CC BY
55Токсикологический вестник (122)
УДК 547.1 : 57.04
ИССЛЕДОВАНИЕ IN VITRO ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НЕСТЕРОИДНЫХ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ СРЕДСТВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В СОСТАВЕ КОМБИНИРОВАННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
И.Н. Немкова1, Т.А. Гуськова2, Р.Д. Сюбаев1, Г.Н. Енгалычева1, А.Н. Васильев1
1ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, 127051, г. Москва 2 Некоммерческое партнерство содействия здравоохранению «Научный центр контроля качества» (НП СЗ НЦКК), 109074, г. Москва
В рамках оценки безопасности комбинированной фармакотерапии принципиальное значение имеет изучение эффектов токсикологического взаимодействия активных препаратов, составляющих комбинацию. Для оценки токсикологического взаимодействия выполнены исследования с применением экспресс-метода in vitro с использованием сперматозоидов быка. Определены параметры цитотоксического действия (ИК50) метамизола натрия, ибупрофена, ацетилсалициловой кислоты, парацетамола, дифенгидрамина, кофеина и некоторых комбинаций этих лекарственных средств. Наиболее выраженное цитотоксическое действие на данной модели оказывал метамизол натрия, а наименее выраженное - кофеин. Проведена оценка возможного токсикологического взаимодействия лекарственных средств при их комбинированном применении на основании экспериментальных и гипотетических показателей цитотоксичности. Установлено, что использование метода изучения цитотоксичности in vitro является целесообразным при оценке безопасности отдельных лекарственных средств и лекарственных комбинаций.
Ключевые слова: цитотоксичность, лекарственные средства, токсикологическое взаимодействие.
Введение. Комбинированная фармакотерапия является научно обоснованным принципом эффективного воздействия на различные звенья патогенеза заболевания, что находит отражение в современных стандартах лечения. Кроме того, в последнее время возрос интерес к созданию препаратов на основе фиксированных комбинаций из известных лекарственных средств (ЛС) [1]. Это обусловлено клинической потребностью повышения эффективности лекарственной терапии, а также определенной экономической привлекательностью подобных разработок, которые часто не требуют значительных технологических затрат. Вместе с тем, условием клинической целесообразности применения комбинированной фармакотерапии является ее рациональность
с точки зрения эффективности и безопасности с учетом фармакологической и токсикологической совместимости активных компонентов. Безопасность комбинированных лекарственных средств должна быть оценена по результатам экспериментальных токсикологических исследований, так как токсикологическое взаимодействие активных компонентов таких препаратов может стать причиной токсических эффектов и серьезных осложнений [2]. Экспериментальное токсикологическое изучение in vivo является одним из наиболее достоверных источников информации о потенциальных токсических эффектах многокомпонентных ЛС. Однако, учитывая большие финансовые и временные затраты на эти исследования, современные отечественные и зарубежные методические ру-
Немкова Ирина Николаевна (Nemkova Irina Nikolaevna), эксперт первой категории ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, Nemkova@expmed.ru
Гуськова Татьяна Анатольевна (Guskova Tatyana Anatolievna),член-корр. РАМН, Некоммерческое партнерство содействия здравоохранению «Научный центр контроля качества» (НП СЗ НЦКК), Москва, tagus@rambler.ru
Сюбаев Рашид Даутович (Syubaev Rashid Dautovich), доктор медицинских наук, главный эксперт ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, rds651@mail.ru, subaev@expmed.ru
Енгалычева Галина Нинелевна (Engalycheva Galina Ninelevna), кандидат биологических наук, ведущий эксперт ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, gengalycheva@mail.ru
Васильев Андрей Никифорович (Vasiliev Andrey Nikiforovich), ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России
СЕНТЯБРЬ - ОКТЯБРЬ 2013
ководства, как правило, рекомендуют редуцированные программы токсикологических исследований для лекарственных комбинаций [3, 4]. При этом предполагается, что безопасность комбинаций известных ЛС вполне удовлетворительно может быть охарактеризована в результате анализа токсических свойств отдельных компонентов. Практическая невыполнимость полной программы стандартных доклинических исследований всех возможных сочетаний ЛС при комбинированной терапии вынуждает использовать аналитические методы прогнозирования и альтернативные экспресс-методы in vitro [5, 6, 7].
Целью работы являлось изучение возможности применения альтернативного метода токсикологических исследований in vitro для оценки токсикологического взаимодействия ЛС.
