CC BY
47
Биология
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2008, № 3, с. 92-97
УДК 577.3
ИССЛЕДОВАНИЕ КОНТРАСТИРУЮЩИХ СВОЙСТВ ЗОЛОТЫХ НАНОЧАСТИЦ ДЛЯ ОПТИЧЕСКОЙ КОГЕРЕНТНОЙ ТОМОГРАФИИ
12 2 и 23
© 2008 г. М.В. Ширманова ’ , Е.В. Загайнова , И.В. Балалаева , А.Г. Орлова ,
Н.А. Саунина \ В.А. Каменский 3
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
2 Нижегородская государственная медицинская академия
3 Институт прикладной физики РАН, Н. Новгород
Shirmanovam@mail. ru
Поступила в редакцию 12.05.2008
Проведено in vivo исследование возможности контрастирования изображений, полученных методом оптической когерентной томографии (ОКТ), с помощью золотых наночастиц при однократном и многократном нанесении раствора на поверхность кожи животных. Показано, что золотые наночастицы размером 50 нм, проникая в дерму, приводят к более четкой визуализации отдельных морфологических структур на ОКТ-изображениях. После однократного нанесения коллоидного раствора золотых наночастиц на ОКТ-изображениях контрастируются волосяные фолликулы, облегчается идентификация поверхностной дермы. Наиболее информативные изображения получены через 2.5 ч после нанесения наночастиц. Наличие наночастиц в коже подтверждено электронной микроскопией.
Ключевые слова: оптическая когерентная томография, золотые наночастицы, электронная микроскопия.
Введение
Оптическая когерентная томография - неинвазивный метод получения изображения биотканей на глубину до 2 мм с пространственным разрешением 10-15 мкм, основанный на интер-ферометрическом детектировании обратно рассеянного света ближнего инфракрасного (ИК) диапазона (0.75-1.3 мкм) [1]. За последние годы доказана эффективность ОКТ в различных областях клинической практики для прижизненной визуализации покровных тканей организма - кожи и слизистых оболочек [2, 3].
Сложный характер взаимодействия оптического излучения с биологическими тканями, обусловленный их оптической неоднородностью, значительно ограничивает контрастирование отдельных структур и глубину зондирования ОКТ. Для просветления ОКТ-изображений традиционно применяются иммерсионные жидкости - глицерол, пропиленгликоль, концентрированные растворы глюкозы [4, 5]. Немногочисленные недавние исследования на модельных средах и ex vivo демонстрируют перспективность использования в качестве контрастирующего агента наноразмерного золота [6, 7], однако сведений, полученных на биологических объектах прижизненно, в литературе очень мало [8]. Для оценки возможности применения в перспективе наноразмерного золота в
клинике необходимо проведение дополнительных исследований.
Цель нашей работы - изучение эффективности применения золотых наночастиц в качестве контрастирующего агента для метода ОКТ при нанесении раствора на поверхность кожи in vivo.
Материалы и методы
Объектом исследования служили кролики породы Белый Великан массой 3-3.5 кг, содержавшиеся в стандартных условиях вивария.
В исследовании использовался оптический когерентный томограф (ИПФ РАН, Н. Новгород), оснащенный съемным гибким зондом с внешним диаметром 2.7 мм и имеющий следующие технические характеристики: длина
волны излучения 1300 нм, мощность источника излучения 2 мВт, пространственное разрешение 15-20 мкм, глубина сканирования - до 1.5 мм, время получения двумерного изображения размером 200х200 точек 1.5-2 секунды. ОКТ-изображения представлены в серой палитре, где светлые оттенки соответствуют большей интенсивности отраженного света. ОКТ-зонд устанавливался на поверхность кожи перпендикулярно с одинаковым давлением во всех точках (рис. 1).
Золотые наночастицы, предоставленные ИБФРМ РАН (г. Саратов), со средним диамет-
ром 50 нм, были приготовлены по методу Френса, путем восстановления золотохлористоводородной кислоты цитратом натрия [9]. Концентрация золота составляла 57 мкг/мл [10]. Электронная микрофотография наночастиц представлена на рис. 2.
тых наночастиц мы исследовали их влияние на ОКТ-характеристики кожи при однократном и многократном нанесении, а также в сравнении со стандартным просветляющим биосовмести-мым агентом - пропиленгликолем.
