CC BY
91
Оригинальные исследования
45
ЭЛИМИНАЦИЯ РКН26-МЕЧЕННЫХ ММСК ПРИ АЛЛОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ
И.В. Арутюнян 1 г, А.В. Ельчанинов 12,3, Т.Х. Фатхудинов 12,3, А.В. Макаров 12,3,
ЕЮ. Кананыхина 12, Г.Б. Большакова 2, В.В. Гпинкина 3, Д.В. Гольдштейн 4, Г.Т. Сухих1
1 Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова,
Москва, Россия
2 Научно-исследовательский институт морфологии человека РАМН, Москва, Россия
3 Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
4 Медико-генетический научный центр РАМН, Москва, Россия
Elimination of PKH26-labeled MMSC after allogeneic transplantation
IV. Arutyunyan 12, A.V. Elchaninov12-3, T.H. Fatkhudinov1 3, A.V. Makarov13, E.Y. Kananykhina 12,
G.B. Bolshakova 2, V.V. Glinkina 3, DV. Goldshtein 4, G.T. Sukhikh 1
1 Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Moscow, Russia
2 Research Institute of Human Morphology of the RAMS, Moscow, Russia
3 Pirogov Russian National Research Medical University Moscow, Russia
4 Research Centre of Medical Genetics of the RAMS, Moscow, Russia
Положение о иммунопривилегированности, как о неотъемлемом свойстве мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), поставлено в настоящее время под сомнение, поэтому при исследовании судьбы клеток после аллогенной трансплантации необходимо учитывать возможность их элиминации иммунной системой.
В настоящей работе мы проанализировали элиминацию аллогенных ММСК пупочного канатика, меченных РКН26, при различных патологических состояниях: на моделях критической ишемии скелетных мышц и субтотальной резекции печени. В ишемизированной скелетной мышце, неповрежденной селезенке и регенерирующей печени была исследована динамика появления макрофагов, несущих флуоресцентную метку трансплантированных клеток (тб8+РКН26+-клеток).
В селезенке уже через 24 ч после трансплантации 83,2±4,6% РКН26+-клеток окрашивались антителами к CD68, а через 3 сут. их доля достигала 100%. В печени клетки, содержащие флуоресцентную метку, обнаруживали через 3 сут., 96,8±2,2% из них имели фенотип PKH26+CD68+. Через 10 сут. получили сходные результаты. В ишемизированной скелетной мышце доля меченных РКН26 клеток, экспрессирующих CD68, возрастала с 48,1±3,2% на 3 сут. до 76,2±3,9% на 30 сут. после трансплантации.
Таким образом, аллогенные ММСК распознаются и элиминируются иммунной системой организма-хозяина. Скорость элиминации аллогенных ММСК зависит от места введения и времени, прошедшего с момента трансплантации, ее эффективность может достигать 100%. Выявление витального маркера РКН26 (как и других экзогенных маркеров) в живых клетках не может быть однозначным доказательством экзогенного происхождения клетки, что обуславливает необходимость проведения дополнительных исследований для правильной интерпретации результатов.
Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки пупочного канатика, аллогенная трансплантация, элиминация, макрофаги, РКН26.
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) являются уникальным «инструментом» регенеративной медицины. Процедура их получения и экспансии не сопровождается значительными затратами и техническими сложностями. Эти клетки характеризуются высокой пролиферативной активностью, стабильностью фенотипа и генотипа,
е-mail: [email protected]
The transplanted allogeneic multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC) were previously thought to be poorly recognized by host immune system; the prolonged survival of these cells in host tissues was explained by their privileged immune status. As long as this concept is currently being revised, the understanding of MMSC routes should be reconsidered given the emerging role of host immune system in their gradual elimination.
The study was focused upon elimination of PKH26-labeled MMSC, derived from umbilical cord, analyzed in animal models for two distinct pathologies: subtotal liver resection and critical skeletal muscle ischemia. Specific patterns of PK-26-positive macrophages (defined as CD68+ cells) were described for intact spleen and regenerating liver, and for the ischemic skeletal muscle, respectively.
The РК-26-positive cells were observed in spleen of the subtotally hepatectomized model animals at 24 h. after surgery combined with MMSC transplantation; 83,2±4,6% of these were CD68+; the ratio reached 100% 3 days after transplantation. The РК-26-positive cells were also detected in regenerating liver starting from 3 days after transplantation, the great majority of them were CD68+ (96,8±2,2% and 96,3±2,6% for 3 and 10 days after transplantation, respectively).
