CC BY
27
Пономарева Т.И.1, Добряков Ю.И.2 ©
'Старший научный сотрудник, 2ведущий научный сотрудник, 12 к.б.н., отдел биохимических технологий,
Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева, Владивосток ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОТРОПНЫХ СВОЙСТВ ЭКСТРАКТОВ АСЦИДИЙ
Аннотация
В статье обобщены результаты исследования иммунотропных свойств экстракта из морского гидробионта - асцидии (ЭА) в эксперименте на мышах. Показано, что ЭА оказывает активирующее влияние на неспецифическое звено иммунной системы при введении интактным животным. При формировании первичного иммунного ответа на эритроциты барана ЭА стимулирует лимфопролиферативные процессы в селезенке, активируя клеточное звено иммунной системы, и проявляет модулирующий эффект на процессы антителообразования. Полученные результаты об усилении иммунных реакций под влиянием ЭА, а также выявленная ранее способность стимулировать пролиферативные процессы в кроветворной ткани, действуя преимущественно на клетки, участвующие в иммунной защите, свидетельствуют о перспективности дальнейшего исследования ЭА.
Ключевые слова: асцидия, иммунный ответ, неспецифическая резистентность.
Keywords: tunicate, immunity response, nonspecific resistance.
Иммунная система, как один из ведущих элементов гомеостаза, обеспечивает саморегуляцию и нормальную жизнедеятельность организма. Исследования последних лет свидетельствуют, что любой патологический процесс в организме сопровождается изменениями в иммунной системе, показан также рост иммунозависимых заболеваний и состояний. Повышенный риск возникновения иммунодефицитных состояний служит основанием для поиска и применения препаратов, регулирующих иммунные процессы. В связи с этим активно обсуждаются перспективы использования морской флоры и фауны в качестве сырья для получения лекарственных препаратов. Из тканей некоторых морских гидробионтов выделены соединения с широким спектром биологической активности, в числе прочих, определенная физиологическая активность была зарегистрирована также у нескольких видов асцидий [1, 83]. Вещества, отвечающие за биологическое действие извлечений из асцидии, сконцентрированы преимущественно в ее тунике. В частности, в состав туники асцидии Halochynthia aurantium наряду с макро- и микроэлементами, входят аминокислоты, фосфолипиды, а также нейтральные липиды, ПНЖК семейства n-3, простагландины, каротиноиды [2, 151], обеспечивающие множественные биологические эффекты водно-спиртового экстракта - хаурантина [3, 90; 4, 23; 5, 23; 6, 50]. Следует отметить, что по составу химических соединений разные виды асцидий отличаются несущественно. В предыдущих исследованиях было показано, что экстракт из туники другого вида одиночной асцидии (ЭА) также как и хаурантин, активизирует кроветворение, действуя преимущественно на клетки, участвующие в иммунной защите организма [7, 159]. Эти результаты послужили основанием для исследования иммунотропных свойств ЭА, что и явилось целью настоящей работы.
Эксперименты выполнены на беспатогенных мышах линии CD-1 массой 20-22 г (100 особей), полученных из питомника лабораторных животных «Пущино» и разведенных в виварии Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН (сертификат имеется). Исследования с использованием животных проведены в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Иммунотропные свойства ЭА изучали на интактных животных и при формировании иммунного ответа. Экстракты интактным
©© Пономарева Т.И., Добряков Ю.И., 2014 г.
мышам вводили в течение 9 суток ежедневно внутрижелудочно через зонд по 0,2 мл в дозе 1/100 и 1/50 от ЛД50 (соответственно 25 и 50 мг/кг в пересчете на сухой остаток для ЭА) и 1/100 для препарата сравнения хаурантина (30 мг/кг). Контролем служили интактные животные, которым аналогичным образом вводили дистиллированную воду. Для исследования влияния ЭА на формирование иммунного ответа животных иммунизировали однократно тимусзависимым антигеном (эритроциты барана - ЭБ внутрибрюшинно 108 клеток - «Эколаб», Москва). ЭА (20 мг/кг) вводили одновременно с иммунизацией и в течение 4-х последующих суток.
