CC BY
22
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2018 БИОЛОГИЯ Вып. 3
УДК 546.62
М. А. Земляноваa,b, М. С. Степанковa,b, А. М. Игнатоваc, Р. С. С ибирцев
a ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения, Пермь, Россия b Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, Россия c Пермский национальный исследовательский политехнический университет, Пермь, Россия
ИССЛЕДОВАНИЕ И ОЦЕНКА ОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ И КУМУЛЯТИВНЫХ СВОЙСТВ НАНОДИСПЕРСНОГО ОКСИДА АЛЮМИНИЯ ПРИ ПЕРОРАЛЬНОМ ПОСТУПЛЕНИИ
Проведено исследование и оценка острой токсичности и кумулятивных свойств нанодисперсного оксида алюминия при пероральном поступлении. Установлено, что изученный образец оксида алюминия является наноматериалом с размером частиц в диапазонах 58-100 нм и 30-40 нм соответственно. В ходе исследования острой токсичности установлено, что нанодисперсный оксид алюминия обладает 4-м классом опасности и, относительно микродисперсного аналога, более выраженным токсическим действием, что проявляется в морфологических изменениях в лимфоузлах и желудке у животных, экспонированных наноматериалом. Установлено, что при многократном пероральном поступлении нанодисперсный оксид алюминия обладает материальной кумуляцией, накапливаясь в мозге и печени в концентрациях, превышающих данный показатель у животных, экспонированных микроматериалом, в 1.23 и 1.41 раза соответственно, и функциональной кумуляцией, вызывая более выраженные морфологические изменения в органах пищеварения, селезёнки и печени относительно животных группы сравнения. Полученные результаты необходимо учитывать при разработке профилактических мер для производителей и потребителей продукции, содержащей наночастицы оксида алюминия.
Ключевые слова: оксид алюминия; наночастицы; острая токсичность; кумуляция; морфологические изменгния.
M. A. Zemlyanovaa,b, M. S. Stepankova,b, A. M. Ignatovac, R. S. Sibirtsevb
a Federal scientific center for medical and preventive health risk management technologies, Perm, Russian Federation b Perm State University, Perm, Russian Federation c Perm National Research Polytechnic University, Perm, Russia
RESEARCH AND ASSESSMENT OF ACUTE TOXICITY AND CUMULATIVE PROPERTIES OF NANODISPESE ALUMINUM OXIDE AT ORAL INTAKE
In this article present the results of research and assessment of acute toxicity and cumulative properties of nanodispersed aluminum oxide at oral intake. Dynamic laser light scattering and scanning electron microscopy showed that the studied sample of aluminum oxide is a nanomaterial with a particle size in the ranges of 58-100 nm and 30-40 nm, respectively. In the study of acute toxicity, it was established that nanodispersed alumina have the 4th class of danger and, with relatively to the microdispersed analogue, a more pronounced toxic effect, which appear itself in morphological changes in the lymph nodes and stomach in animals expose by nanomaterial. With repeated oral intake, it has been established that nano-dispersed alumina have a material cumulation, accumulating in the brain and liver in concentrations exceeding this index in animals exposed to micromaterial by 1.23 and 1.41 times, respectively, and by functional cumulation, causing more pronounced morphological changes in the digestive organs, spleen and liver, relative to the comparison group animals. The obtained results should be considered when developing preventive measures for producers and consumers of products containing aluminum oxide nanoparti-cles.
Key words: aluminum oxide; nanoparticles; acute toxicity; cumulation; morphological changes.
