CC BY
27
DOI: 10.23868/201805010
исследование механизмов терапевтической Активности аллогенных мультипотЕнтных мезенхимальных стромальных клеток пупочного канатика в модели ишемии задних конечностей крыс
И.В. Арутюнян1,2, Т.Х. Фатхудинов1,3, А.В. Ельчанинов1,2, А.В. Макаров1,4,
0.А. Васюкова2, Н.Ю. Усман1, М.В. Марей1, М.А. Володина1, Е.Ю. Кананыхина12, А.В. Лохонина1, Г.Б. Большакова2, Д.В. Гольдштейн5, Г.Т. Сухих1
1 Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова, Москва, Россия
2 Научно-исследовательский институт морфологии человека, Москва, Россия
3 Российский университет дружбы народов, Москва, Россия
4 Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
5 Медико-генетический научный центр, Москва, Россия
Understanding mechanisms of the umbilical cord-derived multipotent mesenchymal stromal cell-mediated recovery enhancement in rat model of limb ischemia
1.V. Arutyunyan12, T.Kh. Fatkhudinov13, A.V. Elchaninov12, A.V. Makarov14, O.A. Vasyukova2, N.Y. Usman1, M.V. Marey1, M.A. Volodina1, E.Y. Kananykhina12, A.V. Lokhonina1, G.B. Bolshakova2,D.V. Goldshtein5, G.T. Sukhikh1
1 V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Moscow, Russia
2 Scientific Research Institute of Human Morphology, Moscow, Russia
3 Peoples' Friendship University of Russia, Moscow, Russia
4 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia
5 Research Centre of Medical Genetics, Moscow, Russia
e-mail: fatkhudinov@gmail.com
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) пупочного канатика (ПК) считаются одним из оптимальных агентов для клеточной терапии ишемии нижних конечностей.
Устойчивую ишемию конечностей, сопровождающуюся асептическим воспалением, моделировали на крысах Spnague-Dawley путем иссечения бедренной и подколенной артерий. Аллогенные ММСК пупочного канатика вводили в мышцы голени на 7 сут. после повреждения. Животных выводили из эксперимента на 3, 10 или 30 сут. после трансплантации.
У крыс с трансплантированными ММСК функциональное состояние мышц, определяемое тестом rota-nod, было лучше, а область повреждения мышечной ткани была значимо меньше, чем в контроле. Введение ММСК стимулировало ангиоге-нез в области повреждения на 1 0 сут. после трансплантации. Трансплантированные меченые клетки выживали в течение 30 сут. после введения, мигрировали в область повреждения, где частично элиминировались макрофагами реципиента и не дифференцировались в эндотелиальные и гладкомышечные клетки кровеносных сосудов. Введение ММСК ПК подавляло CD68+ макрофагальную инфильтрацию и стимулировало активацию CD206+ макрофагов в течение 10 сут. после трансплантации.
Аллогенная однократная внутримышечная трансплантация ММСК ПК при ишемии задних конечностей крыс способствовала функциональному и морфологическому восстановлению ишемизированной скелетной мышечной ткани. ММСК ПК не дифференцировались в эндотелиальном направлении и не встраивались в стенки кровеносных сосудов, но стимулировали активацию прорегенераторных М2 макрофагов в области ишемического повреждения.
ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки пупочного канатика, ишемия нижних конечностей, морфометрия, ангиогенез, макрофагальная инфильтрация, активация М2 макрофагов.
Umbilical cord-derived multipotent mesenchymal stromal cells (UC-MMSCs) are considered as a strong candidate for cell therapy of lower limb ischemia.
Sustained calf muscle ischemia with aseptic inflammatory response was induced in Sprague-Dawley rats by excision of femoral and popliteal arteries. uC-MSCs were injected into the calf muscle on day 7 after surgery. The animals were sacrificed on days 3, 10, and 30 after transplantation.
Animals responded to the transplantation by temporary improvement in their locomotor function as assessed by the rota-rod performance test. Measured size of the lesions was significantly smaller in the experimental group than in the control group at all time points throughout the observation. The transplantation stimulated angiogenic processes on day 10 after transplantation. Living transplanted cells were traced for up to 30 days after transplantation, during which time they migrated to the damaged area to be partially eliminated by host macrophages; none of them differentiated into endothelial or smooth muscle cells of blood vessels. Additionally, the transplantation led to the predominance of activated pro-angiogenic and anti-inflammatory M2 macrophages by inhibiting the CD68+ macrophage infiltration and stimulating the CD206+ macrophage activation at the site of injury.
A single intramuscular injection of allogeneic umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells reproducibly facilitated recovery of structural and functional properties of surgically ischemized calf muscles in a rat. No differentiation of the transplanted cells in vivo was observed. The transplantation negatively regulated inflammation and enhanced tissue repair chiefly by modulating local patterns of macrophage activation.
Keywords: umbilical cord-derived multipotent mesenchymal stromal cells, limb ischemia, morphometry, angiogenesis, macrophage infiltration, M2 macrophage activation
введение
Ишемия нижних конечностей занимает лидирующее место среди заболеваний периферических артерий, которым подвержено около 10 % населения экономически развитых стран [1]. Современные высокотехнологичные
эндоваскулярные и хирургические методы лечения не способны полностью решить проблему восстановления кровоснабжения конечности, поэтому поиск принципиально новых методов лечения больных с ишемией нижних конечностей продолжается. FDA зарегистрировано более сотни
клинических исследований безопасности и эффективности трансплантации ауто- и аллогенных гладкомышечных клеток, эндотелиальных клеток, субпопуляций CD133+ или CD34+ клеток, мононуклеарных клеток (МНК) костного мозга, мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из костного мозга, жировой ткани, пуповинной крови, плаценты и т. д. [2].