Общепринятыми методами определяли следующие показатели, характеризующие иммунологический статус животных: массу и клеточность иммунокомпетентных органов (тимуса и селезенки), костного мозга, общее количество лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, с установлением ядерной формулы и индекса сегментации нейтрофилов [8, 432]. Учитывали интегральные показатели крови -лимфоцитарный индекс (ЛИ) по Шаганину, индекс соотношения нейтрофильных лейкоцитов и лимфоцитов (ИСНЛ) [9, 582]. Изучение влияния ЭА на гуморальное звено первичного иммунного ответа проводили на основе реакции прямой гемагглютинации (РПГА) [10, 211]. Титр антител выражали величиной log2, величина индекса более 1,0 свидетельствовала об иммунизации. Об активации иммунной специфической реакции, включающей как механизмы гуморального, так и клеточного иммунитета, судили также по количеству иммунных розеткообразующих клеток (РОК) в селезенке [10, 278]. Животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом.
Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.
Ежедневное ведение ЭА интактными мышам приводило к значительному увеличению общего количества лейкоцитов (в 1,3 раза), начиная с 3-х суток и до конца эксперимента (25 мг/кг), и на 7-е сутки (50 мг/кг), наиболее ярко выраженное в показателях нейтрофильного звена. Полученные результаты позволили рассчитать интегральные гематологические показатели, которые отражают качественные изменения в иммунной системе (таблица 1). В связи с вариабельностью ЛИ и ИЛСН крови у мышей в исходном состоянии данные показатели были приняты за 100%, а их значения у животных экспериментальных групп оценивали относительно исходного показателя.
Таблица 1
Интегральные гематологические показатели мышей CD-1 при 9-дневном введении ЭА (M ± m)
Группа животных / Показатели ЭА 25 мг/кг ЭА 50 мг/кг Хаурантин 30 мг/кг
1-е сутки ЛИ ИСНЛ 3,07 (78,2 ± 3,12) 0,37 (138,3 ± 2,14)* 3,70 (94,0 ± 2,11) 0,31 (116,4 ± 4,10) 3,10 (78,1 ± 2,15) 0,39 (148,0 ± 2,10)*
3-е сутки ЛИ ИСНЛ 4,16 (105,3 ± 0,78) 0,27 (101,2 ± 1,10) 2,96 (75,5 ± 2,22) 0,42 (157,4 ± 2,33)* 3,89 (98,3 ± 3,11) 0,284 (106,0 ± 1,15)
7-е сутки ЛИ ИСНЛ 4,29 (109,4 ± 1,35) 0,29 (108,8 ± 0,77) 4,05 (103,4 ± 0,93) 0,27 (100,9 ± 0,95) 3,97 (100,5 ± 1,60) 0,29 (109,2 ±3,22)
10-е сутки ЛИ ИСНЛ 5,13 (130,3 ± 1,31)* 0,24 (90,4 ± 0,75) 3,55 (89,6 ± 0,94) 0,31 (115,7 ± 1,22) 3,27 (83,4 ± 1,11) 0,32 (120,2 ± 1,04)
Примечание. Здесь и в табл. 2: * - p < 0,05 при сравнении с интактными животными;
в скобках указан процент по отношению к интактным животным.
Анализируя динамику ЛИ, по изменению которого можно судить о взаимоотношении гуморального и клеточного звеньев иммунной системы, следует отметить, что под влиянием ЭА (25 мг/кг) у животных зарегистрирована достоверная стимуляция гуморального звена иммунитета (в 1,5 раза; p < 0,05) на 10 сутки эксперимента. Что же касается ИСНЛ, отражающего соотношение клеток неспецифической и специфической защиты,
зарегистрированы достоверно повышенные (p < 0,05) показатели на
1-е (ЭА 25 мг/кг) и на 3-е сутки (ЭА 50 мг/кг). Эти результаты свидетельствуют, что увеличение ИСНЛ в первые сутки под влиянием введения ЭА за счет повышения количества сегментоядерных нейтрофилов, вероятно, является отражением реакции адаптации. В то время как его изменение на 3-е сутки, скорее всего, свидетельствует об активации механизмов неспецифической защиты организма [9, 582; 11, 46], поскольку у животных этой группы увеличилось также и количество палочкоядерных нейтрофилов. Следует отметить, что под влиянием ЭА отмечалась тенденция к увеличению нейтрофилов с двухсегментным ядром, которые в функциональном отношении являются более полноценными [12, 44].
К 10-м суткам эксперимента также была увеличена численность клеток (миелоидного ряда) в костном мозге, т. е. на фоне экстрактов происходила достоверная стимуляция гемопоэза (таблица 2).
