CC BY
79
ПОВЫШЕНИЕ ИНФОРМАТИВНОСТИ ОПТИЧЕСКОЙ ТОМОГРАФИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТАЛЛИЧЕСКИХ И ПОЛУПРОВОДНИКОВЫХ НАНОЧАСТИЦ
Е.В. Загайнова1, М.В. Ширманова1'2, М.А. Сироткина1, А.Г. Орлова1' 3, И.В. Балалаева2, В.А.Каменский3 1 Нижегородская государственная медицинская академия 2 Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского 3 Институт прикладной физики РАН e-mail: ezagaynova@gmail. com
Работа посвящена экспериментальным исследованиям на животных in vivo контрастирующих свойств наночастиц для оптической томографии. Получено, что золотые нанооболочки и мелкокристаллический диоксид титана обладают контрастирующими свойствами для оптической когерентной томографии. Квантовые точки являются высокоэффективными флюоресцирующими агентами для выявления глубинных опухолей методом флюоресцентной диффузионной томографии.
Одним из основных направлений развития борьбы с онкологическими заболеваниями является создание новых видов безопасных и выскоинформативных способов ранней диагностики. Особенно перспективна разработка различных видов томографии, основанных на оптическом излучении, позволяющих получать информацию из глубины тканей с высоким разрешением. К таковым можно отнести: оптическую когерентную томографию (ОКТ), диффузионную флюоресцентную томографию (ДФТ), оптическую диффузионную томографию. В то же время созданы наноразмерные комплексы, которые не встречаются в природе [1-3]. Уникальные оптические свойства наноразмерных комплексов делают их привлекательными для разработки новых контрастирующих агентов, которые позволяют преодолеть многие ограничения, существующие для томографии.
Наночастицы металлов, такие как золото и серебро, могут обеспечивать калориметрический контраст за счет поверхностного плазмонного резонанса [1012]. Сечение поглощения наночастиц золота на несколько порядков выше, чем у органических красителей. Для частиц различной структуры - "наностержней", многослойных наносфер и др. - требуемая частота плазмонного резонанса может быть достигнута вариацией относительных размеров. Привлекательность наночастиц для использования в биомедицине обеспечивается целым рядом свойств [4-6]: наночастицы золота не подвергаются фотодекомпозиции, они нетоксичны для организма, что позволяет использовать их в прижизненных исследованиях; они обладают высокой стабильностью и сохраняют свойства в условиях живого организма. Одним из перспективных приложений наночастиц золота является их использование в качестве контрастирующих агентов для методов оптической когерентной томографии, оптической диффузионной томографии и др.
Квантовые точки, (QDs) представляют собой коллоидные гидрофильные полупроводниковые кристаллы с размерами 1-10 нм и определяемой квантово-размерными эффектами люминесценцией. По сравнению с органическими красителями, традиционно применяемыми для флуоресцентной диагностики, спектры излучения квантовых точек зависят от размера и состава нанокристаллов, что позволяет существенно упростить технологию получения маркеров с заранее заданными свойствами, в том числе маркеров, спектры поглощения и флуоресценции которых лежат в ближней ИК-области. Высокий квантовый выход определяет значительную яркость квантовых точек в биологических объектах, за счет чего увеличивается как глубина, так и чувствительность методов оптической диагностики. Широкие спектры поглощения позволяют использовать один источник для возбуждения квантовых точек с разной длиной волны люминесценции. Квантовые точки обладают исключительной устойчивостью к
фотообесцвечиванию, что открывает широкие перспективы для долговременного исследования [7-8].
В наших предварительных исследованиях были апробированы золотые наночастицы разного размера и строения. Для ОКТ наиболее эффективными оказались частицы в форме нанооболочек 150/25 нм. Выполнено Монте-Карло моделирование. На фантомах тканей было показано, что частицы повышают уровень ОКТ сигнала и при разных концентрациях агара контрастируют слои друг от друга. Получены хорошие предварительные результаты на коже кролика (9). Материалы и методы. В представленной работе выполнены in vivo исследования контрастирующих свойств металлических наночастиц для метода ОКТ. Исследование проведено на коже свиньи массой 6 кг, содержавшейся в стандартных условиях вивария. На чистую сухую кожу спины наносили однократно каплю, объемом 25 мкл, содержащую 5х1010 наночастиц на мл. На соседний участок наносили каплю воды в качестве контроля. Использовали золотые наночастицы по типу ядро/оболочка размером 150/25 нм (2) и суспензию наночастиц диоксида титана, которую готовили разведением порошка в дистиллированной воде в концентрации 10 мг/мл при комнатной температуре. Полученную суспензию подвергали ультразвуковому диспергированию в течение 20 мин. ОКТ - изображения получали сразу после нанесения наночастиц и в дальнейшем каждые 30 мин в течение 5 ч, а также через 24 ч. ОКТ - зонд устанавливали на поверхность кожи перпендикулярно с одинаковым давлением во всех точках с помощью специального устройства дозированного прижима. Идентификацию кожных структур выполняли по данным стандартной морфологии. Наличие наночастиц в тканях подтверждали электронной микроскопией. В работе использован оптический когерентный томограф (ИПФ РАН, Нижний Новгород) [10], оснащенный съемным гибким зондом и имеющий следующие технические характеристики: длина волны излучения 900 нм, мощность источника излучения 2 мВт, пространственное разрешение 15-20 мкм, глубина сканирования до 1.5 мм, время получения двумерного изображения размером 200х200 точек - 1.52 с.
