CC BY
8МРНТИ: 34.27.17
А С. ЛАТИФ1, А.А. САПАРБЕКОВА1*, З.Р. АХМЕДОВА2, Г. КАЛДЫБЕКОВА1,
Г.О. КАНТУРЕЕВА1 1Южно-Казахстанский университет им. М. Ауезова, Шымкент, Казахстан 2Институт микробиологии Академии наук Республики Узбекистан,
Ташкент, Узбекистан *е-шаП:а1ш1га.8арагЬекоуа@шаП.ги
ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОБНОЙ АДГЕЗИИ К РАСТВОРИТЕЛЯМ И УСТОЙЧИВОСТИ АБОРИГЕННЫХ ШТАММОВ 8ЛССИЛКОМУСЕ8 СЕЯЕШЫЕ К РАЗНЫМ ЗНАЧЕНИЯМ рH
Сок 10.53729/MV-AS.2023. 02.14
Аннотация
Из 180 штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выделенных из различных растительных субстратов, по предварительно изученным технологическим параметрам, такие как скорость сбраживания и органолептическим показателям ферментированных фруктовых соков отобрано 15 штаммов. Отобранные штаммы изучены на способность к выживанию при низких значениях рН и обладающих высокой микробной адгезией к органическим растворителям.
Семь штаммов дрожжей (ВВ-5, ББ-32, У88-2, Ле- 12, А1-06, 01-8, АЬ-13) показали наиболее высокий процент по микробной адгезии к органическим растворителям. Самая высокая толерантность к низким значениям рН=3 с индексом роста> 90% обнаружена у 4 штаммов, идентифицированных как Saccharomyces cerevisiae Л1-06 (из винограда), Saccharomyces cerevisiae 01 -8 (из сока сахарного сарго), Saccharomyces cerevisiae ВВ-5 (из сока вишни) и Saccharomyces cerevisiae Ле- 12 (из гранатового сока). Эти штаммы демонстрируют лучшие характеристики, а один из протестированных штаммов Saccharomyces cerevisiae Ле- 12 потенциально может использоваться для производства пищевых добавок, функциональных пищевых напитков, а также в качестве пробиотика для терапевтических целей.
Ключевые слова: пробиотики, ферментация, фруктовые соки, микробная адгезия, индекс
роста.
В настоящее время население Казахстана, как и во всем мире, заинтересовано в правильном питании, в потреблении полезных продуктов, в том числе и содержащих пробиотики, в связи с чем исследования, сосредоточенные на поиске новых пробиотических микроорганизмов, становятся актуальными. Для приготовления ферментированных функциональных продуктов используют чистые жизнеспособные штаммы микроорганизмов, идентифицированные и охарактеризованные как пробиотические культуры [1].
Ферментированные пробиотические продукты можно употреблять в качестве источника питания, а также для поддержания здоровой микробиоты кишечника [2]. Функциональные фруктовые или овощные напитки содержат субстраты, необходимые для приготовления продукта с внесением культур или консорциума штаммов, используемых для проведения ферментации, поэтому эти напитки можно рассматривать как здоровую рецептуру синбиотических продуктов [3, 4]. В результате растет спрос на немолочные пробиотические продукты, которые удовлетворяют потребности людей с диетическими ограничениями в отношении молочных продуктов. Согласно текущему отчету о состоянии рынка от 20 июля 2022 г., глобальный рынок молочных альтернатив оценивается в 27,3 млрд долларов США в 2022 году и, согласно прогнозам, достигнет 44,8 млрд долларов США к 2027 году, что означает среднегодовой темп роста в 10,4% в финансовом выражении
[5].
Молочные заменители используются в продуктах питания и напитках, не содержащих лактозу, поэтому такие продукты могут быть рекомендованы людям с непереносимостью этого углевода.
В настоящее время, благодаря этим преимуществам, пробиотики становятся все более востребованными, и обычно их принимают перорально, в виде лекарственных препаратов или с продуктами питания [6]. Для включения в категорию пробиотиков микроорганизмы должны быть отобраны на основе определенных критериев, таких как рост при температуре тела (37 °C), устойчивость к антибиотикам [7,8], выживаемость в неблагоприятной среде кишечника человека (например, пищеварительные ферменты, низкий рН), адгезия к эпителиальным клеткам кишечника и высокая гидрофобность поверхности [9]. Дрожжи широко распространены в пищевой промышленности, где используются в качестве закваски для производства ферментированных пищевых продуктов и напитков, таких как хлеб, вино и пиво [10]. На сегодня пробиотическая способность дрожжей недостаточно изучена. Saccharomyces cerevisiae var. boulardii— единственные дрожжи, признанные и фактически применяемые как пробиотики [11].
Многие исследователи сосредоточились на штаммах дрожжей как Saccharomyces, так и не-Saccharomyces [12, 13] как хорошей альтернативе пробиотическим бактериям, поскольку они могут оказывать новое профилактическое или терапевтическое действие на хозяина, будучи частью микробиоты кишечника [14]. Стимуляция иммунной системы, деградация и устранение бактериальных токсинов из-за протеазной активности дрожжей или препятствования прикрепления бактерий к эпителиальным клеткам желудочно-кишечного тракта являются одними из потенциальных механизмов, используемых дрожжами для защиты человека от патогенных микроорганизмов [15].