Эффективность терапии может зависеть от источника выделения трансплантируемых клеток. Тем не менее, полученные данные противоречивы: некоторые типы клеток показали сходную терапевтическую активность (например, аллогенные ММсК костного мозга и зародышевых оболочек [3]), другие же обладали значимыми различиями, что было подтверждено исследованиями in vitro и in vivo. Так, ММСК жировой ткани лучше и быстрее восстанавливали кровоснабжение ишемизированной конечности мыши, чем ММСК костного мозга [4], которые в свою очередь оказались более эффективны, чем МнК костного мозга [5]. Особое внимание исследователей привлекает гипотеза о превосходстве репаративного потенциала ММСК, выделенных из неонатальных тканей, по сравнению с ММСК, полученными из тканей взрослого организма. Неонатальные ММСК, в частности, ММСК пупочного канатика (ПК) имеют более высокий пролиферативный потенциал, лучше отвечают на индукцию эндотелиальной дифференцировки, обладают более выраженным имму-номодулирующим эффектом, более устойчивы к условиям гипоксии и поэтому могут рассматриваться в качестве оптимального агента для клеточной терапии [6].
Важной особенностью ММСК ПК является сдвиг про-и антиангиогенных факторов в секретоме (в том числе практически полное отсутствие основного проангиоген-ного фактора VEGF-A) [6], что поднимает вопрос целесообразности применения данных клеток для терапии ишеми-ческого повреждения тканей. Однако проведенные ранее исследования эффективности трансплантации ММСК ПК на моделях ишемии конечностей подтвердили усиление кровотока и стимуляцию ангиогенеза в ишемизиро-ванной скелетной мышечной ткани [7]. Доклинические исследования позволили обосновать оптимальный способ доставки клеток, допустимый временной интервал трансплантации [8], повышение эффективности при увеличении кратности введения [9]. В то же время механизмы, лежащие в основе терапевтической активности ММСК ПК, остаются малоизученными. Среди потенциальных механизмов рассматривают заместительный и трофический, а также паракринное воздействие на резидентные эндоте-лиальные клетки и клетки иммунной системы [10-12].
Ранее в эксперименте in vitro мы показали, что ММСК ПК способны к реализации как заместительного (ММСК ПК в условиях эксперимента приобретали CD31+ фенотип), так и паракринного механизмов (среда, кондиционированная ММСК ПК, стимулировала пролиферацию, подвижность и направленную миграцию эндотелиальных клеток) [13]. Настоящая работа посвящена изучению возможных механизмов, обеспечивающих влияние ММСК ПК на состояние ишемизиро-ванной скелетной мышечной ткани in vivo.
Материал и методы
Клеточные культуры
Клеточные культуры были получены из интерваску-лярной ткани пупочного канатика крыс Sprague-Dawley методом эксплантатов. Принадлежность клеток к ММСК была подтверждена по их способности к клоногенному росту на поверхности необработанной культуральной подложки, экспрессии специфических поверхностных антигенов и возможности ответа на действие индукторов
дифференцировки в адипогенном, остеогенном и хон-дрогенном направлениях [14].
ММСК ПК третьего пассажа метили витальным трейсером PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma-Aidrich, США) и дважды отмывали 0,9 % раствором хлорида натрия (ПанЭко, Россия). Меченые клетки переносили в культуральную посуду для оценки качества внедрения метки или в шприцы для инъекций.
Экспериментальные животные
Экспериментальное исследование проводили на половозрелых самцах аутбредных крыс Sprague-Dawley весом 300-400 г (n=48; НПП «Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН», Россия). Эксперимент выполняли в соответствии с рекомендациями локального биоэтического комитета (Протокол № 8б заседания биоэтической комиссии ФГБУ «ННИИМЧ» РАМН от 10.11.2012), руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 и № 701 от 24.07.1978) и «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» от 2003 г.
Моделирование ишемии конечностей
Крыс наркотизировали золетилом (20 мг/кг) (Virbac, Франция) и рометаром (5 мг/кг) (Bioveta, Чехия). Ишемию моделировали на правой задней конечности животного (n=48) путем иссечения бедренной и подколенной артерий [15]. ММСК ПК (5х106 кл/1 мл 0,9 % раствора хлорида натрия) трансплантировали внутримышечно (5 инъекций в мышцы голени с помощью иглы 27G) на 7 сут. после моделирования ишемии. В качестве группы сравнения использовали животных (n=24), которым вводили 1 мл 0,9 % раствора хлорида натрия без клеток. Животных выводили из эксперимента с помощью СО2-камеры на 3, 10 или 30 сут. после трансплантации (n=8 для каждого срока) и извлекали группу мышц голени, включающую musculus (m.) tibialis cranialis, m. tibialis caudalis, m. triceps surae, m. gastrocnemius, m. soleus, m. plantaris, m. peroneus longus и m. peroneus brevis.
Тест ротарод
Тест проводили животным за 1 сут. до моделирования ишемии, за 1 сут. до трансплантации, а также за 1 сут. до выведения животного из эксперимента. Измеряли время нахождения крысы на вращающемся вале до падения животного.