A different sort of host environment was provided by the damaged skeletal muscle model: productive phase of aseptic inflammation triggered by ischemia. The PKH26-positive fraction in the pool of macrophages significantly increased from 48,1 ±3,2% 3 days to 76,2±3,9% 30 days after transplantation.
Thus, transplanted allogeneic MMSC are recognized and eliminated by host immune system. The rates of elimination depend on site of injection and time elapsed since the injection; the efficacy may reach 100%. The presence of РКН26 vital label (as well as any other exogenous label) in living cell can by no means solely prove its exogenous origin. The massive elimination of MMSC by host macrophages leads to impregnation of the latter with the dye that is masking the true presence of the former. The study accentuates the need of additional criteria for correct data interpretation.
Key words: umbilical cord-derived multipotent stromal cells, allogeneic transplantation, elimination, macrophages, PKH26.
способностью дифференцироваться в разные клеточные типы. Также считается, что ММСК обладают противовоспалительной и иммуномоделирующей активностью [1, 2] и являются иммунопривилегированными клетками, так как не вызывают иммунного отторжения после аллогенных трансплантаций, что обусловлено как непосредственным влиянием
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
46
Оригинальные исследования
на иммунокомпетентные клетки реципиента, так и сниженной экспрессией HLA-I [3, 4]. Иммунопривилегированность данного типа клеток обусловливает возможность применения аллогенных ММСК, выделенных из разных источников, не только для лечения заболеваний с аутоиммунными проявлениями, но и для стимуляции репаративной регенерации различных тканей и органов [5]. По литературным данным иммуносупрессивные свойства ММСК зависят от источника их выделения, и наиболее перспективным кандидатом для аллогенной трансплантации являются ММСК, выделенные из пупочного канатика [6, 7]. В базе данных http://clinicaltrials.gov в настоящее время зарегистрированы десятки клинических испытаний безопасности и эффективности трансплантации ММСК пупочного канатика для терапии социально-значимых заболеваний (в том числе печеночной недостаточности и ишемии нижних конечностей). Все они предполагают аллогенную трансплантацию [8].
В то же время в единичных работах иммунопривилегированность и иммуносупрессивные свойства ММСК поставлены под сомнение [9—11]. Таким образом, при исследовании судьбы клеток после аллогенной трансплантации необходимо учитывать, что они могут быть элиминированы иммунной системой. Кроме того, фрагменты клеток, погибших во время инъекции, также будут фагоцитированы клетками реципиента. В обоих случаях в элиминации трансплантированных клеток ключевую роль играют макрофаги.
Эффективным способом исследования выживаемости, миграции и дифференцировки трансплантированных клеток, в том числе аллогенных, является их прижизненное маркирование перед введением
[12]. Одним из наиболее распространенных маркеров является РКН-26 (Sigma-Aldrich Co LLC, США), представляющий собой высокоэффективный мембранный трейсер с длинным алифатическим хвостом и максимумом эмиссии 567 нм. В линейке РКН (РКН-2, -3, -26, -67) максимальную продолжительность флуоресценции показал именно РКН26: по данным производителя, она составляет 100 дней, однако опубликованы данные и о свечении меченых клеток в течение 14,5 мес. [13]. Маркером РКН-26 пользуются уже более 20 лет. За это время было показано, что данная метка не влияет на скорость пролиферации [14] и возможность направленной дифференцировки стволовых/прогениторных клеток [15], а длительность наблюдения трансплантированных клеток in vivo составляет не менее 6-8 нед. [16, 17]. Благодаря простоте технологии возможно применение РКН26 для мечения клеток не только in vitro, но и in vivo (например, для исследования альвеолярных макрофагов [18]).
При этом РКН26, как и все экзогенные маркеры, имеет существенный недостаток — возможность реутилизации метки другими, изначально не мечеными клетками. Было продемонстрировано, что добавление дебриса, полученного путем гипотонического лизиса из РКН-26-меченных клеток, к культуре интактных клеток через 7 дней приводило к появлению флуоресцирующих клеток. Более того, введение такого дебриса в хвостовую вену крысы приводило к появлению через 7 дней светящихся клеток в печени, селезенке, периферической крови и, в меньшей степени, головном мозге животного [14]. Логично предположить, что «обрывки» клеточных мембран со встроенным трейсером РКН26 могут быть утилизи-
рованы in vivo макрофагами, как это происходит при прямом введении красящего раствора РКН-26 [18], однако подтверждающих данных до сих пор не было опубликовано.