Учитывая отсутствие знаний о пробиотических свойствах местных дрожжей, целью данного исследования была изучение местных штаммов S. cerevisiae. Для выделения штаммов с полезным для здоровья потенциалом проведен предварительный скрининг 180 аборигенных штаммов S. cerevisiae, выделенных из различного растительного сырья, из которых отобраны 15 штаммов для выявления пробиотической способности по устойчивости к условиям желудочно-кишечного тракта (рН, температура) и гидрофобности.
Объекты и методы исследования
В данной работе изучено 15 аборигенных штаммов S. cerevisiae (отобранных из 180), выделенных из растительного сырья, в том числе из винограда, вишни, абрикоса, граната, яблок, хорошо растущих и плодоносящих в Туркестанской области.
Перед каждым экспериментом штаммы дрожжей выращивали в YPD (производитель Titan, Biotech LTD, India). Культуры инкубировали в аэробных условиях при 37±2°C и 26±2°C (как положительный контроль) в течение 48 часов. Все эксперименты проводились в трех повторностях.
Гидрофобность поверхности клеток дрожжей.
Гидрофобность поверхности клеток достаточно вариабельный признак и привязана не только к методике измерения, но и к условиям роста, аэрации и возрасту клеток. Высоко гидрофобные микроорганизмы хорошо адгезируются на масляных капельках после смешивания.
Гидрофобность определяли, как способность штаммов дрожжей прилипать к углеводородам и выражали как относительную микробную адгезию к растворителям (МАкР) в соответствии с протоколом, описанным Chelliah R. [16] с некоторыми изменениями. МАкР определяли по оптической плотности (ОП) с использованием спектрофотометра Varian Cary-50, имеющий оптический диапазон 190-1100 нм. Основной задачей технического решения является совершенствование способа оценки концентрации свободных и связанных микробных клеток в суспензии, направленного на увеличение
скорости анализа, снижение его трудоемкости и себестоимости, а также уровня погрешности.
Культуры дрожжей в стационарной фазе (инкубированные в бульоне YPD в течение 48 ч) концентрировали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин, дважды промывали калий-фосфатным буфером (КФБ) 0,1 М, рН 7,4 и снова суспендировали в 3 мл того же буферного раствора. Оптическую плотность (ОП) суспензии при 600 нм доводили с помощью КФБ (рН 7,4) до значения 1,0 (Ао).
К 1 мл этой суспензии (5,2*106клеток/мл) добавляли 0,2 мл толуола и перемешивали в течение 2 мин. После 1 ч инкубации при 30±2°С водную фазу удаляли из верхнего слоя растворителя, содержащего клетки, и снова определяли ОП при 600 нм (А1).
МАкР рассчитывался как:
МАкР = [(Ао-А1)/А0] х100%
Ао - ОП (оптическая плотность при 600 нм) суспензии после обработки буферным раствором;
А1 - ОП (оптическая плотность при 600 нм) суспензии после обработки толуолом;
Устойчивость штамма к разным значениям рН.
Этот эксперимент проводился путем инкубации приблизительно 5,2*106 клеток/мл каждого штамма в среде YPD, доведенного до различных значений рН (2,5, 3,0, 3,5, 4,0 и 7,2), при 37±2°С. Для подкисления использовался 6N раствор НС1. Рост дрожжей оценивали через 24 часа инкубации по поглощению при 600 нм. Анализы выполнены в трех повторностях, данные обработаны как индекс роста (ИР) в соответствии с Bevilacqua А. [17]. Этот метод определения концентрации микробных клеток в суспензии по ОП увеличивает скорость анализа во много раз по сравнению с применяемыми сегодня способами и не требует наличия для его выполнения специализированного дорогостоящего оборудования.
ИР = ^^с)*100%,
где: Аьзз — поглощение образцов при различных рН, тогда как
Absc — поглощение положительного контроля.
Значения индекса роста были классифицированы следующим образом:
ИР < 50 %: Ингибирование дрожжей
50 % < ИР< 75 %: Частичное ингибирование
ИР > 75 %: Рост подобен контролю.
Результаты и обсуждение
Основной целью данной работы был селективный отбор дрожжей с высокой микробной адгезией к органическим растворителям и устойчивые к кислой среде для предварительной оценки их пробиотических способностей.
Размеры исследуемых одиночных клеток варьировали по ширине в среднем от 4,5 мкм до 9 мкм и по длине - от 5,0 до 10 мкм. Форма - преимущественно округлые, овальные, удлиненные. Температура является важным физическим параметром для оценки пробиотической способности микроорганизма. В этом исследовании эксперименты проводились при 370 С, близкой к температуре человеческого тела, и все 15 выделенных штаммов могли расти при 370С. Эти результаты согласуются с предыдущими сведениями о способности пробиотических штаммов дрожжей расти при температуре тела человека и подтверждают, что местные штаммы дрожжей могут быть интересным источником для отбора новых потенциальных пробиотических штаммов.
Гидрофобность определяли как взаимодействие между микробными клетками и клетками-хозяевами, опосредованное белками клеточной поверхности и липотейхоевыми кислотами [13]. Как следствие, это один из основных критериев отбора штаммов с
потенциальной пробиотической активностью, поскольку микробный штамм, входящий в категорию пробиотиков, должен обладать способностью прикрепляться к слизистой оболочке кишечника для колонизации и модуляции иммунной системы против патогенов. [18]. Гидрофобную способность выражали как микробную адгезию к растворителям МАкМ, используя толуол в качестве растворителя.
