CC BY
817
УДК Б1Б.831-00Б-07-092
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА
К.А. Колотов, О.В. Машковцев, Б.Н. Бейн, ГБОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия»
Колотов Константин Анатольевич - e-mail: 25.kolotov.ka@mail.ru
Проведено иммуногистохимическое исследование пяти гистологических вариантов церебральных глиом, имеюших различия по гистогенезу и степени малигнизации: диффузная астроцитома, анапластическая астроцитома, глиобластома, олигодендроглиома, анапластическая эпендимома. Верифицировались маркёры: кислый глиальный фибриллярный белок, виментин, белок S-100, основной белок миелина, белок супрессор p53, маркёр пролиферации КІ-Б7, маркёр активации эндотелия CD34, цитокератины (клон «пан»), эпителиальный мембранный антиген. Выполнено сравнение полученных иммуногистохимический реакций между изучаемыми опухолями, уточняющее диагностику основных видов глиальных новообразований.
Ключевые слова: глиомы головного мозга, гистологические формы, иммуногистохимия.
Immunohistochemical investigation of five histological variants of cerebral gliomas was made (diffuse astrocytoma, anaplastic astrocytoma, glioblastoma, oligodendroglioma, anaplastic ependymoma).
Markers: GFAP, vimentin, S-100 protein, MBP, p53, Ki-67, CD34, cytokeratins, EMA. The results were compared and some recommendations for immunohistochemical diagnostics of main types of glial tumors were done.
Key words: brain gliomas, histological forms, immunohistochemistry.
Глиомы представляют собой гетерогенную группу опу-■ холей нейроэпителиального происхождения и являются самыми частыми первичными новообразованиями головного мозга, составляя 40-45% всех интракраниальных бластом [1, 2]. Основные виды глиом: астроцитарные опухоли - развиваются из астроцитов; олигодендрогли-альные опухоли - из олигодендроцитов; эпендимарные опухоли - из клеток эпендимы; смешанные глиомы, такие как олигоастроцитома, содержат клетки разных типов глии [3, 4, 5].
В течение последних десятилетий для исследования глиальных новообразований широко используются иммуноги-стохимические методики (Coons et al., 1941, 1945), что подтверждается значительным количеством публикаций по различным аспектам данной проблемы [6-12]. Иммуногистохимия (ИПХ) (иммуноцитохимия) - это один из методов окраски биологических объектов, изучаемых под микроскопом. Их суть заключается в определении локализации антигенов в определённых компонентах тканей, типах клеток и клеточных структурах с помощью специфических антител; то есть иммунологические реакции «перенесены» на предметное стекло морфолога [13]. Обладая высокой достоверностью, иммуногистохимия позволяет уточнить глиальную природу новообразования и провести углублённый диагноз гистобиологических характеристик опухоли [1, 14].
Публикации, посвящённые иммуногистохимии неоплазм глиального происхождения, как правило, были посвящены анализу только одного гистологического типа глиом или группы опухолей, образующихся из одного ростка нейроглии, с применением одного или нескольких (2-3) маркёров. Таким образом, целенаправленное иммуногистохимическое изучение основных гистологических видов церебральных глиом, принадлежащих к разным росткам нейроглии, с верификацией спектра ИПХ-маркёров ранее не производилось и представляется актуальным.
Материал и методы
Выполнено иммуногистохимическое исследование операционных биоптатов у пяти пациентов с церебральными глиомами, имеющих различия по гистогенезу и степени малигнизации: астроцитарные опухоли - диффузная астроцитома, анапластическая астроцитома и глиобластома; олигодендроглиома; анапластическая эпендимома.
Методика ИПХ исследования. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм готовились на микротоме Leica (Германия), наносились на предметные стёкла, обработанные поли-L-лизином и подсушивались на нагревательном столике при 37°С в течение 10 часов. После депарафинирования и обезвоживания срезов производилась демаскировка антигенных детерминант кипячением в 0,1М цитратном буфере при pH 6,0 в течение 20 минут. В ряде случаев после обработки в ксилоле и спиртах срезы промывали в 0,1М фосфатном буфере (PBS-pH 7,4), обрабатывали 0,1% раствором трипсина на Tris-буфере (рН 7,6) в течение 30 мин. при 37°С во влажной камере. Далее следовала промывка в Tris.