Введение
В течение последнего десятилетия наноразмер-ные материалы активно внедряются в различные сферы производства и потребления. Производство наноразмерного оксида алюминия составляет око-
ло 20% объёма всех выпускаемых наноматериалов в мире [Rittner, 2002], что делает его одним из самых распространённых продуктов на рынке наноматериалов. Наноразмерный оксид алюминия активно используется в косметической промышленности [Robertson, Sanchez, Roberts, 2010]; в меди-
© Землянова М. А., Степанков М. С., Игнатова А. М., Сибирцев Р. С., 2018
313
цинской промышленности - в системах доставки лекарств, биосенсорах, ортопедических и зубных имплантах [Liu et al., 2011]; в химической промышленности - в качестве катализатора [Jodin et al., 2006]; в пищевой промышленности - в качестве противослёживающей добавки, красителя, является компонентом эмульгаторов, консервантов, порошков для выпечки, соевых детских смесей, входит в состав противомикробных упаковок [Krewski et al., 2007]. В связи с широким распространением данного наноматериала становятся актуальными исследования, направленные на изучение физических и токсикологических свойств наночастиц оксида алюминия при различных путях поступления в организм.
Цель работы - исследование и оценка острой токсичности и кумулятивных свойств нанодис-персного оксида алюминия при пероральном поступлении.
Материалы и методы
Для проведения исследований использовали порошок нандисперсного оксида алюминия (Aluminum (III) oxide, CAS 1344-28-1, номер продукта 718475) производства компании Sigma Aldrich (США). Для сравнительного анализа использовали порошок микродисперсного оксида алюминия (Aluminum (III) oxide, CAS 1344-28-1, номер продукта 265497) производства компании Sigma Aldrich (США).
Тестируемые вещества использованы в форме водных суспензий посредством внесения порошка в бидистиллированную воду, соответствующую ТУ 6-09-2502-77. Полученные водные суспензии подвергали обработке ультразвуковым гомогенизатором Sonopuls Hd (Bandelin, Германия) при комнатной температуре в течение 15 мин. в режиме непрерывной пульсации на 80%-ной мощности. Оценка размера и формы частиц выполнена методом динамического лазерного светорассеяния на анализаторах Horiba LB-550 (Horiba, Япония) и Microtrac S3500 (Microtrac, США), методом электронной микроскопии на сканирующем микроскопе высокого разрешения S-3400N (HITACHI, Япония) с приставкой для рентгеновского энергодисперсионного микроанализа (Bruker, Германия). Исследование и оценка удельной площади поверхности частиц нативных порошков нано- и микродисперсного материала выполнена по методу Бру-науэра, Эммета и Тейлора на приборе ASAP 2020 (Micromeritics, США) после дегазации исследуемого материала в вакууме при температуре 350°С в течение 3 ч.
Эксперименты с лабораторными животными выполнены в соответствии с требованиями этического комитета ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения и в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных [Guide
..., 2011].
Исследование токсического действия водной суспензии нанодисперсного оксида алюминия при однократном пероральном пути поступления выполнено на лабораторных животных в соответствии с ГОСТ 32644-2014. Развернутый эксперимент проведён на крысах линии Wistar массой 250-300 г в количестве 9 особей. Экспериментальных животных разделили на 3 группы по 3 особи в каждой: опытная группа для исследования нанодисперсного порошка, группа сравнения - микродисперсного аналога, контрольная группа, получавшая соответствующую среду без исследуемых материалов. Исследованная доза нано- и микродисперсного алюминия составила 2000 мг/кг массы тела. Период наблюдения составил 14 сут. Средняя смертельная доза вещества (ЛД50) определена по результатам выживаемости животных с применением алгоритма, представленного в ГОСТ 326442014, класс опасности - в соответствии с ГОСТ 12.1.007.76.
Эксперимент по оценке кумулятивных свойств проведён на 20 мышах линии CD-1. Экспериментальных животных разделили на 3 группы: опытную для исследования нанодисперсного порошка (8 особей), группу сравнения - микродисперсного аналога (8 особей) и контрольную группу (4 особи), получавшую соответствующую среду без исследуемых материалов. Первые 4 дня животным опытной группы перорально вводили дозу нано-дисперсного оксида алюминия, равную 1/10 ЛД50 (1510 мг/кг массы тела), каждые последующие 4 дня дозу увеличивали в 1.5 раза. Водную суспензию микродисперсного оксида алюминия вводили перорально в аналогичных дозах. Контрольная группа получала бидистиллированную воду без вещества. Эксперимент проводили в течение 10 дней в соответствии со схемой, представленной в МУ 1.2.2520-09.