Однократное нанесение коллоидного раствора (pH 6.0) золотых наночастиц производилось in vivo на участки здоровой кожи двух локализаций, различающихся толщиной тканевых слоев и степенью оволосения: на внутреннюю сторону уха и бедро (после предварительной депиляции). Эффекты многократного нанесения золотых наночастиц и однократной аппликации пропиленгликоля исследовались на коже бедра.
Выбор методики ОКТ-наблюдения произведен с учетом опыта зарубежных авторов [5] и
оптимизирован по времени в предварительном эксперименте. При однократных аппликациях ОКТ-изображения получали до нанесения химического агента (контроль), сразу после нанесения и в дальнейшем через каждые 30 мин в течение 4.5 часов, а также через 24 часа. При многократных аппликациях золотые наночастицы наносили 5 раз с интервалом 30 минут, ОКТ-изображения фиксировали до и непосредственно после каждого нанесения.
По окончании эксперимента была выполнена биопсия соответствующих участков кожи под местной анестезией для световой и электронной микроскопии.
Результаты и их обсуждение
ОКТ-эффекты однократного нанесения золотых наночастиц. Нами получены ОКТ-изображения кожи - интактной и после нанесения золотых наночастиц. Особенностью ОКТ-изображений тонкой кожи уха кролика является наличие выраженной слоистой структуры с четкими границами между слоями (рис. 3). Сопоставление ОКТ-изображений интактной кожи уха с соответствующими гистологическими слайдами позволило обозначить следующие ОКТ-слои: 1-й слой, очень тонкий, соответствует эпидермису; 2-й слой, с достаточно высоким уровнем сигнала соответствует поверхностной дерме, которая содержит в большом количестве волосяные луковицы, кожные железы и сосуды; 3-й слой, неоднородный, с чередованием участков высокого и низкого рассеяния представляет глубокую дерму, относительно бесклеточную, лишенную сосудов плотную соединительную ткань; 4-й слой с низким уровнем ОКТ-сигнала, однородный, одинаковой высоты на всем протяжении, с четкой, контрастной, очень ровной, непрерывной границей с 3-м слоем, соответствует хрящу.
Нами установлено, что аппликация изолированного раствора золотых наночастиц на кожу уха вызывает следующие эффекты: увеличение однородности ОКТ-слоя, соответствующего поверхностной дерме; снижение уровня ОКТ-сигнала в глубокой дерме; уменьшение глубины проникновения ОКТ-сигнала (рис. 4).
Исследование показало, что ОКТ-изображение интактной кожи бедра не имеет выраженной слоистой структуры и идентификация морфологических образований - тканевых слоев и кожных придатков - затруднена. Поэтому сопоставление по размерам ОКТ-изображений и соответствующих гистологических препаратов позволило только предположительно обозна-
Рис. 1. ОКТ-наблюдение кожи внутренней поверхности уха кролика. Зона нанесения наноразмерного золота ограничена метками
Рис. 2. Электронная микрофотография золотых наночастиц со средним диаметром 50 нм. Размер изображения 2.2х1.8 мкм
Для оценки контрастирующих свойств золо-
б
Рис. 3. ОКТ-изображение уха кролика (а) и соответствующий гистологический препарат (б). 1 - эпидермис, 2 - поверхностные слои дермы с волосяными луковицами, 3 - глубокие слои дермы, 4 - хрящ. Размер ОКТ-изображения 2х0.8 мм, гистологического слайда 0.5х0.6 мм
а
Рис. 4. ОКТ-изображения уха кролика перед нанесением (а), через 24 часа (б) после нанесения золотых наночастиц размером 50 нм. 2 и 3 - поверхностная и глубокая дерма. Размер ОКТ-изображений 2х0.8 мм
Рис. 5. ОКТ-изображение (а) и гистологический препарат (б) интактной кожи бедра кролика. 1 - эпидермис, 2 - поверхностная дерма с волосяными луковицами, 3 - глубокие слои дермы. Размер ОКТ-изображения 2х0.8 мм, гистологического слайда 0.7х0.5 мм
чить расположение по глубине отдельных морфологических слоев: эпидермиса, поверхностных и глубоких слоев дермы (рис. 5).