Цель настоящей работы: проанализировать элиминацию трансплантированных аллогенных ММСК пупочного канатика, меченных РКН26, при различных патологических состояниях: на моделях критической ишемии скелетных мышц и субтотальной резекции печени. В первом случае аллогенные ММСК трансплантировали внутримышечно через 7 сут. после ишемического повреждения на фоне выраженной воспалительной инфильтрации, в том числе макрофагальной. При использовании второй модели сразу после субтотальной резекции печени аллогенные ММСК вводили в селезенку, орган с высоким содержанием резидентных активированных макрофагов. В ишемизированной скелетной мышце, неповрежденной селезенке и регенерирующей печени была исследована динамика появления макрофагов, несущих флуоресцентную метку трансплантированных клеток (Сй68 + РКН26 + -клеток).
Материал и методы
В исследовании использовали крыс аутбредного стока Спрейг-Доули массой 300-400 г, полученных из питомника Филиала ИБХ РАН (Пущино). Содержание и использование животных осуществляли в соответствии с Приказом министра здравоохранения СССР № 755 от 12 августа 1977 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных».
Получение культуры ММСК пупочного канатика
крысы и мечение с помощью РКН-26
Культуры ММСК получали из интерваскулярной ткани пупочного канатика новорожденных крысят методом эксплантов [19]. Принадлежность полученных культур к ММСК верифицировали по способности клоногенного роста на необработанном пластике, специфическому профилю экспрессии поверхностных антигенов и возможности направленной диффе-ренцировки в мезодермальные линии [20].
Процедуру витального мечения клеток проводили на 3 пассаже трейсером РКН-26 (Sigma-Aldrich Co LLC, США) в соответствии с рекомендациями производителя, после чего дважды отмывали клетки физиологическим раствором (ПанЭко, Россия). Далее меченые ММСК пупочного канатика переносили в культуральную посуду (для оценки эффективности мечения) или шприцы (для введения экспериментальным животным).
Интраспленальное введение РКН-26-меченных
ММСК
Животных (n = 12) наркотизировали диэтиловым эфиром (МедХимПром, Россия), после чего вскрывали брюшную полость, удаляли срединную, левую боковую и правую верхнюю доли печени (всего 80% общей массы печени). Клеточную суспензию (2,5х106 ММСК в 1 мл физиологического раствора) вводили интраспленально путем многократного обкалывания с помощью инсулинового шприца (диаметр иглы 27G). Животных выводили из эксперимента
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
Оригинальные исследования
47
с помощью С02-камеры через 24 ч, 3 и 10 сут. после трансплантации.
Внутримышечное введение РКН-26-меченных
клеток
Животных (n = 12) наркотизировали Золетилом 20 мг/кг (Virbac, Франция) и Рометаром 5 мг/кг (Bioveta, Чехия), после чего иссекали бедренную и подколенную артерии, что приводило к устойчивой ишемии икроножных мышц, сопровождающейся хроническим асептическим воспалением [21]. Через 7 дней после моделирования ишемии клеточную суспензию (5х10в ММСК в 1 мл физиологического раствора) вводили внутримышечно путем многократного обкалывания мышц голени с помощью инсулинового шприца (диаметр иглы 27G). Животных выводили из эксперимента с помощью C02-камеры через 3, 10 и 30 сут. после трансплантации. Выделяли комплекс мышц голени: краниальную и каудальную большеберцовые мышцы, трехглавую мышцу голени, состоящую из икроножной мышцы и камбаловидной мышцы, подошвенную мышцу, длинную малоберцовую мышцу, короткую малоберцовую мышцу.
Иммуногистохимическое исследование
Полученный материал фиксировали в жидком азоте, после чего готовили криосрезы толщиной 5—7 мкм. Гистологические препараты окрашивали антителами к маркеру макрофагов CD68 (1 мкг/мл, ab125212, Abcam, США), затем антителами, конъюгированными с FITC (5 мкг/мл, ab97050, Abcam, США), ядра клеток докрашивали DAPI (Sigma-Aldrich Co LLC, США). Исследование проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM 4000 B и программного обеспечения LAS AF v.3.1.0 build 8587 (Leica Microsystems CMS GmbH, Германия), которое позволяет обрабатывать изображения в выбранных каналах. Для выявления PKH-26 + CD68 + -клеток в красном и синем каналах отмечали ядра клеток с красным РКН-26 в цитоплазме, затем в синем и зеленом каналах маркировали другим цветом ядра CD68 + -клеток среди отмеченных ранее клеток. PKH26 + CD68 + -клетки подсчитывали как минимум на 100 полях зрения (увеличение х400) для каждого животного и определяли их отношение к общему количеству клеток, несущих метку PKH-26.