Гидрофобная способность дрожжей показана в таблице 1.
Таблица 1 - Гидрофобная способность и устойчивость штаммов дрожжей при различных рН
№ Микроорганизм (Источник) МАкР (%) ИР (%), рН 3,0 ИР (%), рН 2,5
1 S. cerevisiae ZPt-14 12,25 50-75 <50
2 S. cerevisiae VIs-1/14 27,34 >75 50-75
3 S. cerevisiae Al-06 85,23 >75 >75
4 S. cerevisiae Spt-18 45,32 50-75 <50
5 S. cerevisiae VSs-2 78,48 >75 >75
6 S cerevisiae KRs-7 69,75 50-75 <50
7 S. cerevisiaeGl-8 86,78 >75 >75
8 S cerevisiae BB-5 85,43 >75 >75
9 S. cerevisiae BB-32 78,65 >75 50-75
10 S cerevisiae VVs-72 65,78 >75 50-75
11 S.cerevisiae Az- 12 92,75 >75 >75
12 S. cerevisiae Nur-22 65,87 >75 50-75
13 S. cerevisiae Ab-13 78,35 50-75 <50
14 S. cerevisiae Vs-1 67,85 >75 >75
15 S. cerevisiae VGz-4 74,45 >75 50-75
Результаты показали, что только три штамма (ZPt-14, VIs-1/14, Spt-18) проявили менее 50% МАкР (слабая гидрофобная активность), в то время как большинство штаммов (8) показали МАкР в диапазоне от 50 % до 85%. Четыре штамма (BB-5, Az- 12, Al-06, Gl-8) показали самый высокий процент МАкР - более 85 %. Наибольшая гидрофобная активность выявлена у штамма S.cerevisiae Az- 12 и составляла 92,75%.
Пробиотики должны выдерживать суровые условия при прохождении через кишечный тракт [11]. С целью оценки способности тестируемых дрожжей выживать при pH желудочно-кишечного тракта определялась устойчивость штаммов дрожжей при различных значениях pH (2,5, 3,0, 3,5, 5,0 и 7,2). Все штаммы демонстрировали хороший рост (ИР > 75%) при рН 3,5, 5,0 и 7,2, тогда как самые низкие значения рН (2,5 и 3,0) сильно влияли на рост отдельных штаммов дрожжей.
Нужно отметить, что большинство испытанных штаммов дрожжей выдерживали низкие значения рН; так, все штаммы хорошо росли при рН=5, однако при рН 2,5 четыре штамма (ZPt-14, Spt-18,KRs-7, Ab-13) ингибировались (ИР< 50%), 5 штаммов (VIs-1/14, BB-32,VVs-72, Nur-22, VGz-4) проявляли частичное ингибирование (50% < ИР< 75%), тогда как только 6 штаммов (Al-06, VSs-2, Gl-8, BB-5, Az- 12, Vs-1) проявляли достаточно хорошую устойчивость к низким значениям рН ( ИР> 75%).
Самая высокая толерантность к низким значениям pH=3 с ИР> 90% была обнаружена у 4-х штаммов - S. cerevisiae Al-06, S. cerevisiae BB-5, S.cerevisiae Az- 12 и S.cerevisiae Gl-8.
Штаммы S.cerevisiae Az-12, S. cerevisiae BB-32 и S. cerevisiae ZPt-14 исследовали под микроскопом с использованием сканирующего электронного микроскопа JSM-6490LM с системой энергодисперсионного рентгеновского микроанализа Energy INCA 350 и системой HKL Basic (рисунок 1).
S.cerevisiaeAz- 12
ИР (%) рН 2,5>90
S. cerevisiae BB-32
ИР(%) рН 2,5 = 50-75
9 mW fc f Л" Шк p
уЧЬЩ i
1 . м Mt
20kV X2.500 Юмш 10 62 30Pa
S. cerevisiae ZPt-14
ИР (%) рН 2,5 <50
Рисунок 1 - Устойчивость дрожжей к кислым условиям
Так, воздействие кислоты с рН=2,5 резко снизило рост дрожжевых клеток у штамма S. cerevisiae ZPt-14 (ИР (%) рН 2,5 <50). Здесь наблюдается значительное снижение жизнеспособных клеток за счет частичного или полного повреждения и лизирования клеточных стенок. S. cerevisiae BB-32 был менее подвержен воздействию кислоты ИР (%) рН 2,5 = 50-75.
Высокую устойчивость к кислым условиям проявил штамм S.cerevisiae Az-12, который в дальнейшем может быть рекомендован для производства функциональных ферментированных пищевых продуктов.
Устойчивость к кислым условиям неудивительна, поскольку штаммы, изучаемые в этой работе, были выделены из среды с низким pH, такой как, фруктовые соки.