Морфометрическое исследование
области повреждения
Материал фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина на фосфатном буфере в течение 72 ч., после чего в течение 24 ч. образцы ткани промывали в проточной воде. После стандартной гистологической проводки образцы тканей заключали в парафин и делали поперечные серийные срезы толщиной 5 мкм на 3 уровнях. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, обезвоживали и заключали в синтетическую монтирующую среду (все реактивы фирмы БиоВитрум, Россия).
Морфометрическое исследование проводили с помощью микроскопа Leica DM 2500 (ув. х200) и программного обеспечения ImageScope M (Leica Biosystems, Германия).
Методом точечного счета с помощью решетки с 25 узлами определяли объемную плотность поврежденной ткани (некротизированных и атрофированных мышечных волокон). На каждое животное обсчитывали 750 точек (25 точек в поле зрения в 10 выбранных случайным образом полях зрения со срезов, сделанных на 3 уровнях).
Иммуногистохимическое исследование
Материал фиксировали в жидком азоте, после чего готовили криосрезы на 4 уровнях толщиной 5-6 мкм. Исследование проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM 4000 B и программного обеспечения LAS AF v.3.1.0 build 8587 (Leica Microsystems, Германия).
Использовали антитела к маркеру макрофагов CD68 (ab125212, Abcam, США), маркеру М2 активированных макрофагов CD206 (sc-34577, Santa Cruz Biotechnology, США), VEGF (ab 9570, Abcam, США), маркеру эндотелио-цитов CD31 (ab 24590, Abcam, США), гдадкомышечному актину aSMA (ab5694, Abcam, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Вторые антитела были конъ-югированы с FITC (ab97050 или ab6785, Abcam, США). Ядра клеток докрашивали DAPI (Sigma-Aldrich, США).
Для изучения ангиогенеза в программе Adobe Photoshop CS6 измеряли количество сосудов микро-циркуляторного русла на единицу площади. На каждое животное обсчитывали по 30 выбранных случайным образом полей зрения (ув. х400) на 3 уровнях.
Колокализационный анализ
Колокализационный анализ проводили на криосре-зах, окрашенных антителами к CD68 (ab125212, Abcam, США), с помощью конфокального лазерного микроскопа Carl Zeiss LSM700 и программного обеспечения ZEN (Zeiss, Германия). Определяли коэффициент наложения Мандерса (МОС — the Mander's overlap coefficient). Обсчитывали по 10 выбранных случайным образом полей зрения на каждое животное.
Статистический анализ
для парных сравнений в случае нормального распределения использовали t-тест, в случае распределения, отличного от нормального, — тест Манна-Уитни Различия считали достоверными при 5 % уровне значимости. данные были проанализированы с помощью программы Sigma Stat 3.5 (Systat Software, США).
Результаты
Моделирование ишемии задних конечностей у крыс
Животные удовлетворительно переносили оперативное вмешательство. Смертность составила 0 %. В течение 1-2 сут. животные полностью исключали оперированную конечность из движения. на 7 сут. крысы активно передвигались, однако иногда подволакивали поврежденную конечность. развития гангрены не наблюдали.
Тест толерантности к физическим нагрузкам ротарод
Моделирование ишемии приводило к значимому сокращению времени прохождения крысами теста рота-род в обеих группах. В группе без введения клеток показатели теста продолжали снижаться вплоть до 29 сут. после трансплантации. В группе животных, которым трансплантировали ММСК ПК, на 9 и 29 сут. результаты прохождения теста были достоверно лучше, чем в группе сравнения (рис. 1A).
Морфометрическое исследование очага ишемического повреждения скелетной мышечной ткани
Иссечение бедренной и подколенной артерий приводило к появлению очагов ишемического повреждения в скелетных мышцах. В таких очагах на 3 и 10 сут. после трансплантации (10 и 17 сут. после оперативного вмешательства) в обеих группах наблюдали некроз и атрофию групп мышечных волокон, перицеллюлярный отек, повышение количества
центральных ядер с перинуклеарным отеком в миоцитах, свидетельствующих об их дегенерации, а также обширную макрофагальную инфильтрацию. На 30 сут. после трансплантации в группе сравнения инфильтрация сохранялась вокруг некротизированных волокон, в то время как в группе с введением ММСК ПК поврежденные мышечные волокна замещались прослойками фиброзной ткани (рис. 1Б). На всех сроках исследования площадь поврежденной ткани в группе с введением ММСК ПК была статистически значимо меньше, чем в группе сравнения (рис. 1 В).
Ангиогенез в очаге ишемического
повреждения скелетной мышечной ткани
Количество сосудов микроциркуляторного русла (ар-териолы, венулы, капилляры) не отличалось между группами на 3 сут. после трансплантации. На 10 сут. в группе с введением ММСК ПК количество сосудов было значимо выше, чем в контроле: 429,4±44,6 на 1 мм2 против 234,0±19,1 на 1 мм2. Однако на 30 сут. после трансплантации статистически значимая разница по этим показателям между группами снова отсутствовала (рис. 1 Г, Д).
Локализация трансплантированных
ММСК ПК в ишемизированной ткани
На 3 сут. после трансплантации в очаге повреждения хорошо визуализировались скопления меченых клеток — треки введения. РКН26+-клетки располагались как в центре, так и у самой границы очага повреждения, вблизи сохраненных мышечных волокон. На 10 сут. на отдельных участках были также видны скопления меченых клеток, однако их распределение, в основном, становилось диффузным, а часть клеток располагалась в перимизии мышечных волокон перифокальной зоны. На 30 сут. после введения РКН26+-клетки были локализованы в соединительнотканных прослойках и перимизии (рис. 2А).