Нанесение коллоидного раствора золотых наночастиц на кожу бедра привело, во-первых, к возрастанию уровня сигнала в верхней части ОКТ-изображения, соответствующей поверхностной дерме, а во-вторых, к контрастированию придатков кожи (в основном волосяных луковиц), которые на ОКТ-изображении выглядят как области более низкого обратного рассеяния
(рис. 6б). Наблюдаемые эффекты позволили идентифицировать поверхностную дерму на ОКТ-изображении. Максимальный эффект контрастирования наблюдался через 2 ч 30 мин после нанесения наночастиц. Через 24 часа высокий уровень ОКТ-сигнала в области поверхностной дермы сохранялся, однако контрастирующие эффекты были снижены (рис. 6).
Таким образом, аппликация золотых наночастиц на кожу бедра кролика оказалась более эффективной для повышения контраста ОКТ-
изображений, чем аппликация на кожу уха. Это связано с морфологическими особенностями указанных участков. ОКТ-изображение уха без наночастиц имеет выраженную слоистую структуру, и нанесение золотых наночастиц в данном случае приводит лишь к повышению контраста ОКТ-слоя, соответствующего поверхностной дерме. ОКТ-изображения интакт-ной кожи бедра практически бесструктурны и слабо информативны, тогда как после нанесения золотых наночастиц они становятся контрастными, с более высоким уровнем ОКТ-сигнала и хорошо выраженными структурами, которые соответствуют волосяным фолликулам.
Мы предполагаем, что проникновение наночастиц в дерму приводит к увеличению числа рассеивателей в ткани и, следовательно, к возрастанию обратного рассеяния зондирующего излучения и повышению интенсивности сигнала на ОКТ-изображениях. На фоне контрастирования волосяных луковиц это ведет к упрощению дифференциации слоев дермы с разной морфологической структурой.
Данные электронной микроскопии подтвердили наличие золотых наночастиц в эпителиальной и соединительной ткани кожи и их отсутствие внутри волосяных фолликулов (рис. 7).
ОКТ-эффекты многократного нанесения золотых наночастиц. Многократное нанесение золотых наночастиц на кожу бедра кролика не оказало ожидаемого эффекта повышения контраста. После второго и третьего нанесений имело место уменьшение глубины изображения с сохранением высокой интенсивности ОКТ-сигнала в поверхностной дерме. Результатом последующих аппликаций стало еще большее снижение уровня полезного сигнала и появление темных вертикальных полос на ОКТ-изображениях. По-видимому многократное нанесение привело к скоплению золотых наночастиц в неровностях на поверхности кожи, что вызвало экранирование ОКТ-сигнала от более глубоких слоев ткани (рис. 8).
Сравнение ОКТ-эффектов наноразмерного золота и пропиленгликоля. Однократное нанесение пропиленгликоля на кожу бедра кролика, как и в случае золотых наночастиц, привело к повышению уровня полезного сигнала и возрастанию интенсивности ОКТ-сигнала в области поверхностной дермы. Однако, в отличие от наноразмерного золота, контрастирование придатков кожи было слабым, а глубина ОКТ-изображений увеличилась. При этом максимальный эффект пропиленгликоля достигается
в
Рис. 6. ОКТ-изображения кожи бедра до нанесения (а), через 2 ч 30 мин (б), через 24 ч (в) после нанесения наночастиц. Стрелками показана волосяная луковица. Размер ОКТ-изображений 2х0.8 мм
Рис. 7. Электронная микрофотография кожи кролика через 24 ч после нанесения коллоидного раствора золотых наночастиц размером 50 нм. Наночастицы на границе двух эпителиальных клеток. Агрегат из трех наночастиц показан стрелкой. Размер изображения 1.25х1.05 мкм
в
Рис. 8. ОКТ-изображения кожи бедра кролика: после первого (а), второго (б) и четвертого (в) нанесений золотых наночастиц. Размер ОКТ-изображений 2х0.8 мм
б
Рис. 9. ОКТ-изображения кожи бедра до нанесения (а), через 1 час (б) после нанесения пропиленглико-ля. 2 и 3 - поверхностная и глубокая дерма. Размер ОКТ-изображений 2х0.8 мм
через 1 ч (рис. 9), в то время как эффекты коллоидного золота более продолжительны и сохраняются до 24 ч, что может быть использовано при длительных дерматологических исследованиях. Наблюдаемые нами ОКТ-эффекты пропиленгликоля согласуются с результатами работы [11].