Статистический анализ
Средние значения и стандартные ошибки среднего определяли по формулам для долей. Границы 95% доверительных интервалов для долей рассчитывали с помощью ф-критерия. Сравнение двух выборочных долей проводили с помощью z-критерия. В случае сравнения нескольких групп анализ проводили с помощью рангового однофакторного дисперсионного анализа Краскела — Уоллиса. Полученные данные анализировали с помощью программы Sigma Stat 3.5 (Systat Software Inc, США). Достоверными считали различия при р<0,05.
Результаты
Эффективность мечения ММСК пупочного канатика
крысы витальным маркером РКН-26
Все полученные из интерваскулярной стромы пупочных канатиков новорожденных крысят клеточные культуры представляли собой ММСК: они были способны к клоногенному росту на необработанном пластике, экспрессировали CD73, CD90, CD105, не экспрессировали CD11b (маркер моноцитов, макрофагов и гранулоцитов), CD19, CD34, CD45, были способны к направленной дифференцировке в адипогенном, хон-дрогенном и остеогенном направлениях.
После процедуры витального мечения маркером РКН-26 во всех клетках наблюдали появление свечения мембранных органелл с максимумом эмиссии 567 нм. Внедрение метки не влияло на способность клеток к пролиферации, при этом флуоресцирующие частицы равномерно распределялись по дочерним клеткам без выбрасывания во внешнюю среду (рис. 1).
Элиминация РКН26-меченных ММСК
в селезенке
После введения 1 мл суспензии клеток в селезенку гибель животных в первые часы после операции не имела места, разрыва капсулы органа не наблюдали. Селезенка значительно увеличивалась в размерах и в месте инъекции определялось необильное кровотечение, которое быстро прекращалось. Через 24 ч в местах инъекций меченые клетки были выявлены в виде скоплений — так называемых треков введения (рис. 2А). Через 3 сут. большую часть клеток обнаруживали преимущественно в красной пульпе, где они располагались диффузно. Единичные клетки можно было детектировать и в белой пульпе (рис. 2Б).
Рис. 1. ММСК пупочного канатика крысы, внедрение метки РКН-26:
А — фазово-контрастная микроскопия, Б — флуоресцентная микроскопия, В — совмещение изображений. Масштабный отрезок: 200 мкм
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
48
Оригинальные исследования
А
Б
В
24 ч
72 ч
Время после трансплантации
Рис. 2.
Аллогенные ММСК пупочного канатика, меченные РКН26, в селезенке после субтотальной резекции печени; динамика элиминации ММСК: А — 24 ч; Б — 72 ч после интраспленальной трансплантации;
В — изменение доли CD68+PKH26+-клеток.
Флуоресцентная микроскопия, реакция с антителами к CD68 (зеленый).
Докраска ядер DAPI.
Масштабный отрезок: 50 мкм
Введение аллогенных ММСК пупочного канатика не влияло на распределение макрофагов в селезенке, которые располагались в селезеночных тяжах красной пульпы и, в меньшей степени, мантийной и маргинальной зонах белой пульпы [22]. При иммуногистохимическом исследовании часть меченых клеток реагировали с антителами к маркеру макрофагов CD68 (рис. 2А, Б), что свидетельствует о фагоцитозе макрофагами меченых ММСК или фрагментов их мембран. Через 24 ч. после трансплантации 83,2±4,6% РКН-26-положительных клеток окрашивались антителами к CD68. А через 3 сут. 100,0±0,2% меченых клеток были CD68-позитивными (р<0,05) (рис. 2В).
В печени клетки, содержащие флуоресцентную метку, обнаруживались через 3 сут. (рис. 3А). Меченые клетки диффузно распределялись по ткани
регенерующей печени, в одном поле зрения (х400) можно было выявить не более двух клеток. При окрашивании криосрезов антителами к CD68 было выявлено, что 96,8±2,2% меченых клеток имели фенотип PKH26 + CD68+ (рис. 3В).
Через 10 сут. меченые клетки в печени сохраняли свою морфологию и локализацию (рис. 3Б). Доля меченых клеток, окрашенных с помощью антител к маркеру макрофагов, не изменялась и составляла 96,3±2,6% (р>0,05), (рис. 3В).