Иммуногистохимическое окрашивание показало, что сохраненные мышечные волокна перифокальной зоны продуцировали VEGF, при этом сами ММСК пупочного канатика VEGF не экспрессировали (рис. 2Б).
Элиминация трансплантированных
ММСК ПК макрофагами
При иммуногистохимическом окрашивании криос-резов антителами к маркеру макрофагов CD68 было выявлено, что часть меченых клеток имели фенотип PKH26+CD68+, т. е. метка, встроенная в мембраны ал-логенных ММСК ПК, попадала в резидентные макрофаги (рис. 3А). Со временем доля CD68+-клеток среди всех РКН26+-клеток возрастала; колокализационный анализ подтвердил значимое увеличение МОС (the Mander's overlap coefficient) с 0,70±0,03 на 3 сут. после введения клеток до 0,86±0,04 на 30 сут. (рис. 3Б).
Дифференцировка трансплантированных ММСК ПК
Мы не нашли подтверждения дифференцировки трансплантированных ММСК ПК в эндотелиальном направлении в условиях нашего эксперимента: метка РКН26 отсутствовала в составе стенок капилляров или более крупных кровеносных сосудов на всех сроках эксперимента (рис. 3В).
Также РКН26+-клетки отсутствовали в составе мышечных стенок кровеносных сосудов, хотя часть трансплантированных клеток сохраняла экспрессию aSMA (рис. 3Г).
Влияние ММСК ПК на макрофагальную
инфильтрацию и активацию в очаге повреждения
После иммуногистохимического окрашивания в очаге ишемического повреждения можно было четко визуализировать клетки, экспрессировавшие
А
Б
Контроль
ММСК ПК
Контроль
ММСК ПК
Г
10
Контроль
ММСК ПК
д
сут. 30
Контроль
ММСК ПК
•чГТь.
I/ 11 '
Рис. 1. Эффект трансплантации ММСК пупочного канатика на состояние ишемизированной скелетной мышечной ткани крысы: А — результаты рота-род теста (М±ст, *р<0,05); Б — очаг ишемического повреждения скелетной мышечной ткани; В — относительная площадь поврежденной ткани (М±о, *р<0,05); Г — ангиогенез в очаге ишемического повреждения (М±о, *р<0,05); Д — ангиогенез в очаге ишемического повреждения. Окраска: Б — гематоксилин и эозин, Д — иммуногистохимическая реакция с антителами к 0031, докраска ядер 0АР!. Масштабный отрезок: Б — 100 мкм, Д — 50 мкм
маркер макрофагов 0068; форма этих клеток варьировала от округлой до веретеновидной (рис. 4А). В контрольной группе на 3 сут. после трансплантации (10 сут. после моделирования ишемии) доля С068+-клеток в очаге повреждения была очень высокой и достигала 56,22±5,46 %. В группе с введением ММСК ПК на том же сроке доля С068+-клеток была достоверно ниже (45,30±2,38 %), чем в группе сравнения. Интенсивность макрофагальной инфильтрации постепенно снижалась в обеих группах, при этом доли С068+-клеток на 10 и 30 сут. не отличались между группами (рис. 4Б).
В очаге ишемического повреждения скелетной мышечной ткани также присутствовали крупные клетки округлой формы, экспрессировавшие маркер альтернативно активированных М2а и М2с макрофагов С0206 (рис. 4А). В группе сравнения доля С0206+-клеток имела тенденцию к росту (25,68±3,28 % на 3 сут. и 29,38±3,11 на 30 сут.), не достигая, тем не менее,
статистически значимых отличий. В группе с введением ММСК ПК на 3 сут. было выявлено значимое увеличение доли М2 макрофагов до 42,05±2,77 %. Однако общая тенденция была обратной: на 1 0 сут. в группе с введением ММСК ПК доля М2 макрофагов снижалась, но все же оставалась достоверно выше, чем в группе сравнения (33,33±3,06 % против 26,34±3,5 %), а на 30 сут. отличий между группами выявлено не было (рис. 4Б).
Обсуждение
Для оценки функционального состояния мышечной ткани конечностей экспериментальных животных мы использовали тест рота-род (рис. 1А). Прогрессирующее ухудшение показателей в группе контроля свидетельствовало об адекватности выбранной модели, позволяющей получить длительное ишемическое повреждение скелетной мышечной ткани. Замедление этого процесса в экспериментальной группе подтвердило
Рис. 2. Локализация ММСК ПК после внутримышечной трансплантации: А — миграция РКН26-меченных клеток (красный цвет) из треков введения на 3, 10 и 30 сут. после трансплантации, совмещение флуоресцентной и фазово-контрастной микроскопии; Б — миграция ММСК ПК по направлению к продуцирующим УЕвР-А мышечным волокнам, в правом верхнем углу — вставки с неспецифическим отрицательным контролем реагентов. Окраска: А — РКН26, Б — ииуногистохимическая реакция с антителами к УЕвР-А; докраска ядер йАР!. Масштабный отрезок: А — 200 мкм, Б — 100 мкм
наличие положительного эффекта трансплантации ММСК ПК на функциональное состояние ишемизиро-ванной конечности крыс.