Мы предполагаем, что различие в ОКТ-эффектах золотых наночастиц и пропиленгликоля связано с разными механизмами влияния данных агентов на оптические свойства биотканей. Повышение информативности ОКТ-изображений после нанесения на поверхность кожи пропиленгликоля достигается, главным образом, за счет его просветляющего действия, то есть за счет увеличения пропускания света верхними слоями исследуемого объекта в результате привлечения дополнительной влаги и выравнивания показателей преломления между рассеивателями и окружающей средой. ОКТ-эффекты золотых наночастиц вызваны повышением контраста изображения, которое обеспечивается увеличением рассеяния назад от структур, содержащих наночастицы.
Заключение
Проведенное нами исследование показало, что золотые наночастицы размером 50 нм проникают в кожу, достигая глубоких слоев дермы. Наличие наночастиц в коже приводит к увеличению обратного рассеяния и повышению интенсивности ОКТ-сигнала. В результате наблюдается контрастирование волосяных луковиц, облегчается идентификация поверхностной дермы. Полученные результаты в перспективе могут быть использованы в экспериментальных работах для повышения информативности ОКТ, а также в дерматологических исследованиях.
Авторы выражают благодарность Сноповой Л.Б. и Бугровой М.Л. (Нижегородская государственная медицинская академия) за выполнение микроскопических исследований, а также Хлебцову Б.Н. (Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов) за предоставление золотых наночастиц.
Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям (проект № 02.522.11.2002).
Список литературы
1. Геликонов В.М., Геликонов Г.В., Гладкова Н.Д. и др. // Письма в ЖЭТФ. 1995. Т. 61. № 2. С.149-153.
2. Fujimoto J.G., Pitris C., Boppart S.A. et al. // Neoplasia. 2000. V. 2. P. 9-25.
3. Руководство по оптической когерентной томографии / Под ред. Н.Д. Гладковой, Н.М. Шаховой, А.М. Сергеева. М.: Физматлит, 2007. 296 с.
4. Bashkatov A.N., Genina E.A., Sinichkin Yu.P., Tuchin V.V. // Proc. SPIE. Bellingham, 2002. V. 4623. P. 144-152.
5. Wang R.K., Elder J.B. // Lasers Surg. Med. 2002. V. 30. P. 201-208.
6. Loo C., Hirsch L., Lee M.-H., Chang E. et al. // Opt. Lett. 2005. V. 30. № 9. P. 1012-1014.
7. Rahman M., Abd-El-Barr M., Mack V. et al. // Gynecologic Oncology. 2005. V. 99. № 3. P. S112-S115.
8. Boppart S., Wei A. Multi-functional plasmon-resonant contrast agents for optical coherence tomography // Patent № US2005171433 (2005).
9. Frens G. // Nature Phys. Sci. 1973. V. 241. P. 20-22.
10. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Хлебцов Б.Н. // Российские нанотехнологии. Т. 2. № 3-4. С. 69-86.
11. Tuchin V.V. // J. Phys. D: Appl. Phys. 2005. V. 38. P. 2497-2518.
A STUDY OF CONTRASTING PROPERTIES OF GOLD NANOPARTICLES FOR OPTICAL COHERENCE TOMOGRAPHY
M. V. Shirmanova, E. V. Zagaynova, I. V.Balalaeva, AG. Orlova, N.A.Saunina, V.A. Kamensky
In vivo study of gold nanoparticles effects on images obtained by optical coherence tomography (OCT) was performed. Colloidal solution of gold nanoparticles was applied on the surface of animal skin one or several times. It has been shown that gold nanoparticles (having an average diameter of 50 nm) penetrate into the dermis and improve visualization of some histological structures on the OCT-images. Hair bulbs and the surface part of the dermis became clearly visible on the OCT-images of the skin after single application of colloidal gold. The most contrasted images were obtained 2.5 h after gold nanoparticles application. The presence of nanoparticles in the skin was confirmed by electron microscopy.