Кроме того, мы обнаружили, что на 10 сут. после резекции в печени происходило статистически значимое снижение количества макрофагов в каждом поле зрения по сравнению с 3 сут. (33±1,4 против 38±1,8, p<0,05). При этом доля макрофагов, несущих флуоресцентную метку, статистически значимо возрастала с 4,4±1,1% до 6,6±1,9% (p<0,05).
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
Оригинальные исследования
49
А
Б
В
Рис. 3. Аллогенные ММСК пупочного канатика, меченные РКН26, в регенерирующей печени; динамика элиминации ММСК:
А — 3 сут.;
Б — 10 сут. после интраспленальной трансплантации;
В — изменение доли CD68+PKH26+-клеток. Флуоресцентная микроскопия, реакция с антителами к CD68 (зеленый).
Докраска ядер DAPI.
Масштабный отрезок: 50 мкм
Элиминация РКН26-меченных ММСК в ишемизированной скелетной мышце
ММСК вводили непосредственно в область повреждения через 7 сут. после моделирования ишемии на фоне продуктивной стадии воспаления. Трек введения визуализировался на 3 сут. и, в меньшей степени, на 10 сут. после введения: светящиеся в оранжевой части спектра клетки располагались в области повреждения в виде скоплений (рис. 4А). На 30 сут. меченые клетки диффузно распределялись
в области повреждения и перимизии перифокальной зоны (рис. 4Б, В).
Макрофагальная инфильтрация ишемизированной скелетной мышцы в области повреждения была достаточно выражена и на 3, и на 30 сут. после трансплантации: 26,9±1,6% и 24,8±1,7%, соответственно (р = 0,415). Доля CD68+-клеток среди РКН26 + -клеток возрастала с 48,1±3,2% на 3 сут. до 76,2±3,9% на 30 сут. после повреждения (р<0,001) (рис. 4Г).
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
50
Оригинальные исследования
А
Б
В
Г
О -N©
1_ О5'
о >,
“ £
CD ГО
а и
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
3 сут. 10 сут. 30 сут.
Время после трансплантации
Рис. 4. Аллогенные ММСК пупочного канатика, меченные РКН26, в ишемизированной скелетной мышце; динамика элиминации ММСК: А — 3 сут., Б — 10 сут.; В — 30 сут. после внутримышечной трансплантации; Г — изменение доли CD68+PKH26+-клеток.
Флуоресцентная микроскопия, реакция с антителами к CD68 (зеленый).
Докраска ядер DAPI.
Масштабный отрезок: 50 мкм
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
Оригинальные исследования
51
Обсуждение
В обеих экспериментальных моделях, независимо от того, вводили ли клетки в очаг асептического воспаления или интактную селезенку на фоне субтотальной резекции печени, наблюдали появление флуоресцентной метки РКН-26 в макрофагах, что может быть обусловлено фагоцитозом как выживших, так и фрагментов погибших при трансплантации клеток.
Как следует из полученных результатов, элиминация аллогенных ММСК происходила с большей интенсивностью в селезенке — органе с высоким содержанием активно фагоцитирующих макрофагов
[22]. Скорость элиминации трансплантированных клеток в селезенке может быть очень важна для исследований, в которых данный способ введения рассматривают как безопасный [23] и достаточно эффективный для доставки клеток в поврежденную печень (вследствие общности кровотока этих органов) [24, 25]. Нами показано, что через 72 ч в селезенке практически все трансплантированные клетки были элиминированы, а маркер РКН26 присутствовал только в макрофагах, при этом в печени все же наблюдали единичные меченые клетки с фенотипом CD68-, что подтверждает их миграцию из селезенки. Появление макрофагов, несущих метку РКН-26, в печени может свидетельствовать об элиминации мигрировавших аллогенных ММСК в самой печени, хотя невозможно исключить вероятность миграции в печень макрофагов селезенки, фагоцитировавших метку.
Во втором эксперименте аллогенные ММСК трансплантировали в очаг ишемического повреждения скелетной мышцы, т.к. внутримышечное введение стволовых/прогениторных клеток чаще всего исследуют при клеточной терапии хронической и критической ишемии нижних конечностей [26]. Трансплантация клеток через 7 сут. после моделирования ишемии задних конечностей является более эффективной, чем введение через 24 ч [27], которое используется в большинстве подобных работ [26]. И на 3, и на 30 сут. после трансплантации ММСК мы наблюдали выраженную макрофагальную инфильтрацию, обусловленную, в первую очередь, сохраняющимся воспалением на фоне хронической ишемии. Инфильтрация на поздних сроках, вероятно, вызвана участием макрофагов в элиминации аллогенно трансплантированных клеток, что подтверждается увеличением доли CD68+-клеток среди общего количества меченых клеток.