Иссечение бедренной и подколенной артерий у крыс обеспечивало устойчивую ишемию икроножных мышц, которая сопровождалась их некрозом с выраженной и длительной воспалительной реакцией с последующим образованием рубца (рис. 1 Б). Похожую картину морфологических изменений мышцы после моделирования ишемии наблюдали другие исследователи [16-18]. Кроме того, на всех сроках эксперимента относительная площадь поврежденной ткани в группе с введением ММСК ПК была статистически значимо меньше, чем в контроле (рис. 1 В). Похожие результаты были получены на мышиной модели ишемии конечностей при аллоген-ной трансплантации ММСК костного мозга [19].
Для морфометрической оценки неоангиогенеза в очаге ишемического повреждения нами был выбран метод иммуногистохимического окрашивания на маркер эндо-телиоцитов CD31 (рис. 1Д) [20]. Результаты эксперимента показали, что трансплантация ММСК ПК увеличивала количество сосудов на 10 сут. после введения клеток, но к 30 сут. достоверных различий между группами уже не было (рис. 1 Г). По данным M. Choi и соавт. (2013) при моделировании ишемии задних конечностей на мышах трансплантация ММСК ПК увеличивала плотность сосудов на 21 сут. после введения клеток. Однако следует
учитывать, что эти данные были получены при введении клеток через 6 ч. после оперативного вмешательства; т. е. стимуляция ангиогенеза была показана в точке 21 сут. после ишемического повреждения, что довольно близко к нашим результатам (17 сут. после повреждения) [7].
Итак, в нашей работе трансплантация ММСК ПК способствовала функциональному и морфологическому восстановлению ишемизированной скелетной мышцы. Далее мы попытались выяснить механизмы данного терапевтического эффекта.
Изучение распределения меченых ММСК показало, что РКН26+-клетки мигрировали из локальных скоплений (треков введения, хорошо визуализируемых на 3 сут. после введения клеток) и со временем располагались диф-фузно в очаге повреждения и перимизии перифокальной зоны, где сохранялись неповрежденные мышечные волокна (рис. 2А). При этом мышечные волокна продуцировали VEGF (рис. 2Б), который, как мы предполагаем, мог служить аттрактантом для ММСК, что было ранее продемонстрировано в экспериментах in vitro [21] и in vivo [22].
Метка РКН26 была хорошо визуализируема на всех сроках эксперимента. Однако при окрашивании криосрезов антителами к маркеру макрофагов CD68 было выявлено, что часть клеток имела фенотип PKH26+CD68+, что говорит о попадании метки в резидентные макрофаги (рис. 3А). Как было показано в нашей предыдущей работе, со временем доля CD68+-клеток
A
3 сут.
10 сут.
С. í>
30 сут.
Б
CD
а
о.
н CD
I Ч
CD I
S CD
^
К
I
т CD
о * О
с
CD
I
3 сут. 10 сут. 30 сут.
Рис. 3. Выживаемость и дифференцировка ММСК ПК (красный цвет) в ишемизированной ткани: А — элиминация трансплантированных клеток тканевыми макрофагами; Б — результаты колокализационного анализа; В — отсутствие метки РКН26 в эндотелии капилляров (слева) или более крупных кровеносных сосудов (справа); Г — отсутствие метки РКН26 в стенке кровеносных сосудов; стрелками указаны клетки, имеющие фенотип РКН26+/аБМА+ (красный и зеленый цвета). Иммуногистохимическая реакция с антителами к: А — Сй68, В — Сй31, Г — а-БМА; докраска ядер йАР!. Масштабный отрезок: А — х400; В, Г — 50 мкм
среди всех РКН26-меченных клеток значимо возрастала с 48,1±3,2 % на 3 сут. до 76,2±3,9 % на 30 сут. после трансплантации [14]; эти данные коррелировали с оценкой МОС при колокализационном анализе (рис. 3Б).
Таким образом, лишь часть трансплантированных аллогенных ММСК ПК выживала в ишемизиро-ванной мышце в отдаленный период после введения. Трансплантированные ММСК ПК располагались также рядом с сохраненными мышечными волокнами (рис. 2Б), которые продуцировали VEGF. В неповрежденной мышце VEGF синтезируют только сателлитные клетки [23], но гипоксия индуцирует экспрессию транскрипционного фактора HIF-1 в мышечных волокнах [24], что обеспечивает быстрый (от нескольких минут до нескольких часов) запуск синтеза VEGF [25, 26]. Следовательно, трансплантированные клетки на протяжении всего срока эксперимента подвергались воздействию основного индуктора эндотелиальной дифференцировки VEGF. Нужно отметить, что метка РКН26 не была обнаружена в составе капилляров или стенок более крупных кровеносных сосудов, окрашенных антителами CD31 и aSMA (рис. 3В, 3Г). Не нашли подтверждения эндотелиальной дифференцировки ММСК ПК, трансплантированных в ишемизированную скелетную мышечную ткань, и другие исследователи [7].
Возможность эндотелиальной дифференцировки ММСК in vivo зачастую подвергается сомнению [27]. Одной из причин является то, что в ишемизирован-ной ткани уровень VEGF-А приблизительно в 103 раз меньше, чем в используемых для дифференцировки in vitro индукционных средах с добавлением данного фактора до 50 нг/мл [28]. Важно заметить, что в нашем эксперименте и через 30 сут. после трансплантации часть РКН26+-клеток экспрессировала aSMA (рис. 3Г), который не синтезируется макрофагами; это еще раз подтверждает, что на данном сроке часть трансплантированных ММСК ПК выживала и сохраняла характерный aSMA+ фенотип [29].