Заключение
Местные штаммы Saccharomyce scerevisiae, протестированные в этом исследовании, выделенные из различного растительного сырья, продемонстрировали достаточно высокий уровень пробиотических признаков, доказывая, что местные дрожжи представляют собой интересный источник для селекции новых пробиотических штаммов. Все 15 штаммов S.cerevisiae, ранее протестированные на параметры, представляющие технологический интерес, могут быть использованы в качестве заквасочных культур для производства ферментированных напитков. Данные штаммы были отобраны как наиболее перспективные, так как они способны быстро сбраживать соки. Ведущим фактором являлись органолептические показатели готового ферментированного продукта: естественный фруктовый запах и сладкий, слегка кисловатый вкус, без появления помутнений. S. cerevisiae Al - 06, S. cerevisiae BB-5, S. cerevisiae Az - 12 и S. cerevisiae Gl-8 показали многообещающую пробиотическую активность, так индекс роста при рН=2,5 у данных культур >90; кроме того семь штаммов (BB-5, BB-32, VSs-2, Az-12, Al-06, Gl-8, Ab-13) показали самый высокий процент МАкР. В частности, штамм S.cerevisiae Az- 12 выделенный из гранатового сока можно считать штаммом, демонстрирующим наилучшее сочетание пробиотических и полезных свойств.
Литература:
1 Dahiya D., Nigam P.S. Probiotics, Prebiotics, Synbiotics and Fermented Foods as Potential Bioticsin Nutrition Improving Health via Microbiome-Gut-Brain Axis. Fermentation, 2022, 8 (7): 303.
2 Hill C., Guarner F., Reid G., Gibson G.R., Merenstein D.J., Pot B., Morelli L., Canani R.B., Flint H.J., Salminen S., Calder P.C. and Sanders M.E. Expert Consensus Document: The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics Consensus Statement on the Scope and Appropriate Use of the Term Probiotic. Nature Reviews Gastroenterology &Herpetology, 2014, 11: 506-514.
3 Dahiya D., Nigam P.S. Functional Foods with Prebiotics Can Sustain Wellness and Alleviate Certain Ailments like Gut-Inflammation and Colon-Cancer. Microorganisms, 2022, 10(3): 665.
4 Markowiak P., Slizewska K. Effects of Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics on Human Health. Nutrients, 2017, 9(9): 1021.
5 Markets and Markets Dairy Alternative (Milk) Market by Type (Soy, Almond, Rice), Formulation (Plain, Flavored, Sweetened, Unsweetened), Channel (Supermarket, HealthStore, Pharmacy, Convenience Store) & Geography—Global Trends & Forecastto 2018. Availableonline: https://www.marketsandmarkets.com/Market-Reports/dairy-alternative-plant-milk-beverages-market677.html (accessedon 3 March 2020).
6 Rodríguez P.F.-P.; Arévalo-Villena M., Rosa I.Z., Pérez A.B. Selection of potential non-Sacharomyces probiotic yeasts from food origin by a step-by-step approach. Food Research International, 2018, 112:143-151.
7 McFarland L.V. From yaks to yogurt: the history, development, and current use of probiotics. Clinical Infectious Diseases, 2015, 60: 85-90.
8 Boulangé C., Neves A., Chilloux J., Nicholson J., Dumas M. Impact of the gut microbiota on inflammation, obesity, and metabolic disease. Genome Medicine, 2016, 8: 42.
9 Fijan, S. Microorganisms with Claimed Probiotic Properties: An Overview of Recent Literature. Environmental Reserch and Public Health, 2014, 11: 4745-4767.
10 Oniszczuk A., Oniszczuk T., Gancarz M., Szymanska J. Role of Gut Microbiota, Probiotics and Prebiotics in the cardiovascular diseases. Molecules, 2021, 26: 1172.
11 Amara A.A., Shibl A. Role of Probiotics in Health Improvement, Infection Control and Disease Treatment and Management. Saudi Pharmaceutical Journal, 2015, 23: 107-114
12 Perricone M., Bevilacqua A., Corbo M.R., Sinigaglia M. Technological Characterization and Probiotic Traits of Yeasts Isolated from Altamura Sourdough to Select Promising Microorganisms as Functional Starter Cultures for Cereal-Based Products. Food Microbiology, 2014, 38: 26-35.
13 Arévalo-Villena M., Fernández-Pacheco P., Castillo N., Bevilacqua A., Briones A. Probiotic capability in Saccharomyces yeasts: Set-up of a screening method. LWT-Lebensmittel-Wissenschaft + [i.e. und] Technologie, 2018, 89: 657-665.
14 Cordonnier C., Thévenot J., Etienne-Mesmin L., Denis S., Alric M., Livrelli V., Blanquet-Diot S. Dynamic In Vitro Models of the Human Gastrointestinal Tract as Relevant Tools to Assess the Survival of Probiotic Strains and Their Interactions with Gut Microbiota. Microorganisms, 2015, 3(4): 725-745.
15 Neffe-Skocinska K., Rzepkowska A., Szydlowska A., Kolozyn-KrajewskaChelliah D. Chapter 3 -Trends and Possibilities of the Use of Probiotics in Food Production. Alternative and Replacement Foods, 2018: 65-94.
16 Chelliah R., Ramakrishnan S.R., Prabhu P.R.; Antony U. Evaluation of antimicrobial activity and probiotic properties of wild-strain Pichia kudriavzevii isolated from frozen idli batter. Yeast. 2016, 33: 385-401.
17 Bevilacqua A., Perricone M., Cannarsi M., Corbo, M.R., Sinigaglia, M. Technological and spoiling characteristics of the yeast microflora isolated from Bella Di Cerignola table olives. Int. J. Food Sci. 2009, 44: 2198-2207.