Могло ли быть появление РКН26 + CD68 + -клеток результатом слияния? В отношении данного феномена при клеточной трансплантации в научной литературе много противоречивой информации. В подавляющем большинстве исследований in vivo не найдено доказательств слияния трансплантированных и резидентных клеток [28, 29]. В одной из современных работ на эту тему было показано, что при со-культивировании ММСК с клетками эпителиальных линий доля слившихся клеток может достигать 1,3±0,2%, причем все они в 1,3—1,8 раз крупнее исходных клеток, а большинство содержит 2 и более ядер. В этом же исследовании при подкожной трансплантации NOG иммунодефицитным мышам одновременно ММСК и клеток эпителиальных линий через 50 дней наблюдали лишь единичные слившиеся клетки (но слившиеся не с клетками реципиента,
а с совместно введенными экзогенными) [30]. В нашем же исследовании среди PKH26 + CD68 + -клеток мы не наблюдали аномально крупных или многоядерных клеток. Действительно, возможность слияния клеток отрицать полностью нельзя, однако слияние 100% и даже 30% клеток считается маловероятным.
Таким образом, появление PKH26 + CD68+-клеток можно рассматривать как результат фагоцитоза трансплантированных меченых клеток или их фрагментов макрофагами in vivo. Несмотря на элиминацию трансплантированных аллогенных ММСК, они все же оказывают положительный эффект на течение репаративных процессов, что было показано в многочисленных экспериментальных и клинических исследованиях [31, 32]. В связи с этим возникает вопрос о механизмах терапевтического действия аллогенных клеток. Вероятность дифференциров-ки ММСК в специализированные клетки ткани уже считается маловероятной даже при трансплантации аутогенных клеток. По-видимому, стимуляция регенерации происходит главным образом за счет пара-кринных факторов регуляции [33, 34]. Большое значение в терапевтической активности ММСК имеет их воздействие на воспаление, реализуемое за счет тех же паракринных факторов, в частности, повышения продукции IL-4, IL-13, TSG-6 и снижения TNFa, IL-6 [35-37]. Уменьшение воспалительной реакции может быть обеспечено за счет влияния паракрин-ных факторов на клетки иммунной системы, в особенности на макрофаги [37]. После трансплантации ММСК происходит увеличение доли активированных макрофагов альтернативного фенотипа M2 (противовоспалительных) и уменьшение провоспалительных макрофагов М1 [35]. Безусловно, интересным является изучение этого феномена и при аллогенных трансплантациях.
Изучение взаимодействия трансплантированных ММСК и макрофагов организма-реципиента также требует использования витального маркера. Однако главным недостатком практически всех экзогенных маркеров является возможность захвата метки фагоцитирующими клетками. В эксперименте in vitro было показано, что со-культивирование меченых ММСК костного мозга и активированных макрофагов в течение 96 ч приводило к появлению макрофагов с меткой, доля их в случае использования наночастиц оксида железа составляла до 20%, а для BrdU — около 10% [38]. Эта же группа авторов показала, что подкожное локальное введение меченых ММСК в Матригель приводит через 14 дней к появлению меченых макрофагов, мигрировавших к месту повреждения; доля макрофагов составляла от 5% до 15% всех меченых клеток в зависимости от типа маркера (наночастицы оксида железа, BrdU или лентивирусная трансдук-ция GFP) [39]. Возможность захвата витального маркера резидентными клетками in vivo показана для большинства использующихся меток (красителей, радиоактивных и наноразмерных частиц, репортерных генов) [12, 39].
Выходом из сложившейся ситуации могло бы стать использование иммунодефицитных экспериментальных животных, однако в большинстве распространенных в настоящее время линий (SCID, NOD/SCID, Rag2, nude) функциональная активность макрофагов не затронута. Возможно, более эффективным окажется использование линии мышей
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
52
Оригинальные исследования
NOD/SCIDIL2rgnilN, несущей дополнительную мутацию в g-цепи рецептора интерлейкина-2, в которых также повреждены дендритные клетки и макрофаги [40]. При этом следует учитывать, что утилизация метки возможна и иными клетками ретикулоэндотелиаль-ной системы [41].