Для оценки материальной кумуляции алюминия после многократного введения исследуемого вещества у экспериментальных животных выполняли отбор мозга, печени и крови. Отобранные образцы подвергали термическому озолению в течение 9 ч. в муфельной печи при температуре 450-500°С. Количественное определение содержания алюминия в образцах осуществляли методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на масс-спектрометре Agilent 7500cx (Agilent, США) с октопольной реакци-онной/столкновительной ячейкой, в качестве газа-реактанта использовали гелий. Расчет концентрации алюминия осуществлялся с учетом массы органа.
Для изучения морфологических изменений в органах и тканях экспериментальных животных после однократного и многократного перорального введений исследуемого вещества выполняли отбор висцеральных органов методом полной эвисцера-ции по Шору. Извлечение головного мозга и бедренной кости для гистологического анализа выполняли специализированным инструментом. Ото-
бранный материал немедленно фиксировали в 10%-ном растворе забуференного нейтрального формалина. Гистологические препараты изготавливали с использованием санного микротома JUNG SM 2000R (Leica, Германия). Микроскопию препаратов осуществляли в светооптическом микроскопе Axiostar (Carl Zeiss, Германия).
Для оценки достоверности различий полученных результатов использовали двухвыборочный t-критерий Стьюдента. Различия результатов являлись статистически значимыми при p<0.05.
Результаты и их обсуждение
Методом динамического лазерного светорассеяния установлен размер исследуемых частиц оксида алюминия в диапазоне 58-100 нм, что в 52260 раз меньше значения у микродисперсного аналога (3-26 мкм). Методом сканирующей электронной микроскопии зарегистрирован максимальный пик распределения частиц оксида алюминия по размеру, соответствующий диапазону 30-40 нм (доля 42%), что в 100-150 раз меньше значения микродисперсного аналога (3-6 мкм). По данным научной литературы, наноразмерный оксид алюминия характеризуется как нерастворимое в воде вещество с эффективным положительным зарядом [Makherjee et al., 2011], низкой адсорбционной ёмкостью [Pal et al., 2016], супергидрофобными свойствами [Nanografi, 2018]. Дзета-потенциал на-ночастиц вещества в воде равен +52.2 мВ [Ansari et al., 2015], что свидетельствует об отсутствии склонности к агрегации. Удельная площадь поверхности наночастиц составила 113 м2/г, что в 161 раз больше значения у микродисперсного аналога (0.7 м2/г).
Исследование острой пероральной токсичности показало, что при однократном введении нанодис-персного оксида алюминия и его микродисперсного аналога через зонд гибели животных не установлено. Следовательно, в соответствии с алгоритмом определения класса острой токсичности, ЛД50 нанодисперсного оксида алюминия >5000 мг/кг массы тела, что соответствует 4-му классу опасности (малоопасное вещество).
Сравнительная оценка морфологических изменений исследуемых тканей и органов животных опытной группы после однократного введения исследуемого вещества позволила установить изменения в лимфатических узлах в виде паракорти-кально-фолликулярной гиперплазии, не отмеченной у животных группы сравнения и контроля. Кроме того, наблюдались более выраженные изменения тканей желудка в виде умеренной эози-нофилии инфильтрата, относительно группы сравнения. У животных опытной группы и группы сравнения проявлялись схожие изменения: в ткани печени в виде острого венозного полнокровия, в селезенке - гиперплазии лимфоидной ткани с увеличением объёма белой пульпы до 40%, эозинофи-
лии пульпы, в тонком кишечнике - слабо выраженной эозинофилии реактивного инфильтрата, гиперплазии клеток Панета, в костном мозге -умеренно выраженной тотальной гиперплазии деятельного костного мозга с преобладанием миело-идного ростка с частичной редукцией жировой ткани и костных балок, не установленные в контроле.