Полученные результаты свидетельствуют о том, что при реализации проангиогенной активности ММСК ПК заместительный механизм не является ведущим: дифференцировка трансплантированных клеток в эндотели-альном направлении не доказана, а сами клетки со временем элиминируются иммунной системой реципиента.
Не так давно было высказано предположение о существовании еще одного механизма терапевтической активности ММСК: способности переключать М1 (классический) путь активации макрофагов на М2 (альтернативно активированный) [12]. Мы изучили влияние трансплантации ММСК ПК на макрофагальную инфильтрацию в ишемизированной скелетной мышечной ткани.
Для скелетной мышечной ткани крыс и мышей с моделированной ишемией характерно развитие типичного сосудистого некроза, сопровождающегося выраженной воспалительной инфильтрацией. Если в первые часы в инфильтрате присутствуют в основном нейтрофилы, то через 3 сут. после повреждения их замещают макрофаги [17]. При этом интенсивность инфильтрации очага ишемического повреждения С068+-клетками постепенно снижается [16, 18]. Полученная нами оценка относительного содержания макрофагов в очаге ишемического повреждения (56,22±5,46 % всех клеток на 10 сут. после повреждения) кажется на первый взгляд очень высокой (рис. 4Б). При пересчете же на единицу площади среза получается, что абсолютное число макрофагов колебалось от 1 х103 до 2,5х103 на 1 мм2, что соответствует данным других исследователей [16, 30].
Известно, что блокирование макрофагальной инфильтрации значительно ухудшает динамику регенерации ишемизированной скелетной мышечной ткани [31], тем не менее, значимость отдельных субпопуляций макрофагов в процессе восстановления данного типа ткани до конца не изучена. Полученные нами результаты подтвердили данные других исследователей о том, что в очаге повреждения ишемизированной мышцы часть макрофагов выбирают М2 путь активации [18, 30].
A
Контроль
ММGК ПК
Б
к
о лето
лк
OD « CD
D
я ол
л
+ CD
0
S
О
я
сут.
Контроль ММGК ПК
сут.
-.-Контроль ММСК ПК
Рис. 4. Влияние трансплантации ММСК ПК на макрофагальную инфильтрацию и активацию в очаге ишемического повреждения: A — инфильтрация ишемизированной скелетной мышечной ткани Сй68+-кпетками (вверху) и CD206+ клетками (внизу) на 3 сут. после трансплантации, иммуногистохимическая реакция с антителами к CD68 и CD206 (зеленый цвет), ядра докрашены DAPI, масштабный отрезок — 50 мкм; Б — оценка относительного содержания общей популяции макрофагов и М2 активированных макрофагов в очаге ишемического повреждения (М±о, *р<0,05)
Оказалось, что однократная аллогенная трансплантация ММСК ПК значимо увеличивала долю М2 макрофагов, обладающих противовоспалительными и проан-гиогенными свойствами, в течение как минимум 10 сут. после введения клеток (рис. 4Б). Совсем недавно похожие результаты были получены на мышиной модели критической ишемии: ММСК костного мозга стимулировали M2 активацию макрофагов [9]. Подтверждают влияние ММСК ПК на активацию макрофагов и клинические данные: внутримышечное введение ММСК ПК оказывало иммуномодулирующий эффект на реципиентов с критической ишемией конечности, уменьшая уровень продуцируемых М1 макрофагами провоспали-тельных цитокинов [32].
Основной предполагаемый механизм ММСК ПК-опосредованной активации макрофагов — паракринный; это подтверждается данными о том, что М2 активацию макрофагов in vivo способна стимулировать кондиционированная среда, полученная при культивировании ММСК ПК [33]. Считается, что основным медиатором М2 пути активации макрофагов является простаглан-дин Е2 (PGE2) [34], синтез которого культурой ММСК ПК значительно возрастает под действием провоспали-тельных цитокинов IL-1 р и TNFa [11]. При ишемическом повреждении скелетной мышцы уровень IL-ip в ткани через 3 сут. возрастает приблизительно в 31 раз, а TNFa — в 12 раз, и такой уровень цитокинов сохраняется до 3 недель [35]. Транзиентное повышение уровня IL-1 в и TNFa определяет временные рамки для успешного проведения клеточной терапии, что согласуется с результатами других исследователей: введение ММСК через 1 неделю после индукции ишемии эффективнее восстанавливает кровоток в поврежденной конечности, чем трансплантация через 24 ч. [36], а наиболее поздний срок, при котором введение ММСК в ишемизиро-ванную конечность является эффективным, составляет 10 сут. для мышей и 3 нед. для крыс [8]. Можно предположить, что после трансплантации (в нашем эксперименте — на 7 сут. после повреждения) высокое содержание
провоспалительных цитокинов IL-1 ß и TNFa в ишемизированной мышце индуцировало секрецию трансплантированными клетками PGE2, который в свою очередь запустил М2 путь активации макрофагов.
Результаты нашего эксперимента показали, что внутримышечно трансплантированные ММСК ПК стимулировали М2 путь активации макрофагов, инфильтрировавших очаг ишемического повреждения. Данные макрофаги обладают миопротекторными свойствами и стимулируют регенерацию скелетной мышечной ткани после ишемического повреждения [37], что и способствовало функциональному и морфологическому восстановлению ишемизированной ткани, наблюдаемому в группе с введением клеток.
