CC BY
27
ШАРАФУТДИНОВА Р.Р., НАСИБУЛЛИН Р.С., ФАХРЕТДИНОВА Е.Р
УДК 539.1: [577.127.4:543.42]
ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАЦИОННОГО СОСТОЯНИЯ КВЕРЦЕТИНА ПРИ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИИ С ЛЕЦИТИНОМ
ШАРАФУТДИНОВА Р.Р., НАСИБУЛЛИН Р.С., ФАХРЕТДИНОВА Е.Р.
Башкирский государственный медицинский университет, 450000, г.Уфа, ул. Ленина, 3
АННОТАЦИЯ. Методами квантовой химии и ЯМР-спектроскопии 1H, 13C было исследовано взаимодействие молекулы группы флавоноидов - кверцетина с клеточным фосфатидилхолином (ФХ). Установлен комплекс кверцетин-ФХ, формирующийся посредством взаимодействия п-системы электронов колец кверцетина c холиновой группой лецитина. Его существование подтверждено экспериментами ЯМР. Исследованы конформационные состояния кверцетина, возникающие при комплексообразовании с лецитином.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА:
Оверхаузера (ЯЭО)
кверцетин, лецитин, квантово-химические расчеты, ЯМР, ядерный эффект
Данная работа является продолжением исследований взаимодействия молекул группы флавоноидов с клеточным фосфатидилхолином [1]. Ранее были рассмотрены изменения электронного строения и геометрии ФХ комплекса биоактивное соединение - лецитин [2]. Однако, при образовании комплекса, происходят изменения в строении и самой биоактивной молекулы, в данном случае кверцетина [3].
В настоящем сообщении приведены результаты изучения комплекса, образующегося за счет взаимодействия п-системы элек-ронов ароматических циклов 3,5,7,3',4' - пентаоксифлавонола (кверцетин) с холиновой группой клеточного фосфатидилхолина (рис.1) [4,5].
Работа проводилась методами квантовой химии и ЯМР -
13 1
спектроскопии на ядрах С и Н. При расчетах использовались методы MNDO и AMI с предварительной оптимизацией геометрии методом молекулярной механики [6]. Результаты расчетов показывают, что комплекс формируется со всеми кольцами (см. табл.). Однако наибольшее значение энергии комплексообразования наблюдается при взаимодействии холиновой групппы ФХ с кольцом С кверцетина. В связи с этим, нами рассматриваются изменения, происходящие при данном взаимодействии.
Рис. 1 Структуры взаимодействующих молекул
Таблица
Энергии комплексообразования ФХ - кверцетин за счет формирования я - связи полярной головки лецитина с кольцами флавоноида
Кольца кверцетина Екомпл, кДж/моль
А 23
В 27
С 28
Расчеты, проведенные для изолированной молекулы кверцетина, показывают ее плоское строение [7]. Эти данные практически совпадают с результатами экспериментов рентгеноструктурного анализа [8]. Однако, по результатам квантово-химических расчетов, при образовании комплекса кверцетин - ФХ возникает новое конформационное состояние флавоноида. Происходит поворот кольца С вокруг связи С[2]-С[11] на угол порядка 20° и изгиб кольца В, вследствие чего, атом О[1] выходит из плоскости кольца В на 0,6 А. Таким образом, молекула кверцетина в комплексе приобретает неплоское строение. Одновременно формируются комплексы за счет водородной связи, что увеличивает их устойчивость.
Существование комплекса ФХ-кверцетин экспериментально подтверждалось ЯМР С , за счет сдвига сигналов от ядер С[2], С[3], С[4] , равный 53,230 м.д. у свободного лецитина, смещается в слабое поле при формировании комплекса с кверцетином на 1,585 м.д. (рис.2). При исследовании ЯМР спектров было обнаружено, что при Т=300 К происходит быстрый (в шкале времени ЯМР) обмен между комплексами. Поэтому полученные значения
13
химического сдвига являются усредненными величинами. Эксперименты методом ЯМР С проводились в условиях описанных в работе [1]. Использовался стандартный образец кверцетина фирмы «АЫпсЬ». Лецитин выделялся по методу, предложенному в работе [9].