При исследовании материальной кумуляции алюминия после многократного введения нано-размерного вещества в органах и тканях животных опытной группы установлено достоверное увеличение концентрации алюминия в мозге в 4.40 раза (р = 0.0001), печени в 1.23 раза (р = 0.044) и крови в 1.48 раза (р = 0.002) относительно контроля. В органах животных группы сравнения отмечены достоверные увеличения концентраций алюминия в мозге в 3.59 раза (р = 0.001) и крови в 1.82 раза (р = 0.007) относительно контроля. Установлены достоверные увеличения концентраций алюминия в мозге в 1.23 раза (р = 0.036) и печени в 1.41 раза (р = 0.020) у животных опытной группы относительно группы сравнения.
Сравнительная оценка морфологических изменений исследуемых тканей и органов животных опытной группы после многократного введения оксида алюминия позволила установить следующие изменения, не выявленные у животных группы сравнения и контроля: в ткани печени - острое венозное полнокровие, в ткани желудка - слабо-выраженную эозинофилию инфильтрата. В опытной группе отмечены более выраженные изменения, относительно группы сравнения, в тканях селезёнки в виде гиперплазии лимфоидной ткани и увеличения объёма белой пульпы на 70%, тогда как в группе сравнения наблюдалось увеличение на 50%; в толстой кишке установлена реактивная гиперплазия лимфоидной ткани и более выраженная эозинофилия инфильтрата. У животных опытной группы и группы сравнения отмечены схожие изменения в ткани костного мозга в виде выраженной гиперплазии деятельного костного мозга с преобладанием миелоидного ростка и редукцией жировой ткани и костных балок, не установленные у животных контрольной группы.
Исходя из полученных данных, можно утверждать о более выраженной токсичности и кумулятивных свойствах нанодисперсного оксида алюминия сравнительно с его микродисперсным аналогом. Данная особенность нанодисперсного вещества, вероятно, обусловлена размером частиц и удельной площадью поверхности.
В научной литературе имеются сведения о способности наночастиц оксида алюминия проникать через гемато-энцефалический барьер [Аги1 Prakash et а1., 2011]. Результаты, полученные нами в ходе многократного введения нанодисперсного оксида алюминия, показали достоверное повышение концентрации алюминия в мозге, при этом морфологических изменений в его тканях не установлено,
что может указывать на недостаточность суммарной концентрации (21895 мг/кг массы тела) при пероральном поступлении для преодоления гема-то-энцефалического барьера.
Заключение
Исследование размера (30-40 нм) и удельной площади поверхности частиц (113 м2/г) подтвердило, что изучаемый образец оксида алюминия является наноматериалом. Данное вещество при однократном пероральном введении относится к 4-му классу опасности и обладает более выраженной токсичностью, проявляющейся в морфологических изменениях тканей лимфоузлов и желудка экспериментальных животных относительно его микродисперсного аналога.
При многократном пероральном введении обладает материальной кумуляцией, накапливаясь преимущественно в мозге, печени и крови, и функциональной кумуляцией, вызывая морфологические изменения тканей желудка, толстого кишечника, селезёнки и печени. Материальные и функциональные кумулятивные свойства нанодисперс-ного оксида алюминия более выражены по сравнению с микродисперсным аналогом.
Полученные результаты необходимо учитывать при разработке профилактических мер для производителей и потребителей продукции, содержащей наночастицы оксида алюминия.