Квантовые точки использованы в качестве контрастирующих агентов для метода ДФТ. Выполнялись исследования in vivo на животных-опухоленосителях (мыши гибриды линии BDF-1). Использована перевивная опухоль мышей карцинома легких Льюис, полученная в РОНЦ им. Блохина. Квантовые точки состояли из ядра CdSe и оболочки CdS с размерами около 5 нм (3). Возбуждение флюоресценции проводилось лазером с длиной волны 532 нм, максимум флюоресценции наблюдался на 610 нм.
Исследования с квантовыми точками выполнялись на установке для диффузионной флуоресцентной томографии ФДТ-2М (ИПФ РАН, Нижний Новгород) [11]. В ДФТ-установке источниками излучения являются лазеры. Регистрация флуоресцентного сигнала осуществляется с помощью охлаждаемого высокочувствительного фотоэлектронного умножителя (ФЭУ, Hamamatsu H7422-20). Для разделения спектров облучения и флуоресценции используется комбинация интерференционных и абсорбционных фильтров. Сканирование объекта в конфигурации "на просвет" обеспечивается синхронным движением источника и детектора.
Результаты. Контрастирование ОКТ изображений металлическими наночастицами.
Сопоставление ОКТ-изображений с соответствующими гистологическими слайдами показало, что в отсутствии дополнительных
контрастирующих/просветляющих агентов ОКТ - изображение кожи, как правило, бесструктурное, неинформативное, со средним уровнем ОКТ - сигнала,
поверхностные слои дермы на ОКТ - изображениях неоднородные. Крайне редко на ОКТ - изображениях видны кожные придатки (железы, волосяные фолликулы) (рис. 1а).
Мы сравнили контрастирующие эффекты золотых наночастиц с размером 150/25нм и наноразмерного ТЮ2 на коже свиньи. Эффективность наночастиц оценивали по следующим параметрам: глубина проникновения ОКТ - сигнала, однородность поверхностных слоев дермы на ОКТ - изображении, контрастирование придатков кожи (волосяных фолликулов и желез) и длительность эффекта. Можно выделить общие эффекты для всех частиц: наличие четкой границы между эпидермисом и поверхностными слоями дермы (рис. 1в,г), продолжительность контрастирования во всех случаях превышала 24 часа.
Отличительная особенность ОКТ - изображений с золотыми частицами
Рис. 1. ОКТ - изображения кожи свиньи. а - ОКТ контроль, б - гистологический контроль (окраска гематоксилин-эозином, ув.х10) в - через 3,5 часа после нанесения золотых наночастиц с размером 150/25нм, г - через 3,5 часа после аннесения мелкокристаллического ТЮ2.. 1 -эпидермис, 2 - поверхностные слои дермы с волосяными фолликулами, 3 - глуб^ше слои дермы, 4-волосяной фолликул, 5- железы.
заключалась в том, что такие эффекты как высокая глубина проникновения сигнала и однородность поверхностных слоев дермы проявлялась вскоре после нанесения золотых наночастиц (через 30-60 мин), хотя спустя 4 часа после нанесения частиц глубина проникновения ОКТ сигнала начинала уменьшаться. Контрастирование придатков кожи встречалось не так часто и преобладали в основном волосяные фолликулы (рис.1 в). В то время как отличительной особенностью ОКТ -изображений с частицами ТЮ2 являлось наличие большого количества контрастных придатков кожи (преимущественно желез). При этом глубина проникновения сигнала достигала высоких значений, а поверхностные слои дермы на ОКТ - изображении выглядели однородными и яркими (рис.1 г). Контрастирование глубокорасположенных опухолей методом ДФТ с использованием квантовых точек.
Опухоль без флюорофоров визуализировалась на ДФТ установке как область со слабой автофлюоресценцией (рис.2). Перитуморальное введение квантовых точек обеспечило хорошую флюоресценцию опухолевого очага (рис. 2б). Квантовые точки оказались высококонтрастными флюоресцирующими агентами для ДФТ установки и визуализации опухоли в экспериментальном животном.
Однако максимум флюоресценции наблюдался через пять минут, через час все нанокристаллы перераспределились и обнаруживались в основном в лимфатических узлах.