18 Lichtenstein L., Avni-Biron I., Ben-Bassat O. Probiotics and Prebiotics in Crohn's Disease Therapies. Best Practice Reserch Clinical Gastroenterology, 2016, 30: 81-88.
А С. ЛАТИФ1, А.А. САПАРБЕКОВА1*, З.Р. АХМЕДОВА2, Г. КАЛДЫБЕКОВА1,
Г.О. КАНТУРЕЕВА1
1М.Эуезов атындагы Ощуспк ^азакстан университетi, Шымкент, ^азакстан 2Микробиология инстуты гылым Академиясы Эзбекстан Республикасы,
Ташкент, Эзбекстан *e-mail:[email protected]
SACCHAROMYCESCEREVISIAE АБОРИГЕНД1 ШТАМДАРДЬЩ ЭРТYРЛI рН МЭНДЕР1НЕ Т0З1МД1Л1Г1Н ЖЭНЕ ЕР1ТК1ШТЕРГЕ ДЕГЕН МИКРОБТЫ
АДГЕЗИЯСЫН ЗЕРТТЕУ
ТYЙiн
ЭртYрлi ес1мд1к субстратынан белшш алынган, Saccharomyces cerevisiae ашыткысыныц 180 штамы, ашыту жылдамдыгы жэне ферменттелген жемiс шырындарыныц органолептикалык керсеткiштерi секiлдi, алдын-ала технологиялык параметрлерi зерттелген, 15 штамм iрiктелiп алынды. Iрiктелiп алынган штамдар рН-тыц темен мэндерiнде емiршендiгiнiц кабшетшп жэне органикалык ерiткiштерге деген микробтык адгезиясыныц жогары болу кабшетшп тексерiлдi.
(BB-5,BB-32 , VSs-2, Az- 12, Al-06, Gl-8, Ab-13) жет штамм органикалык ериташтерге деген микробтык адгезиясы бойынша ец жогары пайыз керсеттi. рН=3 темен мэнiне тезiмдiлiгi аса жогары, есу индекс > 90% жогары 4 штамда аныкталды, дэлiрек айтсак S. cerevisiae Al-06, S. cerevisiae BB-5, S.cerevisiae Az- 12 жэне S. cerevisiae Gl-8.
Нэтижесшде 4 штамм iрiктеп алынды, олар ашыткыныц келесщей штамдары болып аныкталды, Saccharomyces cerevisiae Al-06 (жYзiмнен белiнiп алынды), Saccharomyces cerevisiae Gl -8 (кант соргосыныц шырынынан белiнiп алынды), Saccharomyces cerevisiae BB-5 (шие шырынынан белшш алынды) жэне Saccharomyces cerevisiae-Az- 12 (анар шырынынан белшш алынды). Б^л штамдар ете жаксы сипаттамага ие болды, ал тестен еткен штамныц бiреуi Saccharomyces cerevisiae-Az- 12, пробиотик ретiнде эртYрлi колданыстарда, тагам коспасы ретiнде, функционалды тагам сусындарын ендiру Yшiн немесе терапиялык колданыс Yшiн пробиотик ретiнде колдануга болады.
Кштп сездер: пробиотиктер, ферментация, жемiс шырындары, микробты адгезия, есу индексi.
IRSTI: 34.27.17
A.S. LATIF1, A.A. SAPARBEKOVA1*, Z.R. AKHMEDOVA2, G. KALDYBEKOVA1,
GO. KANTUREEVA1 1M. Auezov South Kazakhstan University, Shymkent, Kazakhstan 2Institute of Microbiology of the Academy of Sciences of the Republic of Uzbekistan,
Tashkent, Uzbekistan *e-mail: [email protected]
STUDY OF MICROBIAL ADHESION TO SOLVENTS AND RESISTANCE OF ABORIGINAL STRAINS SACCHAROMYCES CEREVISIAE TO DIFFERENT PH VALUES
doi: 10.53729/MV-AS.2023. 02.14
Abstract
From 180 strains of Saccharomyces cerevisiae yeast isolated from various plant substrates, 15 strains were selected according to previously studied technological parameters such as digestion rate and organoleptic characteristics of fermented fruit juices. The selected strains were tested for their ability to survive at low pH values and having high microbial adhesion to organic solvents.
Seven strains (BB-5, BB-32, VSs-2, Az-12, Al-06, Gl-8, Ab-13) showed a higher percentage of microbial adhesion to organic solvents. The highest tolerance to low pH=3 with a growth index >90% was found in 4 strains identified as Saccharomyces cerevisiae Al-06 (from grapes), Saccharomyces cerevisiae Gl-8 (from sugar sargo juice), Saccharomyces cerevisiae BB-5 (from cherry juice) and Saccharomyces cerevisiae Az-12 (from pomegranate juice). These strains show the best characteristics, and one of the tested strains of Saccharomyces cerevisiae Az-12 has the potential to be used for the production of nutritional supplements, functional food drinks, and also as a probiotic for therapeutic purposes.
Keywords: probiotics, fermentation, fruit juices, microbial adhesion, growth index.
At present, the population of Kazakhstan, as well as all over the world, is interested in good nutrition, in the consumption of healthy foods, including those containing probiotics. In connection with this aspect research focused on finding new probiotic microorganisms is becoming relevant. To prepare fermented functional foods pure viable strains of microorganisms identified and characterized as probiotic cultures are used [1].