Иммуногистохимическое исследование выполнялось с помощью системы стрептавидин-биотин (LSAB, DAKO). Чувствительность DAKO LSAB 2 Kit увеличивали за счёт удлинения времени инкубации на 6 и 8 этапах до 30 минут каждый. Заключение препаратов, окрашенных хромогеном DAB, который устойчив в органических растворителях, производили с помощью канадского бальзама. Использовали моно- и поликлональные первичные антитела к белкам промежуточных филаментов эпителиальных клеток (цитокератинам - ЦКР), к протеинам клеток мезенхимального происхождения (виментину), белку гена-супрессора р53, маркёру пролиферации Ki-67, а также другим специфическим для мозговой ткани белков (белок S100, кислый глиальный фибриллярный белок - КПФБ, основной белок миелина - MBP), к молекуле CD34 - маркёру активации эндотелия, эпителиальному мембранному антигену (ЭМА).
РИС. 1.
Диффузная астроцитома (протоплазматическая). Яркая равномерная позитивная реакция на КГФБ. х 200.
РИС. 2.
Анапластическая астроцитома. Яркая позитивная реакция на р53 в значительной части клеток. х 100.
РИС. 3.
Глиобластома. Экспрессия №-67 (позитивная реакция больше, чем в 10% опухолевых клеток). х 100.
РИС. 4.
Олигодендроглиома. Экспрессия МВР - яркая равномерная позитивная реакция, х 100.
'
• * v - , ■
-г S
... ....... ,
\ N
■ -V
РИС. 5.
Анапластическая эпендимома. Позитивная реакция на Сй34 в умеренном количестве кровеносных сосудов (обозначены стрелками). х 100.
В качестве негативного контроля срезы инкубировали с нормальной сывороткой животного, от которого были получены первые антитела, а также с PBS. Кроме того, проводили инкубацию первых антител со срезами тех тканей, в которых исследуемый антиген отсутствовал. Позитивным контролем служила нормальная ткань головного мозга человека (операционный материал). Гистологические препараты исследовались с помощью микроскопа Leica CTR 5000.
Характер ИПХ реакций оценивали визуально в баллах -методом «знаковой оценки - с учётом интенсивности окраски и процента окрашенных клеток (таблица 1). В каждом случае подсчитывали 200 клеток. Подсчёт индекса пролиферации Ki-67 выполняли с помощью системы для морфоме-трии на базе IBM PC Pentium 4 и пакета программ «Leica Qwin 3000 в 10 полях зрения каждого среза, при этом учитывались 500 клеток. Данные были обработаны статистически при помощи компьютера с определением доверительного интервала для средней, величины p (достоверность различий между изучаемыми группами).
Результаты исследования
Иммуногистохимическое изучение диффузной астроци-томы (протоплазматической) выявило яркую равномерную реакцию антител на кислый глиальный фибриллярный белок (КПФБ), являющийся маркёром клеток нейроглии (рис. 1). Зафиксирован низкий уровень пролиферации по Ki-67. ИПХ-реакция на белок р53 (верифицирует сверхэкспрессию мутированного гена-супрессора Р53) была неяркой позитивной. В диффузной астроцитоме констатировано наличие умеренного количества тонкостенных кровеносных сосудов без активации эндотелия, цитоспецифичным маркёром которого служит CD34.
При изучении иммуногистохимически окрашенного препарата анапластической астроцитомы определялась яркая равномерная позитивная реакция на КПФБ, белок S100, который является маркёром глиальных клеток, а также на белок промежуточных филаментов виментин. Уровень пролиферации по индексу Ki-67 составил более 5-7%. Установлена позитивная реакция в части клеток на p53 (рис. 2), а также на CD34 в умеренном количестве сосудов. МВР (Myelin Basic Protein - основной белок миелина) позитивен в отростках олигодендроцитов.
Исследование глиобластомы показало яркую позитивную реакцию на КПФБ, белок S100, виментин, p53. При этом КПФБ и S100 (маркёры глиальных клеток) негативны в сосудах, а виментин - позитивен (маркёр мезенхимальных клеток, шванновских клеток).
Индекс Ki-67 в глиобластоме значительно более 10% (рис. 3). Верифицирована позитивная реакция на CD34 в умеренном числе кровеносных сосудов с высоким эндотелием. На цитокератины (ЦКР) клона «пан» отмечена равномерная слабая реакция во всех туморозных клетках, что указывает на ко-экспрессию этих белков (встречается в глиобластомах). Известно, что антитела к цитокератинам (белки промежуточных филаментов эпителиальных клеток) выявляются также в различных нейроэктодермальных опухолях и новообразованиях мозговых оболочек.
При иммуногистохимическом анализе олигодендроглиома ярко позитивна на КПФБ и МВР (рис. 4), являющимся маркёром олигодендроглии, и неярко позитивна на белок S100. По Ki-67 установлена невысокая пролиферация -
около 5% опухолевых клеток реагируют позитивно, очагами. В некоторых клетках олигодендроглиомы был обнаружен «дикий» тип белка р53, то есть тот тип данного белка, который присутствует в норме.