Материалы и методы исследования. Исследования проводились с применением экспресс-метода оценки цитотоксичности in vitro в модификации Р.И. Каюмова и А.П. Еськова [8]. В качестве клеточного тест-объекта использованы сперматозоиды быка. Метод основан на определении изменения подвижности сперматозоидов под воздействием фармакологических веществ, содержащихся в исследуемых образцах по сравнению с подвижностью сперматозоидов в образцах, не содержащих исследуемых веществ. Сперма быка сохраняется до эксперимента в виде гранул в замороженном виде в жидком азоте. Анализатор токсичности осуществляет видеорегистрацию двигательной активности клеток. Конструкция механической части анализатора позволяет одновременно оценивать подвижность клеток в 5 пробах (капиллярах) для каждого разведения исследуемых образцов. Продолжительность экспозиции исследуемых веществ составляет 2-2,5 часа и соответствует периоду сохранения подвижности клеток в контрольных образцах. В результате автоматизированной обработки данных на дисплее представляется графическое изображение «концентрация-эффект». Определяется концентрация, вызывающая снижение подвижности сперматозоидов на 50% (ИК50) при значении коэффициента вариации проб не более 15%. Была изучена цитотоксичность следующих лекарственных веществ: ацетилсалициловой кислоты, ибупрофена, метамизола натрия, парацетамола, кофеина, дифен-гидрамина, а также комбинации лекарственных веществ: метамизола натрия + дифенгидрамина (10:1), ибупрофена + дифенгидрамина (10:1), ибупрофена + метамизола натрия (1:1). Для оценки механизма токсикологического взаимодействия ЛС проводили сравнение экспериментального показателя цитотоксич-ности комбинации (ИК50) с расчетными значениями гипотетической ИК50 комбинации, соответствующей аддитивному характеру цитотоксичности. Гипотетическое значение ИК50 комбинации рассчитывали по уравнению аддитивности:
ИК50 комбинации = (d1 + d2 +...+ d )/(d/ ИК50(1) + d2/
ИК50(2)+ . + dn/ ИК50(п))
где d,,d0,...d - абсолютные весовые значения или
1 2' n
относительные доли компонентов комбинации;
ИК50(1), ИК50(2), ИК50(п) - значения ИК50 отдельных компонентов комбинации, полученные в эксперименте.
Результаты и обсуждение. Исходя из полученных значений ИК50 в весовой размерности «мкг/мл», наиболее выраженным цитотоксическим действием обладал метамизол натрия (табл. 1). По убыванию цитотоксического действия исследуемые вещества располагаются в следующем порядке: метамизол натрия > дифенгидрамин > ацетилсалициловая кислота > ибупрофен > парацетамол > кофеин. При этом ИК50 кофеина, обладающего наименее выраженным цито-токсическим действием, превышает ИК50 метамизола натрия в 65 раз. В молярной размерности «mM/л» исследуемые ЛС располагаются в том же порядке, однако наблюдается существенное увеличение показателя относительной цитотоксичности метамизола натрия - до 108 и дифенгидрамина - до 34.
Результаты оценки цитотоксичности комбинаций ЛС представлены в таблице 2. Сравнение экспериментальных значений ИК50 указывает на 18-кратное различие цитотоксичности двух аналогичных по количественному составу комбинаций дифенгидрами-на с ибупрофеном (ИК50 = 12 5 0 мкг/мл) и метами-золом натрия (ИК50=69 мкг/мл) при соотношении в комбинации 1:10. ИК50 комбинации ибупрофен + метамизол натрия (1:1) составляет 500 мкг/мл, т.е. цито-токсичность этой комбинации в 10 раз ниже цитоток-сичности метамизола натрия (ИК50=51 мкг/мл).
Вычисленные с помощью уравнения аддитивного токсического действия гипотетические значения ИК50 изученных лекарственных комбинаций (табл. 2) позволяют провести оценку характера возможного токсикологического взаимодействия ЛС. Для комбинаций ибупрофен+дифенгидрамин и ибупрофен+ме-тамизол натрия экспериментальные значения ИК50 выше гипотетических ИК50, что может говорить о положительном типе взаимодействия ЛС, приводящем к снижению их цитотоксичности. Для комбинации метамизол натрия + дифенгидрамин экспериментальное значение ИК50 сопоставимо с гипотетическим, что может свидетельствовать о наиболее вероятном аддитивном характере цитотоксичности и об отсутствии эффектов токсикологического взаимодействия указанных препаратов.