Рис. 2. Спектры ЯМР 13С в CDClз : а) 0,005 М фосфатидилхолина; б) 0,005 М фосфатидилхолина и 0,01 М кверцетина
ШАРАФУТДИНОВА Р.Р., НАСИБУЛЛИН Р.С., ФАХРЕТДИНОВА Е.Р
Описанные конформационные изменения флавоноида проверялись методом эффекта Оверхаузера (ЯЭО). В основе метода лежит прямое магнитное взаимодействие ядер, которое проявляется в изменении интенсивности одного из резонансных сигналов при облучении другого. Облучение происходит под действием резонансного электромагнитного поля, вследствие чего наблюдаются изменения разности заселенности уровней энергии. В результате этих изменений появляется дополнительный канал для релаксационных процессов. ЯЭО в общем случае можно представить как отношение [10]:
I -1 =-100%,
10
где 10 - нормальная интенсивность сигнала при тепловом равновесии и отсутствии облучения;
I - интенсивность сигнала при насыщении другого сигнала от ядра расположенного достаточно близко.
Метод разностных спектров дает возможность получать структурные данные молекул независимо от наличия скалярного спин-спинового взаимодействия между атомами в молекуле. Прямое диполь-дипольное взаимодействие между ядрами, зависящее непосредственно от межъядерного расстояния описывается выражением:
1 *
— « ^г 6, Л* Т '
где р* - дополнительная релаксация, обусловленная посторонними диполь-дипольными взаимодействиями;
тс - время корреляции молекулы.
Метод разностного ЯЭО открывает возможность оценить величины диполь-дипольного взаимодействия и, следовательно, произвести измерения межъядерных расстояний. В настоящее время других методов определения межъядерных расстояний в растворах не существует. Метод имеет особое значение при исследовании биологически активных молекул, активность которых, как правило, проявляется в состоянии растворов. В то же время необходимо отметить, что при исследовании структуры молекул, предъявляются достаточно жесткие требования к исследуемым образцам. В частности, из них необходимо удалить парамагнитные примеси. Особенно важным является удаление кислорода. В нашем случае обезгаживание проводилось барбатированием через образец осушенного гелия. Протоны, сигналы от которых измерялись, расположены по меркам ЯЭФ достаточно далеко. Это расстояние обуславливает жесткие требования к стабильности всех частот и величине соотношения сигнал/шум. Важное значение имеет температурная стабильность образца при измерении. Поэтому измерения интенсивности сигналов проводили методом разностного эксперимента, который позволяет заметно уменьшить влияние указанных факторов на интенсивность сигналов. Основу разностного метода составляет суммирование нескольких прохождений в условиях насыщения одного сигнала и такого числа прохождений без насыщения.
Было показано, что при облучении Н[25] или Н[27] раствора кверцетина интегральная интенсивность спектральной линии протона Н[28] возрастает на 2,8% и 3,2%, соответственно, с погрешностью 0,2%. Подобное изменение интенсивности сигнала показывает сближение атомов водорода за счет вращения кольца С вокруг связи С[2]-С[11]. При введении в раствор лецитина образуется комплекс цикла С и холиновой группы ФХ, вызывающий торможение этого вращения. При этом, в спектрах от протонов Н[25] и Н[27] возрастание интенсивности сигналов при облучении протона Н[28] и наоборот не наблюдается. Исчезновение влияния облучения Н[25] или Н[27] и наоборот в комплексе качественно подтверждают поворот кольца С относительно плоскости кверцетина вокруг связи С[2] - С[11]. Как следует из того же эффекта, при облучении атома Н[28] интенсивность сигналов от ядер Н[25], Н[27] свободного
кверцетина меняется приблизительно одинаково, хотя эти атомы расположены на расстояниях отличающихся в 1,7 раза, что свидетельствует о достаточно быстром вращении кольца С вокруг связи С[2]-С[11].
