CC BY
0СЕКЦИЯ 2. ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ ЭКСПЛУАТАЦИИ ОБЪЕКТОВ НЕФТЕГАЗОВОГО КОМПЛЕКСА
УДК 577.151
DOI 10.24412/cl-37255-2024-1-121-124
ИССЛЕДОВАНИЕ ГИББЕРИЛИН-ПОДОБНОЙ АКТИВНОСТИ У
МИКРООРГАНИЗМОВ, ОКИСЛЯЮЩИХ НЕФТЯНЫЕ УГЛЕВОДОРОДЫ
Вит А.А.1, Салтыкова А.Л.1, Ерофеевская Л.А.2, Далбаева Е.А.1,2, Сивцев С.И.2, Ефимов С.Е.2
1 Федеральный исследовательский центр «Якутский научный центр Сибирского отделения
Российской академии наук», г. Якутск
2 Федеральный исследовательский центр «Якутский научный центр Сибирского отделения
Российской академии наук», обособленное подразделение Институт проблем нефти и газа СО РАН, г. Якутск E-mail: alina_vit@list.ru
Аннотация. Представлены результаты исследований способности углеводородокисляющих микроорганизмов проявлять гиббереллин-подобную активность. Установлено, что предпосевная бактеризация семян районированного сорта пшеницы «Приленская 19» бактериями, выделенными из мерзлотных почв Якутии: в составе: Bacillus atropheus и Pseudomonas panipatensis, способна стимулировать всхожесть фитомелиоранта, а также способствует снижению инфицированности биотест-растения фитопатогенными грибами, в частности, Rhizophus oryzae. В опытных образцах наблюдалась положительная зависимость между интенсивностью нефтяного загрязнения и уровнем прорастаемо-сти семян пшеницы. Данное исследование направлено на решение задач биоремедиации нефтезагряз-ненных земель в условиях криолитозоны.
Ключевые слова: гиббереллины, нефтезагрязнение, углеводородокисляющие микроорганизмы, ремеди-ация, фитотоксичность.
Проблема загрязнения окружающей среды (ОС), особенно в результате нефтяных разливов, представляет собой одну из самых актуальных экологических задач современности. Нефть содержит сложные углеводороды (УВ), которые оказывают негативное влияние на экосистемы и здоровье человека. В связи с этим, поиск эффективных методов биоремедиации, способных восстанавливать загрязненные территории, особенно в условиях криолитозоны, становится все более актуальным. Скорость восстановления плодородия почвы после техногенного загрязнения, в частности, разлива нефти, зависит от оперативности проведения очистных мероприятий. Если вовремя не провести восстановительные работы, то за время, в течение которого, нефть и нефтепродукты (НП) контактируют с почвой и водными объектами, их последовательная трансформация будет зависеть от многих природно-климатических факторов, воздействие которых приводит к деструктивным превращениям их состава, вследствие улетучивания легких фракций, вымывания водами водорастворимых компонентов, а также химического и биологического окисления в почве нефтяных УВ и увеличению содержания ас-фальтово-смолистых компонентов, сохраняющихся в мерзлотно-климатических условиях криолитозоны в течение нескольких десятилетий.
Основными факторами отрицательного воздействия нефтяного загрязнения экосистем являются токсическое действие УВ нефти на биологические объекты и изменение физико-химических свойств почвы [1]. В результате обволакивания почвенных частиц нефтью происходит нарушение водного и воздушного режимов. В почвах возрастает отношение углерода к азоту. Ухудшается азотный режим [2]. Снижается нитрифицирующая активность и основная часть азота выступает в аммонийной форме [3]. Нарушается почвенный гомеостаз. Развивается токсикоз и дисбактериоз почв, что приводит к угнетению развития корневой системы растений, нарушению функций репродуктивных органов, фотосинтеза и дыхания. Возрастающий
в составе гумуса нерастворимый остаток ухудшает плодородие почв. Это, в свою очередь, наносит ощутимый экономический ущерб земледелию [4].
Ключевую роль в процессах биоразложения нефти играют углеводородокисляющие микроорганизмы (УОМ). Они обладают способностью преобразовывать УВ в менее токсичные соединения, что делает их важными участниками в естественной очистке экосистем. Однако, помимо их основной функции, существует интересный аспект, связанный с тем, как эти микроорганизмы могут взаимодействовать с растениями. В частности, потенциальное выявление гиббереллин-подобной активности у этой группы микроорганизмов открывает новые горизонты исследования.