Заключение
Аллогенные ММСК распознаются и элиминируются иммунной системой организма-хозяина. Скорость их элиминации зависит от места введения и времени, прошедшего с момента трансплантации, ее эффективность может достигать 100%. Выявление витального маркера РКН-26 (как и других экзоЛИТЕРАТУРА:
1. Le Blanc K. Immunomodulatory effects of fetal and adult mesenchymal stem cells. Cytotherapy 2003; 5(6): 485-9.
2. Nauta A.J., Fibbe W.E. Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells. Blood 2007; 110(10): 3499-506.
3. Barry F.P., Murphy J.M., English K. et al. Immunogenicity of adult mesenchymal stem cells: lessons from the fetal allograft. Stem Cells Dev. 2005; 14(3): 252-65.
4. De Miguel M.P., Fuentes-Julian S., Blazquez-Martinez A. et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells: advances and applications. Curr. Mol. Med. 2012; 12(5): 574-91.
5. Farini A., Sitzia C., Erratico S. et al. Clinical applications of mesenchymal stem cells in chronic diseases. Stem Cells Int. 2014; 2014: 306573.
6. Weiss M.L., Anderson C., Medicetty S. et al. Immune properties of human umbilical cord Wharton's jelly-derived cells. Stem Cells 2008; 26(11): 2865-74.
7. Manochantr S., U-pratya Y., Kheolamai P. et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton's jelly and umbilical cord. Intern. Med. J. 2013; 43(4): 430-9.
8. Database of publicly and privately supported clinical studies of human participants. http://www.clinicaltrials.gov.
9. Dimarino A.M., Caplan A.I., Bonfield T.L. Mesenchymal stem cells in tissue repair. Front. Immunol. 2013; 4: 201.
10. Nauta A.J., Westerhuis G., Kruisselbrink A.B. et al. Donor-derived mesenchymal stem cells are immunogenic in an allogeneic host and stimulate donor graft rejection in a nonmyeloablative setting. Blood 2006; 108(6): 2114-20.
11. Sudres M., Norol F., Trenado A. et al. Bone marrow mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro but fail to prevent graft-versus-host disease in mice. J. Immunol. 2006; 176(12): 7761-7.
12. Lin C.S., Xin Z.C., Dai J. et al. Commonly used mesenchymal stem cell markers and tracking labels: Limitations and challenges. Histol. Histopathol. 2013; 28(9): 1109-16.
13. Rieck B. Unexpected durability of PKH 26 staining on rat adipocytes. Cell Biol. Int. 2003; 27(5): 445-7.
14. Li P., Zhang R., Sun H. et al. PKH26 can transfer to host cells in vitro and vivo. Stem Cells Dev. 2013; 22(2): 340-4.
15. Tao R., Sun T.J., Han Y.Q. et al. Optimization of in vitro cell labeling methods for human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2014; 18(8): 1127-34.
16. Kramann R., Kunter U., Brandenburg V.M. et al. Osteogenesis of heterotopically transplanted mesenchymal stromal cells in rat models of chronic kidney disease. J. Bone Miner. Res. 2013; 28(12): 2523-34.
17. Zheng S.X., Weng Y.L., Zhou C.Q. et al. Comparison of cardiac stem cells and mesenchymal stem cells transplantation on the cardiac electrophysiology in rats with myocardial infarction. Stem Cell Rev. 2013; 9(3): 339-49.
18. Maus U., Herold S., Muth H. et al. Monocytes recruited into the alveolar air space of mice show a monocytic phenotype but upregulate CD14. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2001; 280(1): L58-68.
19. Арутюнян И.В., Макаров А.В., Фатхудинов Т.Х. и соавт. Выделение культуры мультипотентных стромальных клеток пупочного канатика крысы методом эксплантов. Клиническая и экспериментальная морфология 2012; 3: 57-61.
20. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006; 8(4): 315-7.
21. Арутюнян И.В., Макаров А.В., Фатхудинов Т.Х. и соавт. Верификация хронической ишемии нижних конечностей при моделировании на лабораторных животных. Клиническая и экспериментальная морфология 2012; 3: 47-53.
22. Cesta M.F. Normal structure, function, and histology of the spleen. Toxicol. Pathol. 2006; 34(5): 455-65.
23. Li J., Li M., Niu B. et al. Therapeutic potential of stem cell in liver regeneration. Jianping GONG Front. Med. 2011; 5(1): 26-32.