Заключение. Несмотря на то, что и частицы золота, и частицы диоксида титана оказывают практически сходные контрастирующие эффекты на коже животных т vivo, все же механизм действия у них разный. Золотые наночастицы по типу ядро/оболочка с размером 150/25 нм обладают сильным поверхностным плазмонным резонансом в т. н. области «терапевтического окна прозрачности», что приводит к повышенному поглощению и/или рассеянию ими лазерного излучения.
а б
Рис. 2. Флюоресцентная визуализация экспериментальной опухоли на ДФТ установке с использованием квантовых точек. А - ДФТ изображение мыши-опухоленосителя до введения
QD, б - через пять минут после введения.
Частицы диоксида титана не обладают поверхностным плазмонным резонансом, но обладают способностью к обратному рассеиванию света красного и ближнего ИК диапазона длин волн, это свойство позволяет использовать TiO2 как контрастирующий агент для ОКТ-сканирования. Квантовые точки оказались высококонтрастным флюоресцирующим агентом для ДФТ исследований, однако без направляющих агентов быстро перераспределились в барьерные органы.
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (№№ 07-02-01262, 07-0201146, 68-02-99049), Федерального Агентства по Науке и Инновациям (проект № 02.522.11.2004) и Программы фундаментальных исследований президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине».
1. Разумов В.Ф. Наночастицы и химические реакции в мицеллярных системах. Доклад на научной сессии Секции химических наук Отделения химии и наук о материалах РАН. 2003.
2. Khlebtsov N.G., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Khlebtsov B.N., Krasnov Ya.M. Differential light scattering spectroscopy: a new approach to studies of colloidal gold nanosensors. J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transfer 2004. Vol. 89, No 1-4. P. 133-142.
3. Vasiliev R.B., Dorofeev S.G., Dirin D.N., Belov D.A., Kuznetsova T.A. Synthesis and optical properties of PbSe and CdSe colloidal quantum dots capped with oleic acid. Mendeleev Commun. 2004. № 4. 169-171.
4. Daniel M-C., Astruc D. Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and Nanotechnology. Chem. Rev. 2004. Vol. 104. 293-346.
5. Loo C., Hirsch L., Lee M.-H., Chang E., West J., Halas N., Drezek R. Gold nanoshell bioconjugates for molecular imaging in living cells, Optics Letters. 2005. Vol. 30, No. 9. 1012-1014.
6. Jingyi Chen, Fusayo Saeki, Benjamin J. Wiley, Hu Cang, Michael J. Cobb, Zhi-Yuan Li, Leslie Au, Hui Zhang, Michael B. Kimmey, Xingde Li, and Younan Xia, Gold Nanocages: Bioconjugation and Their Potential Use as Optical Imaging Contrast Agents, Nano LETTERS, 2005. Vol. 5, No. 3. 473-477.
7. Warren C.W. Chan, Shuming Nie. Quantum Dot Bioconjugates for Ultrasensitive Nonisotopic Detection. Science. 1998, Vol. 281, No 5385. 2016-2018.
8. Wen Jiang, Papa Eli, Fischer Hans, Mardyani Sawitri, Chan Warren C.W. Semiconductor quantum dots as contrast agents for whole animal imaging. 2004. Vol. 22, No12. 607-609.
9. Загайнова Е.В., Ширманова М.В., Каменский В.А., Кириллин М.Ю., Орлова А.Г., Балалаева И.В., Хлебцов Б.Н., Сергеев А.М. Исследование контрастирующих свойств золотых наночастиц для метода ОКТ. Российские нанотехнологии. 2007. N2. C 135-143.
10. Gelikonov V.M., Gelikonov G.V., Dolin L.S., Kamensky V.A., Sergeev A.M., Shakhova N.M., Gladkova N.D., Zagaynova E.V. Optical Coherence Tomography: Physical Principles and Applications // Laser Physics, 2003. V. 13. №. 5. P. 692-702.
11. Turchin I.V., Plehanov V.I., Orlova A.G. et. al. Fluorescence diffuse tomography of small animals with DsRed2 fluorescent protein. Laser Physics 2006; 16 (5): 741-746.
INCREASING OF INFORMATIVENESS OF OPTICAL TOMOGRAPHY WITH USING GOLD NANOPARTICLES AND QUANTUM DOTS
E.V. Zagainova1, M.V. Shirmanova1,2, M.A. Sirotkina2, A.G. Orlova1,3, I.V. Balalaeva2 , V.A.Kamensky3 1 Nizhny Novgorod State Medical Academy 2 N.I. Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod 3 Institute of Applied Physics of RAS ezagavnova@gmail.com
In the present paper we describe the results of animal studies of nanoparticles contrasting properties for optical tomography. It has been shown, that gold nanoshells and titanium dioxide nanoparticles are very effective contrasting agents for OCT imaging. Quantum dots are excellent fluorofores for detection deep tumors in whole body by fluorescence diffuse tomography.