Библиографический список
Ansari M.A. et al. Green synthesis of A12O3 nanopar-ticles and their bactericidal potential against clinical isolates of multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2015. № 31(1). Р. 153-164. Arul Prakash F. et al. Toxicity studies of aluminium oxide nanoparticles in cell lines // International Journal of Nanotechnology and Applications. 2011. № 5(2). P. 99-107. Guide for the care and use of laboratory animals // National Research Council of the national academies. Washington: The national academies press, 2011. 248 p.
Jodin L. et al. Influence of the catalyst type on the growth of carbon nanotubes via methane chemical vapor deposition // J. Phys. Chem. B. 2006. № 110. P. 7328-7333. Krewski D. et al. Human health risk assessment for aluminium, aluminium oxide, and aluminium hydroxide // J. Toxicol. Environ. Health B. Crit. Rev. 2007. № 10. P. 1-269. Liu X. et al. Amperometric biosensors based on alumina nanoparticles-chitosan-horseradish peroxidase nano-biocomposites for the determination of phenolic compounds // Analyst. 2011. № 136. P. 696-701. Mukherjee A. et al. Antimicrobial activity of aluminium oxide nanoparticles for potential clinical ap-
plications // Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances. 2011. Vol. 1. P. 245-251.
Nanografi. URL:
https://nanografi.com/nanoparticles/al2o3-aluminium-oxide-nanoparticles-aluminic-ester-98-1-1-2-alpha-55nm-super-hydrophobic (дата обращения: 09.06.2018)
Pal U. et al. Mixed titanium, silicon, and aluminum oxide nanostructures as novel adsorbent for removal of rhodamine 6G and methylene blue as cationic dyes from aqueous solution // Chemos-phere. 2016. № 163. Р. 142-152.
Rittner M.N. Market analysis of nanostructured materials // Am. Ceram. Soc. Bull. 2002. № 81. P. 33-36.
Robertson T., Sanchez W., Roberts M. Are Commercially Available Nanoparticles Safe When Applied to the Skin? // Journal of Biomedical Nanotechnology. 2010. № 6(5). P. 452-468.
References
Ansari M.A., Khan H.M., Alzohairy M.A. et al. Green synthesis of Al2O3 nanoparticles and their bactericidal potential against clinical isolates of multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa. World Journal of Microbiology and Biotechnology. N 31(1) (2015): pp. 153-164.
Arul Prakash F., Dushendra Babu G.J., Lavanya M. et al. Toxicity studies of aluminium oxide nanoparticles in cell lines. International Journal of Nanotechnology and Applications. N 5(2) (2011): pp. 99-107.
Guide for the care and use of laboratory animals // National Research Council of the national academies. Washington, The national academies press, 2011. 248 p.
Jodin L., Dupuis A.C., Rouviere E. et al. Influence of the catalyst type on the growth of carbon nano-tubes via methane chemical vapor deposition. J. Phys. Chem. B. N 110 (2006): pp. 7328-7333.
Krewski D., Yokel R., Nieboer E. et al. Human health risk assessment for aluminium, aluminium oxide, and aluminium hydroxide. J. Toxicol. Environ. Health B. Crit. Rev. N 10 (2007): pp. 1-269.
Liu X., Luo L., Ding Y. et al. Amperometric biosensors based on alumina nanoparticles-chitosan-horseradish peroxidase nanobiocomposites for the determination of phenolic compounds/ Analyst. N 136 (2011): pp. 696-701.
Mukherjee A., Sadiq I.M.., Prathna T. et al. Antimicrobial activity of aluminium oxide nanoparticles for potential clinical applications. Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances. 2011, V. 1, pp. 245-251.
Nanografi. Available at: https://nanografi.com/ nanopar-ticles/al2o3 -aluminium-oxide-nanoparticles-aluminic-ester-98-1-1 -2-alpha-55nm-super-hydrophobic (date of the application 09.06.2018)
Pal U., Sandoval A., Uribe Madrid S.I. et al. Mixed titanium, silicon, and aluminum oxide nanostructures as novel adsorbent for removal of rhodamine 6G and methylene blue as cationic dyes from aqueous solution. Chemosphere. N 163 (2016): pp. 142-152.