генных маркеров) в живых клетках не может быть однозначным доказательством экзогенного происхождения клетки, что обуславливает необходимость проведения дополнительных исследований для правильной интерпретации результатов.
Благодарности
Данная работа была выполнена при финансовой поддержке РФФИ (Соглашение 14-04-01224 от 26 декабря 2013 года и Соглашение 14-04-01038 от 03 февраля 2014 года) и гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых № 14.120.14.6239 от 3 февраля 2014 г.
24. Cho J.W., Lee C.Y., Ko Y. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells overexpressing human forkhead box A2 gene in the regeneration of damaged liver tissues. J. Gastroenterol. Hepatol. 2012; 27(8): 1362-70.
25. Sun S., Chen G., Xu M. et al. Differentiation and migration of bone marrow mesenchymal stem cells transplanted through the spleen in rats with portal hypertension. PLoS One 2013; 8(12): e83523.
26. Liew A., O'Brien T. Therapeutic potential for mesenchymal stem cell transplantation in critical limb ischemia. Stem Cell Res. Ther. 2012; 3(4): 28.
27. Moon M.H., Kim S.Y., Kim Y.J. et al. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells improve postnatal neovascularization in a mouse model of hindlimb ischemia. Cell Physiol. Biochem. 2006; 17(5-6): 279-90.
28. Xu H., Miki K., Ishibashi S. et al. Transplantation of neuronal cells induced from human mesenchymal stem cells improves neurological functions after stroke without cell fusion. J Neurosci. Res. 2010; 88(16): 3598-609.
29. Sato Y., Araki H., Kato J. et al. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion. Blood 2005;106(2): 756-63.
30. Ferrand J., №ё! D., Lehours P. et al. Human bone marrow-derived stem cells acquire epithelial characteristics through fusion with gastrointestinal epithelial cells. PLoS One 2011; 6(5): e19569.
31. Макаров А.В., Арутюнян И.В., Фатхудинов Т.Х. и др. Влияние трансплантации мультипотентных стромальных клеток пупочного канатика на состояние ишемизированной мышечной ткани конечностей крыс. Клиническая и экспериментальная морфология 2013; 4(8): 45-52.
32. Togel F., Westenfelder C. The role of multipotent marrow stromal cells (MSCs) in tissue regeneration. Organogenesis 2011; 7(2): 96-100.
33. Mastri M., Lin H., Lee T. Enhancing the efficacy of mesenchymal stem cell therapy. World J. Stem Cells 2014; 6(2): 82-93.
34. Nakajima H., Uchida K., Guerrero A.R. et al. Transplantation of mesenchymal stem cells promotes an alternative pathway of macrophage activation and functional recovery after spinal cord injury. Neurotrauma 2012; 29(8): 1614-25.
35. Cho D.I., Kim M.R., Jeong H.Y. et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Exp. Mol. Med. 2014; 46: e70.
36. Kim H., Darwish I., Monroy M.F. et al. Mesenchymal stromal (stem) cells suppress pro-inflammatory cytokine production but fail to improve survival in experimental staphylococcal toxic shock syndrome. BMC Immunol. 2014; 15: 1.
37. Melief S.M., Schrama E., Brugman M.H. et al. Multipotent stromal cells induce human regulatory T cells through a novel pathway involving skewing of monocytes toward anti-inflammatory macrophages. Stem Cells 2013; 31(9): 1980-91.
38. Pawelczyk E., Arbab A.S., Chaudhry A. et al. In vitro model of bromodeoxyuridine or iron oxide nanoparticle uptake by activated macrophages from labeled stem cells: implications for cellular therapy. Stem Cells 2008; 26(5): 1366-75.
39. Pawelczyk E., Jordan E.K., Balakumaran A. et al. In vivo transfer of intracellular labels from locally implanted bone marrow stromal cells to resident tissue macrophages. PLoS One 2009; 4(8): e6712.
40. Ito M., Hiramatsu H., Kobayashi K. et al. NOD/SCID/gamma(c) (null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood 2002; 100(9): 3175-82.
41. Noad J., Gonzalez-Lara L.E., Broughton H.C. et al. MRI tracking of transplanted iron-labeled mesenchymal stromal cells in an immune-compromised model of critical limb ischemia. NMR Biomed. 2013; 26(4): 458-67.
Поступила: 01.07.2014
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