Иммуногистохимическое изучение эпендимарной опухоли (анапластическая эпендимома) выявило позитивную реакцию на КГФБ, белок Б100 и виментин. Индекс пролиферации КІ-67 очагами равен 8-10%. Опухоль негативна на р53. Аналогично положительной реакции на цитокератины в глиобластоме, эпендимома неярко позитивна на другой «эпителиальный» маркёр - ЭМА (эпителиальный мембранный антиген). Верифицирована позитивная реакция на СЭ34 в умеренном количестве сосудов, располагающихся в центре периваскулярных розеток (рис. 5).
ТАБЛИЦА 1.
Критерии «знаковой оценки» иммуногистохимических реакций
% окрашенных клеток интенсивность реакции
отрицательная слабая умеренная выраженная
5G-1GG - + ++ +++
1G-5G - + ++ ++
G-1G - + + +
G - - - -
ТАБЛИЦА 2.
Результаты иммуногистохимических реакций при исследовании операционных биоптатов тканей удалённых церебральных глиом разных гистологических типов (данные Колотова К.А., 2012)
гистология глиомы головного мозга LO е белок S100 виментин Ki-67 3 m p Q_ CO s ««a- CO a «—> a_ < s
диффузная астроцитома +++ <1% + +
анапластическая астроцитома +++ ++ +++ 5-7% ++ + +
глиобластома +++ ++ +++ >1G% +++ + +
олигодендроглиома ++ + <5% + +++
анапластическая эпендимома ++ + + 8-1G% + +
Маркёры компонентов:
КГФБ - кислый глиальный фибриллярный белок; белок S100 -маркёр глиальных клеток; виментин - белок мезенхимальных и швановских клеток; Ki-67 - маркёр пролиферации клеток глии; белок р53 - супрессивный фактор митоза; MBP - myelin basic protein (основной белок миелина); CD34 - маркёр эндотелия сосудов; ЦРК - цитокератины, клон «пан»; ЭМА - эпителиальный мембранный антиген.
Резюмируя вышесказанное, во всех пяти исследуемых глиальных новообразованиях констатирована равномерная позитивная реакция на маркёр нейроглии КГФБ. При оценке синтеза белка р53 определяется положительная реакция во всех астроцитарных неоплазмах, причём с нарастанием степени злокачественности бластомы увеличивается количество опухолевых клеток с экспрессией данного белка. В олигодендроглиоме отмечена позитивная реакция на белок р53 лишь в некоторых туморозных клетках, тогда как при эпендимоме реакция на содержание онкосупрессора р53 была негативна.
При верификации экспрессии белка S100 установлена яркая равномерная позитивная реакция в анапластической астроцитоме и глиобластоме, тогда как в олигодендроглиоме и анапластической эпендимоме - неяркая равномерная реакция. Аналогично белку S100, анапластическая астроцитома и глиобластома проявляли равномерно яркий позитивный ответ на виментин, а анапластическая эпендимома -равномерно и неярко. На МВР - ИГХ-маркёр олигодендроглии - установлена выраженная равномерная позитивная
реакция в олигодендроглиоме. При других глиальных опухолях (анапластическая астроцитома) - могут быть позитивны отростки олигодендроцитов.
Уровень пролиферации по Ki-67 в астроцитарных неоплазмах нарастал с увеличением степени злокачественности новообразования. При изучении диффузной астороцитомы выявлена низкая степень пролиферации - индекс Ki-67 составил менее 1%. В анапластической астроцитоме на Ki-67 констатирована позитивная реакция больше, чем в 5% опухолевых клеток, а в глиобластоме - больше, чем в 10%.
В олигодендроглиоме индекс Ki-67 показал невысокий уровень пролиферации - реагируют позитивно около 5% туморозных клеток, в виде отдельных участков. В случаях анапластической формы индекс Ki-67 составлял 8-10%.
Заключение
Иммуногистохимическое исследование позволяет уточнить гистобиологический ва-риант глиальной опухоли. С целью верификации астроцитарной неоплазмы для подтвер-ждения её глиального происхождения следует проводить реакции на КГФБ, белок S100 и виментин, которые должны быть равномерно позитивными.
Для установления степени анаплазии бластомы необходимо изучать экспрессию маркёра пролиферации Ki-67 и белка-супрессора p53. Пограничным значением индекса Ki-67 в доброкачественной глиоме считается 5% (если индекс Ki-67 больше, то это указы-вает на анапластическую астроцитому или глиобластому). ИГХ-реакция на протеин p53 высоко позитивна в глиобластоме, вследствие суперэкспрессии данного белка мутантным геном. Также глиобластома показывает равномерную слабую положительную реакцию на цитокератины (ЦКР) клона «пан».