Rittner M.N. Market analysis of nanostructured materials. Am. Ceram. Soc. Bull. N 81 (2002): pp. 33-36.
Об авторах
Землянова Марина Александровна, доктор медицинских наук, профессор кафедры экологии человека и безопасности жизнедеятельности ФГБОУВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» ORCID: 0000-0002-8013-9613 614990, Пермь, ул. Букирева, 15; zem@fcrisk.ru; (342) 2363930
зав. отделом биохимических и цитогенетических методов диагностики
ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» 614045, Пермь, ул. Монастырская, 82
Степанков Марк Сергеевич, лаборант-исследователь лаборатории биохимической и наносенсорной диагностики ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» ORCID: 0000-0002-7226-7682 614045, Пермь, ул. Монастырская, 82; mmm2920@mai1.ru; (342) 2363930
магистрант биологического факультета ФГБОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Игнатова Анна Михайловна, кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник Пермского краевого центра охраны труда ФГБОУ ВО «Пермский национальный исследовательский политехнический университет» ORCID: 0000-0001-9075-3257 614029, Пермь, Комсомольский проспект, 29; iampstu@gmai1.ru; (342) 2198369
Сибирцев Роман Сергеевич, магистрант биологического факультета ФГБОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» ORCID: 0000-0002-4298-4912 614990, Пермь, ул. Букерева, 15; rom14041995@gmai1.com; (922) 2066867
Robertson T., Sanchez W., and Roberts M. Are Commercially Available Nanoparticles Safe When Applied to the Skin? Journal of Biomedical Nanotechnology. N 6(5) (2010): pp. 452-468.
Поступила в редакцию 27.07.2018
About the authors
Zemlyanova Marina Aleksandrovna, doctor of
medical sciences, professor of the Department of
human ecology and life safety
Perm State University.
ORCID: 0000-0002-8013-9613
15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990;
zem@fcrisk.ru; (342) 2363930
Head of Department of Biochemical and Cytogenetic Diagnostic Methods Federal budget scientific institution «Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies». 82, Monastyrskaya str., Perm, Russia, 614045
Stepankov Mark Sergeevich, laboratory assistant-researcher of the laboratory of biochemical and nanosensor diagnostics Federal budget scientific institution «Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies». ORCID: 0000-0002-7226-7682 82, Monastyrskaya str., Perm, Russia, 614045; mmm2920@mail.ru; (342) 2363930
graduate student of biological faculty
Perm State University.
15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990
Ignatova Anna Mihailovna, candidate of technical sciences, Leading Researcher of the Perm Territory Center for Occupational Safety and Health Perm National Research Polytechnic University. ORCID: 0000-0001-9075-3257 29, Komsomolskij prospect, Perm, Russia, 614029; iampstu@gmail.ru; (342) 2198369
Sibirtsev Roman Sergeevich graduate student of
biological faculty
Perm State University.
ORCID: 0000-0002-4298-4912
15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990;
rom14041995@gmail.com; (922) 2066867
Информация для цитирования:
Исследование и оценка острой токсичности и кумулятивных свойств нанодисперсного оксида алюминия при пероральном поступлении / М.А. Землянова, М.С. Степанков, А.М. Игнатова, Р.С. Сибирцев // Вестник Пермского университета. Сер. Биология. 2018. Вып. 3. С. 313-317. DOI: 10.17072/1994-99522018-3-313-317.
Zemlyanova M.A., Stepankov M.S., Ignatova A.M., Sibirtsev R.S. [Research and assessment of acute toxicity and cumulative properties of nanodispese aluminum oxide at oral intake]. Vestnik Permskogo universiteta. Biologija. Iss. 3 (2018): pp. 313-317. (In Russ.). DOI: 10.17072/1994-9952-2018-3-313-317.
