный анализ был выполнен на первичных культурах анапластической астроци-томы и глиобластомы с использованием следующих маркеров: D17S250, D2S123, D5S346, NR21, NR24, NR27, BAT25, BAT26 методом ПЦР. Реакционная смесь для ПЦР в общем объеме 20 мкл содержала 10-20 нг ДНК, 0,175 мкМ каждого праймера, 15 мМ MgCl2, 2 мМ dNTP и 0,5U Taq-полимеразы. Условия реакции: 40 циклов при 94°С- 0,30 мин, 54°С - 0,30 мин и 70°С - 0,45 мин. Разделение ампликонов проводили с помо-
щью капиллярного гель-электрофореза (Applied Biosystems, Калифорния, США) в соответствии с протоколами производителя. Полученные данные были проанализированы с помощью пакетов программного обеспечения Gene Scan Analysis и Genotyper от Applied Biosystems.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Микросателлитный анализ первичных клеточных линий глиобластом на разных пассажах не выявил статистически значимых различий, по сравнению с контролем. Однако в результате анализа в первичной культуре клеток анапла-стической астроцитомы после шестого пассажа наблюдалось изменение в локусе D17S250 (148148/148-152) по сравнению с первичным материалом опухолевой ткани пациента.
Поскольку анапластическая астроцитома характеризуется высоким потенциалом злокачественности, то последующие изменения генотипа, вероятно, могут быть связаны с процессом малигнизации опухолевых клеток in vitro.
Тем не менее, глиобластома характеризуется наличием опухолевых клеток в терминальной стадии, и предположительно по этой причине при длительном культивировании изменений генотипа не наблюдалось.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в ходе микросателлитного анализа было показано, что первичные клеточные линии глиобластомы являются генетически более стабильными в сравнении с первичными клеточными линиями анапластической астроцитомы.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
Соблюдение этических норм. Работа была одобрена этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, протокол № 33/1 от 29.11.2018 г. Все пациенты подписывали информированное согласие.
ЛИТЕРАТУРА
1. Трашков А. П., Спирин А. Л., Цыган Н. В., Арте-менко М. Р, Печатникова В. А., Верлов Н. А. Глиальные опухоли головного мозга: общие принципы диагностики и лечения. Педиатр. 2015;6(4):75-84.
2. Cloughesy T. F., Cavenee W. K., Mischel P. S. Glioblastoma. From Molecular Pathology to Targeted Treatment. Annu Rev Pathol Mech Dis. 2014;9:1-25.
3. Zschenker O., Streichert T., Hehlgans S., Cordes N. Genome-wide gene expression analysis in cancer cells reveals 3D growth to affect ECM and processes
associated with cell adhesion but not DNA repair. PLoS ONE. 2012;7:e34279. doi: 10.1371/journal.pone.0034279
4. Allen M., Bjerke M., Edlund H., Nelander S., Westermark B. Origin of the U87MG glioma cell line: Good news and bad news. Sci. Transl. Med. 2016;8:354re353. doi: 10.1126/scitranslmed.aaf6853.
5. Межевова И. В., Ситковская А. О., Кит О. И. Первичные культуры опухолевых клеток : современные методы получения и поддержания in vitro. Южнороссийский онкологический журнал. 2020;1(3):36-49. doi:10.37748/2687-0533-2020-1-3-4.
6. Ellegren H. Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nat Rev Genet. 2004;5:435-450.
7. Wan Q. H., Wu H., Fujihara T., Fang S. G. Which genetic marker for which conservation genetics issue? Electrophoresis. 2004;25:2165-2176.
8. Anderson G. R., Brenner B. M., Swede H., Chen N., Henry W. M., Conroy J. M., Karpenko M. J., Issa J. P., Bartos J. D., Brunelle J. K., Jahreis G. P., Kahlenberg M. S., Basik M., Sait S., Rodriguez-Bigas M. A., Nowak N. J., Petrelli N. J., Shows T. B., Stoler D. L. Intrachromosomal genomic instability ib human sporadic colorectal cancer measured bygenome-wide allelotyping andin inter -(simple sequence repeat) PCR. Cancer Res. 2001;61:8274-8283.
9. Кит О. И., Водолажский Д. И., Колесников Е. Н., Тимошкина Н. Н., Ефимова И. Ю. Микросателлитная нестабильность как молекулярно-генетический маркер нарушения системы репарации ошибочно спаренных нуклеотидов при раке пищевода. Сибирский онкологический журнал. 2016;15(6):70-78. doi:10.21294/1814-4861-2016-15-6-70-78.
10. Canzian F., Salovaara R., Hemminki A., Kristo P., Chadwick R. B., Aaltonen L. A., de la Chapelle A. Semiautomated Assessment of Loss of Heterozygosity and Replication Error in Tumors. Cancer Res. 1996;56:3331-3337.
REFERENCES
1. Trashkov A. P., Spirin A. L., Tsygan N. V., Artemenko M. R., Pechatnikova V. A., Verlov N. A. Glial brain tumors: general principles of diagnosis and treatment. Pediatr. 2015;6(4):75-84. (In Russ).
2. Cloughesy T. F., Cavenee W. K., Mischel P. S. Glioblastoma. From Molecular Pathology to Targeted Treatment. Annu Rev Pathol Mech Dis. 2014;9:1-25.
3. Zschenker O., Streichert T., Hehlgans S., Cordes N. Genome-wide gene expression analysis in cancer cells reveals 3D growth to affect ECM and processes associated with cell adhesion but not DNA repair. PLoS ONE. 2012;7:e34279. doi: 10.1371/journal.pone.0034279
4. Allen M., Bjerke M., Edlund H., Nelander S., Westermark B. Origin of the U87MG glioma cell line: Good news and bad news. Sci. Transl. Med. 2016;8:354re353. doi: 10.1126/scitranslmed.aaf6853.
5. Mezhevova I. V., Sitkovskaya A. O., Kit O. I. Primary cultures of tumor cells: modern methods of
2020, т. 10, № 3
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
production and maintenance in vitro. South-Russian journal of oncology. 2020;1(3):36-49. doi:10.37748/2687-0533-2020-1-3-4. (In Russ).
6. Ellegren H. Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nat Rev Genet. 2004;5:435-450.
7. Wan Q.H., Wu H., Fujihara T., Fang S.G. Which genetic marker for which conservation genetics issue? Electrophoresis. 2004;25:2165-2176.
8. Anderson G. R., Brenner B. M., Swede H., Chen N., Henry W. M., Conroy J. M., Karpenko M. J., Issa J. P., Bartos J. D., Brunelle J. K., Jahreis G. P., Kahlenberg M. S., Basik M., Sait S., Rodriguez-Bigas M. A., Nowak N. J., Petrelli N. J., Shows T. B., Stoler D. L. Intrachromosomal genomic instability b human sporadic
colorectal cancer measured bygenome-wide allelotyping andin inter -(simple sequence repeat) PCR. Cancer Res. 2001;61:8274-8283.
9. Kit O. I., Vodolazhsky D. I., Kolesnikov E. N., Timoshkina N. N., Efimova I. Yu. Microsatellite instability as a molecular genetic marker of the violation of the mismatched nucleotide repair system in esophageal cancer. Siberian Journal of Oncology. 2016;15(6):70-78. doi: 10.21294/1814-4861-2016-15-6-70-78. (In Russ).
10. Canzian F., Salovaara R., Hemminki A., Kristo P., Chadwick R. B., Aaltonen L. A., de la Chapelle A. Semiautomated Assessment of Loss of Heterozygosity and Replication Error in Tumors. Cancer Res. 1996;56:3331-3337.