При изучении эпендимарной опухоли следует выполнять исследование на КГФБ, белок S100, виментин, реакция на которые должна быть равномерно позитивной. Также должна быть позитивная реакция на эпителиальный мембранный антиген (ЭМА), хотя в редких случаях злокачественных эпен-димом он может не выявляться. Выявление высоких показателей индекса Ki-67 указывает на наличие анапластической эпендимомы. Реакция на цитокератины (клон «пан») может быть слабоположительной либо негативной.
С целью ИГХ-верификации олигодендроглиомы, помимо исследования экспрессии специфических для мозговой ткани протеинов (КГФБ, белок S100), в панель маркёров необходимо включать MBP (основной белок миелина, myelin basic protein), показывающий яркую равномерную позитивную реакцию. На степень анаплазии олигодендроглиальной опухоли указывают реакции на Ki-67 и белок p53, которые нарастают при малигнизированных формах бластом.
Для оценки интенсивности васкуляризации глиального новообразования и пролиферации эндотелия (что характерно для глиобластомы), проводилось ИГХ-изучение содержания молекулы CD34, являющиеся маркёром эндотелия.
Выявленные особенности реакций клеток опухоли со стандартными антителами обобщены в таблице 2.
Найденные различия иммуногистохимических характеристик увеличивают точность патоморфологической диагностики подвидов глиом и их гистобиологических свойств. Эти данные играют определяющую роль при долговременном прогнозе жизни больных после комбинированного лечения церебральной опухоли.
ЛИТЕРАТУРА
1. Пальцев М. А. Атлас патологии опухолей человека / М. А. Пальцев, Н. М. Аничков. - М.: ОАО Издательство «Медицина», 2005. - 424 с.
2. Wen P. Y. Malignant gliomas in adults / P. Y. Wen, S. Kesari // N. Engl. J. Med.
- 2008. - Vol. 359 (5). - P. 492-507.
3. Мацко Д. Е. Новая классификация опухолей ЦНС Всемирной организации здравоох—ранения / Д. Е. Мацко // Нейрохирургия и неврология детского возраста. - 2007. - № 3. - С. 67-72.
4. Malignant astrocytic glioma : genetics, biology, and paths to treatment / F. B. Furnari [et al.] // Genes. Dev. - 2007. - Vol. 21 (21). - P. 2683-2710.
5. The 2007 WHO Classification of Tumors of the Central Nervous System / D. N. Louis [et al.] // Acta Neuropathol. - 2007. - Vol. 114. - P. 97-109.
6. Иммуногистохимический анализ глиофибриллярного кислого белка в оценке астроглиальной реакции при экспериментальной глиоме С6 / Г. М. Юсубалиева [и др.] // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2010.
- № 1. - С. 17-22.
7. Коршунов А. Г. Иммуногистохимическое изучение экспрессии онкобелка p53 в астроцитарных глиомах больших полушарий головного мозга / А. Г. Коршунов, Р. В. Сычёва // Архив патологии. - 1996. - № 6. - С. 37-42.
8. Коршунов А. Г. Экспрессия глиального фибриллярного кислого белка и белка S-100 в астроцитарных глиомах головного мозга различной степени
злокачественности (иммуногистохимическое исследование) / А. Г. Коршунов, Р. В. Сычёва // Архив патологии. - 1995. - № 4. - С. 30-38.
9. Прогностическое значение иммуногистохимического выявления апопто-за и экспрессии белков лекарственной устойчивости в глиобластомах больших полушарий головного мозга / А. Г. Коршунов [и др.] // Архив патологии.
- 2000. - № 1. - С. 7-11.
10. Прогностическое значение онкоассоциированных белков и апоптоза в глиобластомах больших полушарий головного мозга / А. Г. Коршунов [и др.] // Вопросы нейрохирургии. - 1999. - № 1. - С. 3-7.
11. Prognostic Value of Mdm2, p53 and p16 in Patients with Astrocytomas / S. M. Ranuncolo [et al.] // Journal of Neuro-Oncology. - 2004. - Vol. 68 (2). - P. 113-121.
12. Torp S. H. Diagnostic and prognostic role of Ki-67 immunostaining in human astrocytomas using four different antibodies / S. H. Torp // Clin. Neuropathol. -2002. - Vol. 21 (6). - P. 252-257.
13. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / под ред. С. В. Петрова, Н. Т. Райхлина. - 2-е изд., доп. и перераб. - Казань, 2000. - 288 с.
14. Олигодендроглиальные опухоли: иммуногистохимические особенности и химиотерапия (краткий обзор литературы) / В. Е. Олюшин [и др.] // Неврологический вестник. - Казань, 2008. - Т. XL, № 1. - С. 77-80.