Известно также, что М2 макрофаги синтезируют целый пул проангиогенных факторов, включая VEGF, HGF, FGFb, IGF1, Ccl2 и PGF, при этом М2а подтип макрофагов стимулирует ангиогенез в основном FGF-опосредованным путем, а основным эффектором М2с макрофагов является PGF [38, 39]. Кроме того, обнаружено, что М2а макрофаги секретируют PDGF-BB, а М2с макрофаги — ММР9, совместно обеспечивая спрутинг эндотелиальных клеток за счет ремоделирования внеклеточного матрикса и привлечения перицитов [40]. Недавно на модели инфаркта миокарда было продемонстрировано, что локальная совместная доставка FGF и HGF привлекает в очаг повреждения М2 макрофаги и сопровождается активным формированием сосудов, а блокирование макрофагальной инфильтрации значительно подавляет ангиогенез. Результаты работы позволили авторам использовать термин «проангиогенные макрофаги» (pro-angiogenic macrophages) [41].
Таким образом, определяя выбор пути активации макрофагов, ММСК ПК выполняют функцию раннего регулятора воспаления и оказывают значительное влияние на динамику и эффективность репаративных процессов, происходящих в ишемизированной скелетной мышечной ткани. Изучение активации макрофагов как промежуточного элемента последовательности
«трансплантация ММСК — восстановление ишемизированной ткани» имеет важное значение для фундаментальных исследователей и клиницистов.
заключение
Аллогенная однократная внутримышечная трансплантация мультипотентных мезенхимальных стро-мальных клеток пупочного канатика при ишемии задних конечностей крыс способствовала функциональному и морфологическому восстановлению ишемизирован-ной скелетной мышечной ткани. Трансплантированные клетки выживали в течение 30 сут. после введения,
ЛИТЕРАТУРА
1. Norgren L., Hiatt W.R., Harris K.A. et al. TASC II section F on revascularization in PAD. J. Endovasc. Ther. 2007; 14(5): 743-4.
2. The Trial Register, https://clinicaltrials.gov/Accessed 04 September 2017.
3. Ishikane S., Ohnishi S., Yamahara K. et al. Allogeneic injection of fetal membrane-derived mesenchymal stem cells induces therapeutic angiogene-sis in a rat model of hind limb ischemia. Stem Cells 2008; 26(10): 2625-33.
4. Kim Y., Kim H., Cho H. et al. Direct comparison of human mesenchymal stem cells derived from adipose tissues and bone marrow in mediating neovascularization in response to vascular ischemia. Cell. Physiol. Biochem. 2007; 20(6): 867-76.
5. Iwase T., Nagaya N., Fujii T. et al. Comparison of angiogenic potency between mesenchymal stem cells and mononuclear cells in a rat model of hindlimb ischemia. Cardiovasc. Res. 2005; 66(3): 543-51.
6. Арутюнян И.В., Макаров А.В., Ельчанинов А.В. и соавт. Мультипотент-ные мезенхимальные стромальные клетки пупочного канатика: биологические свойства и клиническое применение. Гены и клетки 2015; 10(2): 30-8.
7. Choi M., Lee H.S., Naidansaren P. et al. Proangiogenic features of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal/stem cells and their ability to form functional vessels. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2013; 45(3): 560-70.
8. Liew A., O'Brien T. Therapeutic potential for mesenchymal stem cell transplantation in critical limb ischemia. Stem Cell Res. Ther. 2012; 3(4): 28.
9. Kang W.C., Oh P.C., Lee K. et al. Increasing injection frequency enhances the survival of injected bone marrow derived mesenchymal stem cells in a critical limb ischemia animal model. Korean J. Physiol. Pharmacol. 2016; 20(6): 657-67.
10. Santos Nascimento D., Mosqueira D., Sousa L.M. et al. Human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells attenuate remodeling after myocardial infarction by proangiogenic, antiapoptotic, and endogenous cell-activation mechanisms. Stem Cell Res. Ther. 2014; 5(1): 5.
11. Sabapathy V., Sundaram B., V M.S. et al. Human Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells plasticity augments scar-free skin wound healing with hair growth. PLoS One 2014; 9(4): e93726.
12. Dayan V., Yannarelli G., Billia F. et al. Mesenchymal stromal cells mediate a switch to alternatively activated monocytes/macrophages after acute myocardial infarction. Basic Res. Cardiol. 2011; 106(6): 1299-310.
13. Arutyunyan I., Fatkhudinov T., Kananykhina E. et al. Role of VEGF-A in angiogenesis promoted by umbilical cord-derived mesenchymal stro-mal/stem cells: in vitro study. Stem Cell Res. Ther. 2016; 7: 46.
14. Арутюнян И.В., Ельчанинов А.В., Фатхудинов Т.Х. и соавт. Элиминация РКН26-меченных ММСК при аллогенной трансплантации. Гены и клетки 2014; 9(3А): 45-52.
15. Schirmer S., Hoefer I., Buschmann I. Peripheral Hind Limb Ischemia Models. In: Augustin H.G., editor. Methods in Endothelial Cell Biology. Berlin: Springer-Verlag; 2004. p. 197-206.
16. Laurila J.P., Laatikainen L.E., Castellone M.D. et al. SOD3 reduces inflammatory cell migration by regulating adhesion molecule and cytokine expression. PLoS One 2009; 4(6): e5786.
17. Rigamonti E., Touvier T., Clementi E. et al. Requirement of inducible nitric oxide synthase for skeletal muscle regeneration after acute damage. J. Immunol. 2013; 190(4): 1767-77.
18. Pellegrin M., Bouzourene K., Poitry-Yamate C. et al. Experimental peripheral arterial disease: new insights into muscle glucose uptake, macrophage, and T-cell polarization during early and late stages. Physiol. Rep. 2014; 2(2): e00234.