Изучение цитотоксических эффектов взаимодействия ЛС in vitro для оценки безопасности сочетанного использования лекарственных препаратов имеет большое значение, однако, следует учитывать, что возможно различие реакций целостного организма и отдельных клеток на введение ЛС. В обычных условиях эксперимента in vitro оценивают прямое действие на живые клетки самого вещества, но не его возможно более активных и токсичных метаболитов, которые могут образоваться in vivo. Кроме того, цитотоксическое действие на определенные клетки может быть не единственным механиз-
Токсикологический вестник (122)
Таблица 1
Экспериментальные значения ИК50 и относительная цитотоксичность изученных лекарственных
средств
Лекарственное средство ИК (мкг/мл) Относительная цитотоксичность Молек. масса ИК50 mM/л Относительная цитотоксичность
Метамизол натрия 51±3,4 65 351,36 0,145 108
Дифенгидрамин 133±8,9 25 291,82 0,456 34
Ацетилсалициловая кислота 200±13 17 180,15 1,11 14
Ибупрофен 400±27 8,3 206,29 1,94 8,1
Парацетамол 1250±84 2,6 151,17 8,27 1,9
Кофеин 3330±223 1 212,21 15,7 1
Таблица 2
Экспериментальные и гипотетические показатели цитотоксичности лекарственных комбинаций
Лекарствен ная комбинация Экспериментальное значение ИК^, комбинации (мкг/мл)
Ибупрофен + Дифенгидрамин (10:1) 1250±84 338±23
Метамизол натрия + Дифенгидрамин (10:1) 69,0±4,6 54,0±3,6
Ибупрофен + Метамизол натрия (1:1) 500±34 90,5±6,0
мом нарушения гомеостаза организма при введении препаратов. Причиной нарушения гомеостаза различных систем организма (нервной, сердечнососудистой, дыхательной и др.) могут быть не только токсические, но и фармакологические свойства активных компонентов комбинированных ЛС. Так, различием цитотоксических и системных эффектов можно объяснить тот факт, что метамизол натрия обладает удовлетворительной клинической переносимостью (и применяется в более высоких дозах, чем кофеин), поскольку, в отличие от кофеина, не оказывает лимитирующего возбуждающего действия на ЦНС и сердечно-сосудистую систему. При этом известные миелотоксические эффекты метамизола, приводящие к развитию лейкопении и агранулоцитоза, по-видимому, могут рассматриваться как следствие его высокой цитотоксичности, наблюдавшейся в эксперименте in vitro.
Заключение. Несмотря на то, что методы in vitro не являются полноценной альтернативой изучению токсичности in v^ при оценке безопасности комбинированных препаратов, их применение для изучения лекарственного взаимодействия представляется весьма целесообразным и рациональным. Применение данного метода исследования цитотоксичности поможет с меньшей степенью финансовых и временных затрат осуществлять подбор наиболее безопасных лекарственных препаратов при создании комбинированных ЛС.
СЕНТЯ БРЬ
- ОКТЯБРЬ 201 3
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Номенклатура лекарственных препаратов и фармацевтических субстанций, зарегистрированных в Российской Федерации. Ведомости научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2011; 1: 11-18.
2. Гуськова Т.А., Сюбаев Р.Д., Немкова И.Н., Енгалычева Г.Н. Изучение токсичности лекарственных средств in vitro при оценке их токсикологического взаимодействия. Биомедицина. 2010; 5: 74-76.
3. МироновА.Н., ред. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К; 2012.
4. ICH Guideline M3(R2) on Nonclinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials and Marketing Authorization for Pharmaceuticals, December 2009.
5. Гуськова Т.А., ВолковА.Б., Еськов А.П., Каюмов Р.И. Ускоренная оценка токсичности потенциальных фармакологических средств и новых
химических соединений с помощью клеточного тест-объекта // Всесоюзная научная конференция «Оценка фармакологической активности фармакологических соединений: Принципы и подходы». Купавна; 1989; ч. 1: 102.
6. Каркищенко Н.Н. Классические и альтернативные модели в лекарственной токсикологии. Биомедицина. 2006; 4: 5-23.
7. Concept paper on the Need for Revision
of the Position on the Replacement of Animal Studies by in vitro Models (EMA/ CHMP/SWP/169839/2011). 8. Каюмов Р.И., Еськов А.П. Экспресс-оценка общей острой токсичности методом in vitro с использованием спермы быка в качестве клеточного тест-объекта. М.: ЗАО Биомедицинский контроль; 2000.
I.N. Nemkova, T.A. Guskova, R.D. Syubaev, G.N. Engalycheva, A.N. Vasiliev
In vitro study on cytotoxic effect of non-steroidal anti-inflammatory agents used in the composition of combined medicinal preparations
1 Federal State Budgetary Institution «Scientific Center of Medical Application Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 127051, Moscow, Russian Federation.
2 Non-commercial partnership of healthcare assistance «Scientific centre of quality control», 109074, Moscow, Russian Federation.
Investigations into effects of toxicological interaction between active preparations composing a combination has a principle importance within the safety assessment of a combined pharmacotherapy. To assess a toxicological interaction, investigations using a bull-sperm-based in vitro express-method were conducted. Parameters of cytotoxic effects (IC50) of metamizole sodium, ibuprofen, acetylsalicylic acid, paracetamol, diphenhydramine, caffeine and some combinations of these medicinal preparations were determined. Metamizole sodium showed the most expressed cytotoxic effect on this model, and caffeine manifested the least expressed effect. A possible toxic interaction between medicinal agents at their combined administration was assessed based on experimental and tentative cytotoxicity indicators. It was established that the in vitro method for investigation of cytotoxicity is feasible to assess the safety of individual medicinal preparations and medicinal combinations. Key words: cytotoxicity, medicinal preparations, toxicological ineraction.
Материал поступил в редакцию 16.07.2013 г.