Для улучшения соотношения сигнал/шум исключения систематических дрейфов параметров, вызванных постепенным изменением температуры образца, эксперимент проводился 32 раза, по 24 накопления каждый. Таким образом, количество прохождений спектров составило 768 раз. Время релаксации t =2 сек. Для декаплера использовался 90° импульс.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 40/60-II). СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Насибуллин Р.С., Усманова С.И., Сетченков М.С., Афанасьева Ю.Г., Фахретдинова Е.Р. О молекулярном механизме биоактивности рутина // Химическая физика и мезоскопия. Ижевск: ИПМ УрО РАН, 2008. Т.10, №2. С.228-231.
2. Насибуллин Р.С., Спирихин Л.В., Косарева Д.И. Комплекс пиридина с фосфолипидами клеточных мембран // Биополимеры и клетка // Биополимеры и клетка. 1998. Т.14, № 5. С.15-17.
3. Насибуллин Р.С., Шарафутдинова Р.Р. Комплекс 3,5,7,3',4'-пентаоксифлавонола одновременно с двумя молекулами фосфатидилхолина, расположенных на крайних кольцах // Сб. статей XII Всерос. конф. «Структура и динамика молекулярных систем». Вып. XII, ч.П. Йошкар-Ола, 2005. С.326-329
4. Насибуллин Р.С., Спирихин Л.В., Пономарева В.А. Образование комплексов молекулы пиразола с фосфолипидами // Биофизика. 1991. Т.36, №4. С.594.
5. Насибуллин Р.С., Никитина Т.И., Афанасьева Ю.Г., Насибуллин Т.Р., Спирихин Л.В. Комплекс 3,5,7,3',4'-пентаоксифлавонола с фосфатидилхолином // Хим.-фарм. журнал. 2002. Т.36, № 9. С.33-36.
6. Allen M.P., Tidesley D.J. Computer simulation of liquids. Oxford: Clarendon Press, 1987.
7. Trouillas P., Marsal Ph., Siri D., Lazzaroni R., Duroux J. L. A DFT study of the reactivity of OH groups in quercetin and taxifolin antioxidants: The specificity of the 3-OH site // Food Chemistry. 2006. Vol.97. Р.679-688.
8. Rossi M., Rickles L.F., Halpin W.A. The crystal and molecular structure of quercetin: A biologically active and naturally occurring flavonoid // Bioorganic Chemistry. 1986. Vol.14, № 1. Р.55-69.
9. Dawson R.M. On the mechanism of action of phospholipase A // Biochem. J. 1963. Vol.88, №3. Р.414-423.
10. Дероум Э. Современные методы ЯМР для химических исследований / Пер. с англ. М.: Мир, 1992. 403 с.
RESEARCH CONFORMATION STATE OF QUERCETIN AT FORMATION OF A COMPLEX WITH LECITHIN
Sharafutdinova R.R., Nassibullin R.S., Fachretdinova E.R. Bashkir state medical university, Ufa, Russia
SUMMARY. By methods quantum chemistry and :H, 13C NMR was investigated the interaction of the some molecules of flavonoids with the cell membrane phosphatidylcholin. Formed by the rings of flavonoids and the choline group of the phosphatidylcholine molecule by means of n-system of the heterocycle electrons established. The existence of the complex was confirmed by 1H, 13C NMR spectroscopy. Change of conformation the states of quercetin arising at formation of a complex with lecithin investigated.
KEYWORDS: quercetin, lecithin, quantum - chemical methods, NMR, Nuclear Overhauser Effect (NOE).
Шарафутдинова Римма Ринатовна, преподаватель кафедры медицинской физики с курсом информатики БГМУ, тел. 8 (927)32-533-86, e-mail: [email protected]
Насибуллин Руслан Сагитович, доктор физико-математических наук, профессор, зав. кафедрой медицинской физики с курсом информатики БГМУ, тел. 8 (347) 223-28-95, e-mail: [email protected]
Фахретдинова Елена Руслановна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры кардиологии БГМУ, тел. 8(347) 22383-48, e-mail: med-fis@yyandex. ru