Таблица 2
Влияние ЭА на лейкоциты периферической крови, клеточность костного мозга, лимфоидных органов после 9-дневного внутрижелудочного введения (М±м)
Группа животных / ЭА ЭА Хаурантин
Показатели 25 мг/кг 50 мг/кг 30 мг/кг
Миелокариоциты, 18,49 ± 1,58* 17,46 ± 2,56* 15,97 ±1,39*
106 / мл (149) (140) (128)
Спленоциты, 215,85 ± 20,25* 217,1 ± 17,67* 238,57 ± 15,52*
106 / 100 мг (76) (77) (84)
Тимоциты, 146,27 ± 14,01 106,36 ± 9,07* 89,43 ± 8,7*
106 / орган (121) (88) (74)
Лейкоциты, 15,64± 1,32* 12,33±1,53 14,24± 1,98
106 / мл (128) (101) (117)
На содержание клеток в тимусе ЭА оказывал дозозависимое действие: увеличивая их численность в 1,2 раза в дозе 25 мг/кг, и значительно снижая при двукратном увеличении дозы (50 мг/кг). При этом клеточность селезенки во всех группах мышей была снижена.
Результаты исследования влияния ЭА (20 мг/кг) на формирование первичного иммунного ответа на ЭБ у мышей представлены в таблице 3.
Таблица 3
Влияние ЭА на формирование иммунного ответа у мышей СБ-1(М±м)
Группа животных / Показатели ЭБ + ЭА 20 мг/кг ЭБ + Хаурантин 30 мг/кг ЭБ
4 сутки
Спленоциты 106/100мг Количество РОК / сел 103 97,80 ± 19,37 53,51 ± 6,33* 106,02 ± 10,07* 75,61±8,78* 83,87 ± 8,01 36,29 ± 4,62
tog2 титра антител к ЭБ 6,0 ± 0,04* 8,6 ± 0,55* 7,4 ± 0,55
7 сутки
Спленоциты 106/100мг 120,49 ± 20,92 85,22 ± 5,18 95,29 ± 20,79
Количество РОК /
сел 103 27,91 ± 1,56* 18,74 ±3,98 14,04 ± 1,12
tog2 титра антител к ЭБ 8,3 ± 0,45 9,10 ± 0,55 8,10 ± 0,42
14 сутки
Спленоциты 106/100мг 125,89 ± 18,82* 111,75 ± 26,25 99,96 ± 11,00
Количество РОК /
сел 103 26,15 ± 5,53 15,87 ± 3,35** 23,22 ± 0,98
tog2 титра антител к ЭБ 9,0 ± 0,82 10,37 ± 1,25 9,75 ± 0,5
Примечание. *- p < 0,01; ** - p < 0,05 при сравнении с группой ЭБ.
ЭА вводили курсом 1 раз в сутки в течение 4-х дней, начиная со дня иммунизации ЭБ. На 4-е, 7-е, 14-е сутки после иммунизации осуществляли забор материала. Из данных следует, что в условиях системной иммунизации ЭА при внутрижелудочном введении стимулировал пролиферативные процессы в селезенке: клеточность органа на 7-е и 14-е сутки была увеличена на 30% (р < 0,05). Количество розеткообразующих клеток (РОК) в селезенке под влиянием ЭА также было увеличено в 1,5-2 раза (на 4-е и 7-е сутки соответственно, р < 0,05), эти данные служат показателем активации клеточного иммунного ответа на антиген [9, 582; 11, 46].
О влиянии ЭА на функционирование гуморального звена иммунитета судили по формированию антиэритроцитарных антител в крови мышей. Изменения были
зарегистрированы на 4-е сутки, когда уровень титра антител к ЭБ был достоверно снижен (р < 0,01) по сравнению с контрольными животными, что может свидетельствовать о возможном модулирующем действии экстракта на процесс антителообразования. Следует отметить, что в тимусе, в котором происходит дифференцировка основных иммунорегуляторных клеток, на 7-е сутки зарегистрировано почти двукратное снижение клеточности по сравнению с иммунизированным контролем (данные не приводятся).