Fermented probiotic products can be consumed as a source of nutrition as well as to maintain a healthy gut microbiota [2]. Functional fruit or vegetable drinks contain the substrates needed to prepare the product with the addition of cultures or a consortium of strains used to carry out fermentation, so these drinks can be considered as a healthy synbiotic product formulation. [3, 4].
As a result, there is a growing demand for non-dairy probiotic products that meet the needs of people with dietary restrictions on dairy products. According to the current market report on July 20, 2022, the global market for dairy alternatives is estimated at $27.3 billion in 2022 and is projected to reach $44.8 billion by 2027, implying a CAGR of 10.4% in financial terms [5]. Dairy substitutes are used in lactose-free foods and drinks, so such products may be recommended for people with lactose intolerance.
Nowadays, due to these benefits, probiotics are becoming more and more popular, and they are usually taken orally, in the form of drugs or with food [6]. To be included in the probiotic category, microorganisms must be selected based on certain criteria, such as growth at body temperature (370C), resistance to antibiotics [7,8], survival in unfavorable human gut environments (e.g., digestive enzymes, low pH), adhesion to gut epithelial cells and high surface hydrophobicity [9]. Yeast is widespread in the food industry, where it is used as a starter for the production of fermented food and beverages, such as bread, wine, and beer [10]. To date, the probiotic ability of yeast has not been sufficiently studied. Saccharomyces cerevisiae var. boulardii-the only yeast recognized and actually marketed as probiotics [11].
Many researchers have focused on yeast strains of both Saccharomyces and non-Saccharomyces [12, 13] as a good alternative to probiotic bacteria, since they can exert new preventive or therapeutic effects on the host by being part of the gut microbiota [14]. Stimulation of the immune system, degradation and elimination of bacterial toxins due to the protease activity of yeast or inhibition of bacterial attachment to gastrointestinal epithelial cells are among the potential mechanisms used by yeast to protect humans against pathogens [15].
Given the lack of knowledge about the probiotic properties of indigenous yeasts, the purpose of this study was to characterize the indigenous strains of S. cerevisiae. In order to isolate strains with a probiotic and health-beneficial potential, a preliminary screening of 180 indigenous strains of S. cerevisiae isolated from various plant materials was carried out, from which 15 strains were selected to study the probiotic ability in terms of resistance to the conditions of the gastrointestinal tract (pH, temperature) and hydrophobicity.
Objects and methods of research
In this work, 15 indigenous strains of S.cerevisiae (selected from 180) isolated from plant material, including grapes, cherries, apricots, pomegranates, and apples well growing and fruiting in Turkestan region were studied.
Before each experiment, yeast strains were grown in YPD (manufacturer Titan, Biotech LTD, India). The cultures were incubated under aerobic conditions at 37±2 °C and 26±2 °C (as a positive control) for 48 hours. All experiments were performed in three replicates.
Hydrophobicity of yeast cell surface.
The hydrophobicity of the cell surface is a rather variable trait and is tied not only to the measurement technique, but also to the growth conditions, aeration, and age of the cells. Highly hydrophobic microorganisms adhere well to oil droplets after mixing.
Hydrophobicity was defined as the ability of yeast strains to adhere to hydrocarbons and expressed as relative microbial adhesion to solvents (MAtS) according to the protocol described by Chelliah et al [16] with some modifications. MAtS was determined by optical density (OD) using a Varian Cary-50 spectrophotometer having an optical range of 190 - 1100 nm. The main objective of the technical solution is to improve the method of estimating the concentration of free and bound microbial cells in the suspension, aimed at increasing the speed of analysis, reducing its labor intensity and cost, as well as the level of error.
Yeast cultures in the stationary phase (inoculated in YPD broth for 48 h) were concentrated by centrifugation at 5000 rpm for 10 min, washed twice with 0.1 M potassium-phosphate buffer (PPB), pH 7.4, and resuspended in 3 ml of the same buffer solution. The optical density (OD) of the suspension at 600 nm was adjusted to 1.0 (A0) using PPB (pH 7.4).
To 1 ml of this suspension (5.2*106 cells/ml), 0.2 ml of toluene was added and stirred for 2 min. After 1 h of incubation at 30±2°C, the aqueous phase was removed from the top layer of the solvent containing the cells, and the OD was determined again at 600 nm (A1).
The MAtS was calculated as:
MAkP = [(A0-A1)/A0]x100%
A0 - OD (optical density at 600 nm) of the suspension after treatment with buffer solution
A1 - OD (optical density at 600 nm) of the suspension after toluene treatment
Strain resistance to different pH values.
This experiment was performed by incubating approximately 5.2*106 cells/ml of each strain in YPD medium, adjusted to different pH values (2.5, 3.0, 3.5, 4.0, and 7.2), at 37±2°C. 6N HCl solution was used for acidification. Yeast growth was evaluated after 24 hours incubations by absorbance at 600 nm. Assays were performed in three replicates, and the data were treated as growth index (GI) according to Bevilacqua et al. [17]. This method for determining the concentration of microbial cells in a suspension according to OD increases the speed of analysis many times over in comparison with the methods used today and does not require specialized expensive equipment for its implementation.