19. Cunha F.F., Martins L., Martin P.K. et al. A comparison of the repara-tive and angiogenic properties of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow of BALB/c and C57/BL6 mice in a model of limb ischemia. Stem Cell Res. Ther. 2013; 4(4): 86.
20. Rahman M.M., Subramani J., Ghosh M. et al. CD13 promotes mesenchymal stem cell-mediated regeneration of ischemic muscle. Front. Physiol. 2014; 4: 402.
21. Beckermann B.M., Kallifatidis G., Groth A. et al. VEGF expression by mesenchymal stem cells contributes to angiogenesis in pancreatic carcinoma. Br. J. Cancer 2008; 99(4): 622-31.
мигрировали в область повреждения, где частично элиминировались макрофагами реципиента и не дифференцировались в эндотелиальные и гладкомышечные клетки кровеносных сосудов. Трансплантация ММСК ПК стимулировала активацию обладающих противовоспалительными, миопротекторными и проангиогенны-ми свойствами М2 макрофагов в очаге ишемического повреждения.
Благодарности
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16-15-00281).
22. Taghavi S., George J.C. Homing of stem cells to ischemic myocardium. Am. J. Transl. Res. 2013; 5(4): 404-11.
23. Germani A., Di Carlo A., Mangoni A.et al. Vascular endothelial growth factor modulates skeletal myoblast function. Am. J. Pathol. 2003; 163(4): 1417-28.
24. Wang T., Zhou Y.T., Chen X.N. et al. Putative role of ischemic post-conditioning in a rat model of limb ischemia and reperfusion: involvement of hypoxia-inducible factor-1a expression. Braz. J. Med. Biol. Res. 2014; 47(9): 738-45.
25. Rissanen T.T., Vajanto I., Hiltunen M.O. et al. Expression of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor-2 (KDR/Flk-1) in ischemic skeletal muscle and its regeneration. Am. J. Pathol. 2002; 160(4): 1393-403.
26. Carmeliet P. Angiogenesis in health and disease. Nat. Med. 2003; 9(6): 653-60.
27. Bronckaers A., Hilkens P., Martens W. et al. Mesenchymal stem/ stromal cells as a pharmacological and therapeutic approach to accelerate angiogenesis. Pharmacol. Ther. 2014; 143(2): 181-96.
28. Jiang Q., Ding S., Wu J. et al. Norepinephrine stimulates mobilization of endothelial progenitor cells after limb ischemia. PLoS One 2014; 9(7): e101774.
29. Ohta N. Umbilical Cord Matrix Stem Cells for Cytotherapy of Breast Cancer. In: Shah K., editor. Stem Cell Therapeutics for Cancer. USA, Hoboken, N.J.: Wiley-Blackwell; 2013. p. 111-26.
30. Zordan P., Rigamonti E., Freudenberg K. et al. Macrophages commit postnatal endothelium-derived progenitors to angiogenesis and restrict endothelial to mesenchymal transition during muscle regeneration. Cell Death Dis. 2014; 5: e1031.
31. Contreras-Shannon V., Ochoa O., Reyes-Reyna S.M. et al. Fat accumulation with altered inflammation and regeneration in skeletal muscle of CCR2-/- mice following ischemic injury. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2007; 292(2): C953-67.
32. Gao W.H., Yu J.Y., Li H.M. et al. The Immunomodulatory Effects of Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell in Critical Limb Ischemia Patients. J. Stem Cell Res. Ther. 2016; 6: 349.
33. Shohara R., Yamamoto A., Takikawa S. et al. Mesenchymal stromal cells of human umbilical cord Wharton's jelly accelerate wound healing by paracrine mechanisms. Cytotherapy 2012; 14(10): 1171-81.
34. Prockop D.J. Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation. Stem Cells 2013; 31(10): 2042-6.
35. Fan W., Cheng K., Qin X. et al. mTORC1 and mTORC2 play different roles in the functional survival of transplanted adipose-derived stromal cells in hind limb ischemic mice via regulating inflammation in vivo. Stem Cells 2013; 31(1): 203-14.
36. Moon M.H., Kim S.Y., Kim Y.J. et al. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells improve postnatal neovascularization in a mouse model of hindlimb ischemia. Cell. Physiol. Biochem. 2006; 17(5-6): 279-90.
37. Brechot N., Gomez E., Bignon M. et al. Modulation of macrophage activation state protects tissue from necrosis during critical limb ischemia in thrombospondin-1-deficient mice. PLoS One 2008; 3(12): e3950.
38. Wu W.K., Llewellyn O.P., Bates D.O. et al. IL-10 regulation of macrophage VEGF production is dependent on macrophage polarisation and hypoxia. Immunobiology 2010; 215(9-10): 796-803.
39. Jetten N., Verbruggen S., Gijbels M.J. et al. Anti-inflammatory M2, but not pro-inflammatory M1 macrophages promote angiogenesis in vivo. Angiogenesis 2014; 17(1): 109-18.
40. Spiller K.L., Anfang R.R., Spiller K.J. et al. The role of macrophage phenotype in vascularization of tissue engineering scaffolds. Biomaterials 2014; 35(15): 4477-88.
41. Barbay V., Houssari M., Mekki M. et al. Role of M2-like macrophage recruitment during angiogenic growth factor therapy. Angiogenesis 2015; 18(2): 191-200.
Поступила: 29.112017