Как следует из представленных результатов, ЭА оказывает определенное активирующее влияние на неспецифическое звено иммунной системы при введении интактным животным. А при формировании иммунного ответа, стимулирует лимфопролиферативные процессы в селезенке, активируя клеточное звено иммунной системы, и возможно, проявляет модулирующий эффект на процессы антителообразования. Как было сказано выше, экстракты из туники асцидий отличаются богатым составом БАВ, что предполагает широкий спектр их фармакологических свойств [3, 90; 4, 101; 5, 23]. В частности, для ЭА, также как и для хаурантина, показаны наличие значительной стресс-протективной активности, а также способность стимулировать репаративные процессы при гемодепрессивных состояниях и оптимизировать гомеостатические реакции крови [6, 86; 7, 159]. Множественность
фармакологических проявлений препарата может свидетельствовать о том, что эти эффекты обусловлены разными механизмами. Так, помимо прямого действия на иммунокомпетентные органы и клетки при формировании иммунного ответа, влияние экстракта может быть опосредовано также его действием на метаболические процессы в организме, что в свою
очередь, способствует лучшему обеспечению метаболических потребностей клеток иммунной системы, как это показано для хаурантина [5, 23].
Таким образом, полученные результаты об усилении иммунных реакций под влиянием ЭА, а также выявленная ранее способность стимулировать пролиферативные процессы в кроветворной ткани, действуя преимущественно на клетки, участвующие в иммунной защите, свидетельствуют о перспективности дальнейшего исследования его иммунотропных свойств.
Литература
1. Добряков Ю.И., Брехман И.И. Поиск природных источников физиологически активных веществ из морских организмов // Валеология: Диагностика, средства и практика обеспечения здоровья. -Владивосток: Дальнаука, 1996. - Вып. 3. - С. 83-90.
2. Кушнерова Н.Ф., Добряков Ю.И., Янькова В.И. Химический состав спиртовых извлечений из туники асцидии пурпурной Halocynthia aurantium // Валеология: Диагностика, средства и практика обеспечения здоровья. - Владивосток: Дальнаука, 2000. - Вып. 4. - С. 151-155.
3. Добряков Ю.И., Хасина Э.И., Спасов А.А. Стресс-протективное действие хаурантина // Валеология: Диагностика, средства и практика обеспечения здоровья. - Владивосток: Дальнаука, 1996. - Вып. 3. -С. 90-100.
4. Долматова Л.С., Добряков Ю.И., Дардымов И.В. Влияние хаурантина на активность ферментов антиоксидантной системы при стрессе у крыс и в модельных экспериментах на нейтрофилах человека // Валеология: Диагностика, средства и практика обеспечения здоровья. - Владивосток: Дальнаука, 1996. - Вып. 3. - С. 101-105.
5. Добряков Е.Ю. Фармакологические эффекты экстракта из туники асцидии Halocynthia aurantium: Автореф. дис. канд. мед. наук. - Владивосток, 2004. - 23с.
6. Пономарева Т.И., Добряков Ю.И. Коррекция хаурантином иммунных реакций при стрессорном воздействии // Нейроиммунология. - 2009. - Т. 7, № 3. - С. 86-87
7. Пономарева Т.И. Коррекция нарушения кроветворных функций у животных экстрактом из асцидий // В мире научных открытий. - 2013. - № 11.2(47) - С. 159-174
8. Козинец Г.И., Высоцкий В.В., Захаров В.В. Кровь и экология. / М.: Практическая медицина, 2007. -432 с.
9. Никенина Е.В., Абрамова А.Ю., Козлов А.Ю. Ноцицептивная чувствительность и лимфоцитарный индекс периферической крови у крыс с разной поведенческой активностью на модели воспалительной боли, вызванной введением полного адъюванта Фрейнда и бычьего сывороточного альбумина // БЭБМ. - 2012. - Т 153, №5. - С. 582-584.
10. Иммунология. Методы исследований под. ред. И. Лефковитса и Б. Перниса. / М.: Мир, 1983. - 348 с.
11. Першин Б.Б., Гелиев А.Б., Тостов Д.В. Физические нагрузки и иммунологическая реактивность //Аллергология и иммунология. - 2003.- Т. 4, № 3. - С. 46.
12. Овсянников В.Г., Алексеев В. В., Кутузова А. А. Особенности лейкоцитарной реакции и фагоцитоза у крыс разного возраста при острой соматической боли // Вестник Санкт-Петербургского Университета. - 2008. - Вып.1. Сер.11. - С. 44-49.