GI = (Abss/Absc)x100%
where Abss - absorption of samples at different pH, whereas
Absc - the absorption of positive control.
Growth index values were classified as follows:
GI < 50 %: Inhibition of yeast
50 % < GI < 75 %: Partial inhibition
DI > 75%: Growth similar to control.
Results and discussion
The main goal of this work was the selective selection of yeasts with high microbial adhesion to organic solvents and acid resistance for a preliminary assessment of their probiotic abilities.
The sizes of the single cultures studied ranged in width on average from 4.5 p,m to 9 p,m and in length up to 10 ^m. Temperature is an important physical parameter for assessing the probiotic ability of a microorganism. In this study, experiments were conducted at 370C, a typical human
body temperature, and all 15 strains were able to grow at 370C. These results are consistent with previous findings reporting the ability of yeast strains to grow to human body temperature and confirm that local native yeast strains may be an interesting source for selecting new potential probiotic strains. Hydrophobicity was defined as the interaction between microbial cells and host cells mediated by cell surface proteins and lipoteichoic acids [13]. As a consequence, this is one of the main criteria for selecting strains with potential probiotic activity, since a microbial strain included in the category of probiotics must have the ability to attach to the intestinal mucosa to colonize and modulate the immune system against pathogens. [18]. Hydrophobic ability was expressed as microbial adhesion to MAtS solvents, using toluene as a solvent.
Hydrophobic capacity and stability of yeast strains at different pH is shown in the Table 1.
Table - Hydrophobic capacity and stability of yeast strains at different pH
№ Microorganism, source MAtS (%) GI (%), рН 3,0 GI (%), рН 2,5
1 S. cerevisiae ZPt-14 12,25 50-75 <50
2 S. cerevisiae VIs-1/14 27,34 >75 50-75
3 S. cerevisiae Al-06 85,23 >75 >75
4 S. cerevisiae Spt-18 45,32 50-75 <50
6 S cerevisiae KRs-7 69,75 50-75 <50
7 S. cerevisiae Gl-8 86,78 >75 >75
8 S cerevisiae BB-5 85,43 >75 >75
9 S. cerevisiae BB-32 78,65 >75 50-75
10 S cerevisiae VVs-72 65,78 >75 50-75
11 S. cerevisiae Az- 12 92,75 >75 >75
12 S. cerevisiae Nur-22 65,87 >75 50-75
13 S. cerevisiae Ab-13 78,35 50-75 <50
14 S. cerevisiae Vs-1 67,85 >75 >75
15 S. cerevisiae VGz-4 74,45 >75 50-75
The results showed that only three strains (ZPt-14, VIs-1/14, Spt-18), showed less than 50% MAtS (weak hydrophobic activity), while most strains (8) showed MAtS ranging from 50% to 85%. Four strains (BB-5, Az- 12, Al-06, Gl-8) showed the highest percentage of MAtS greater than 85%. The highest hydrophobic activity of S. cerevisiae strain Az- 12 was 92.75% Probiotics must withstand harsh conditions as they pass through the intestinal tract [11]. The resistance of the yeast strains was determined at different pH values (2.5, 3.0, 3.5, 5.0, and 7.2) to assess the ability of the yeast tested to survive the pH of the gastrointestinal tract. All strains showed good growth (GI > 75%) at pH 3.5, 5.0, and 7.2, whereas the lowest pH values (2.5 and 3.0) strongly affected the growth of individual yeast strains.
It should be noted that most yeasts tolerated low pH values, so all strains grew well at pH=5, The highest tolerance to low pH=3 values with GI > 90% was found in 4 strains, namely S. cerevisiae Al-06, S. cerevisiae BB-5, S. cerevisiae Az- 12 and S. cerevisiae Gl-8.
S. cerevisiae Az-12, S. cerevisiae BB-32 and S. cerevisiae ZPt-14 strains were examined under the microscope using JSM-6490LM scanning electron microscope with Energy INCA 350 energy dispersive X-ray microanalysis system and HKL Basic system (Figure 1).
S. cerevisiae Az- 12
S. cerevisiae BB-32
S. cerevisiae ZPt-14
GI (%) рН 2,5>90
GI(%) рН 2,5 = 50-75
GI (%) рН 2,5 <50
Figure 1 - Resistance of yeast to acidic conditions
Thus, acid exposure at pH=2.5 sharply reduced yeast cell growth in S. cerevisiae strain ZPt-14 (GI (%), pH 2.5 <50). A significant decrease in viable cells was observed here, due to partial or complete damage and lysis of cell walls. S. cerevisiae BB-32 was less affected by acid GI (%), pH 2.5 = 50-75. S. cerevisiae Az-12 strain showed high resistance to acidic conditions, which in the future can be recommended for the production of functional fermented food products. The resistance to acidic conditions is not surprising, since the strains studied in this work were isolated from low pH environments, such as, fruit juices.
Conclusions
The indigenous strains of Saccharomyces cerevisiae tested in this study, isolated from various plant materials, demonstrated a fairly high level of probiotic traits, proving that indigenous yeasts represent an interesting source for the selection of new probiotic strains. All 15 S. cerevisiae strains previously tested for parameters of technological interest can be used as starter cultures for the production of fermented beverages. These strains were selected as the most promising because they are able to ferment juices quickly. The leading factor was the organoleptic characteristics of the finished fermented product: a natural fruity smell and a sweet, slightly sour taste, without the appearance of turbidity. S. cerevisiae Al-06, S. cerevisiae BB-5, S. cerevisiae Az- 12, and S. cerevisiae Gl-8 showed promising probiotic activity, as the growth index at pH=2.5 in these cultures was >90; besides, seven strains (BB-5, BB-32, VSs-2, Az-12, Al-06, Gl-8, Ab-13) showed the highest percentage of MAtS. In particular, S. cerevisiae strain Az-12 isolated from pomegranate juice can be considered as the strain showing the best combination of probiotic and beneficial properties.
1 Dahiya D., Nigam P.S. Probiotics, Prebiotics, Synbiotics and Fermented Foods as Potential Bioticsin Nutrition Improving Health via Microbiome-Gut-Brain Axis. Fermentation, 2022, 8 (7): 303.
2 Hill C., Guarner F., Reid G., Gibson G.R., Merenstein D.J., Pot B., Morelli L., Canani R.B., Flint H.J., Salminen S., Calder P.C. and Sanders M.E. Expert Consensus Document: The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics Consensus Statement on the Scope and Appropriate Use of the Term Probiotic. Nature Reviews Gastroenterology &Herpetology, 2014, 11: 506-514.
3 Dahiya D., Nigam P.S. Functional Foods with Prebiotics Can Sustain Wellness and Alleviate Certain Ailments like Gut-Inflammation and Colon-Cancer. Microorganisms, 2022, 10(3): 665.
4 Markowiak P., Slizewska K. Effects of Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics on Human Health. Nutrients, 2017, 9(9): 1021.
5 Markets and Markets Dairy Alternative (Milk) Market by Type (Soy, Almond, Rice), Formulation (Plain, Flavored, Sweetened, Unsweetened), Channel (Supermarket, HealthStore, Pharmacy, Convenience Store) & Geography—Global Trends & Forecastto 2018. Availableonline: https://www.marketsandmarkets.com/Market-Reports/dairy-alternative-plant-milk-beverages-market677.html (accessedon 3 March 2020).
References:
6 Rodríguez P.F.-P.; Arévalo-Villena M., Rosa I.Z., Pérez A.B. Selection of potential non-Sacharomyces probiotic yeasts from food origin by a step-by-step approach. Food Research International, 201B, 112:143-151.
7 McFarland L.V. From yaks to yogurt: the history, development, and current use of probiotics. Clinical Infectious Diseases, 2015, 60: B5-90.
B Boulangé C., Neves A., Chilloux J., Nicholson J., Dumas M. Impact of the gut microbiota on inflammation, obesity, and metabolic disease. Genome Medicine, 2016, B; 42.
9 Fijan, S. Microorganisms with Claimed Probiotic Properties: An Overview of Recent Literature. Environmental Reserch and Public Health, 2014, 11: 4745-4767.
10 Oniszczuk A., Oniszczuk T., Gancarz M., Szymanska J. Role of Gut Microbiota, Probiotics and Prebiotics in the cardiovascular diseases. Molecules, 2021, 26: 1172.
11 Amara A.A., Shibl A. Role of Probiotics in Health Improvement, Infection Control and Disease Treatment and Management. Saudi Pharmaceutical Journal, 2015, 23: 107-114
12 Perricone M., Bevilacqua A., Corbo M.R., Sinigaglia M. Technological Characterization and Probiotic Traits of Yeasts Isolated from Altamura Sourdough to Select Promising Microorganisms as Functional Starter Cultures for Cereal-Based Products. Food Microbiology, 2014, 3B: 26-35.
13 Arévalo-Villena M., Fernández-Pacheco P., Castillo N., Bevilacqua A., Briones A. Probiotic capability in Saccharomyces yeasts: Set-up of a screening method. LWT- Lebensmittel-Wissenschaft + [i.e. und] Technologie, 201B, B9: 657-665.
14 Cordonnier C., Thévenot J., Etienne-Mesmin L., Denis S., Alric M., Livrelli V., Blanquet-Diot S. Dynamic In Vitro Models of the Human Gastrointestinal Tract as Relevant Tools to Assess the Survival of Probiotic Strains and Their Interactions with Gut Microbiota. Microorganisms, 2015, 3(4): 725-745.
15 Neffe-Skocinska K., Rzepkowska A., Szydlowska A., Kolozyn-KrajewskaChelliah D. Chapter 3 -Trends and Possibilities of the Use of Probiotics in Food Production. Alternative and Replacement Foods, 201B: 65-94.
16 Chelliah R., Ramakrishnan S.R., Prabhu P.R.; Antony U. Evaluation of antimicrobial activity and probiotic properties of wild-strain Pichia kudriavzevii isolated from frozen idli batter. Yeast. 2016, 33: 3B5-401.
17 Bevilacqua A., Perricone M., Cannarsi M., Corbo, M.R., Sinigaglia, M. Technological and spoiling characteristics of the yeast microflora isolated from Bella Di Cerignola table olives. Int. J. Food Sci. 2009, 44: 219B-2207.
1B Lichtenstein L., Avni-Biron I., Ben-Bassat O. Probiotics and Prebiotics in Crohn's Disease Therapies. Best Practice Reserch Clinical Gastroenterology, 2016, 30: B1-BB.