Гиббереллины - это гормоны роста растений, которые регулируют различные физиологические процессы, включая рост стеблей растений в длину, развитие плодов, семян и адаптацию к стрессовым условиям.
Ранее не было проведено достаточного количества исследований, посвященных изучению возможности синтеза гиберреллиноподобных продуктов УОМ в условиях криолитозоны. Это вызывает интерес, поскольку выделяемые ими метаболиты могут сыграть значительную роль в росте и развитии растений, способствуя восстановлению нарушенных земель. Эффект фитомелиорации с применением полезных бактерий, способных разлагать загрязняющие вещества, выделять соединения, ускоряющие рост растений или оберегающие их от воздействия патогенной микрофлоры, особенно актуально для Якутии, поскольку, криогенные почвы обладают особой ранимостью, обусловленной природно-климатическими условиями региона. Такой подход к решению проблемы позволит в короткие сроки в суровых климатических условиях Якутии предотвратить распространение веществ-загрязнителей на сопряженные ландшафты, повысить плодородие почв, а также значительно улучшить санитарно-эпидемиологическое состояние, как на загрязненном участке, так и на непосредственно прилегающей к нему территории и ОС в целом.
Полученные результаты исследования могут иметь значительную перспективность как для биоремедиации мерзлотных почв, так и для агрономии, открывая новые подходы к использованию микроорганизмов в экологически чистых технологиях восстановления почвы и повышения продуктивности сельскохозяственных культур, выращиваемых в условиях открытого или закрытого грунта в регионах, расположенных в Арктической и Субарктической климатических зонах.
Целью данной работы является изучение гиббереллин-подобной активности у микроорганизмов, изолированных из нефтезагрязненных почв.
Материалом для исследований служили:
1. Фоновочистые и нефтезагрязненные почвы аварийных территорий нефтегазового комплекса (НГК) Якутии;
2. Штаммы углеводородокисляющих бактерий, выделенные из мерзлотных почв Якутии;
3. Семена фитомелиорантов, применяемых для рекультивации нарушенных земель нефтегазового комплекса (НГК) Якутии.
Пробы почв отбирали в соответствии с ГОСТ [5, 6]. Пробоподготовку проводили по общепринятым методическим требованиям [7]. Определение численности микроорганизмов проводили классическим культуральным методом Коха [8]. Приготовление разведений для получения изолированных колоний и проведение посевов проводили в соответствии с обще-утвержденной в микробиологии методике [9]. Для определения нефтеокисляющей активности УОМ использовали метод накопительных культур [10]. Для изучения фитотоксичности исследуемых почв применяли метод биотестирования [12]. Погрешность рассчитывали по критерию Ньюмена-Кейлса [11].
Опыты проводили с районированным сортом пшеницы «Приленская 19» (ТгНЫеит «РгШткта 19») в искусственно загрязненной почве (в концентрациях 0,5; 5,0 и 10,0%), отобранной в лесной зоне в районе Маганского тракта 2 км городского округа Якутск. Для загрязнения почв использовали нефть Талаканского месторождения.
В опытах для обработки семян использовали штаммы углеводородокисляющих бактерий, выделенные из мерзлотных почв Якутии: Bacillus atropheus ELA-2 и Pseudomonas panipatensis ELA-3.
Для эксперимента жидкие культуры бактерий были выращены на мясо-пептонном бульоне (МПБ) (100 см3) в колбах (250 см3). Ферментацию проводили в течение 48 часов на качалке «УВМТ 12-250» при 200 об/мин. и температуре +25°С. Концентрация жизнеспособных клеток бактерий в полученных культурах была в пределах 1-5 миллионов клеток на 1 мл МПБ.
Семена пшеницы замачивали в жидких культурах бактерий и раскладывали в стерильные чашки Петри с опилками на фильтровальную бумагу по 25 штук в пяти повторностях. Семена проращивали в термостате при температуре +25°С. После шести дней проращивания в термостате чашки размещали в термостатированном освещенном помещении с температурой 25°С. Контрольные семена замачивали дистиллированной водой. Лабораторную всхожесть семян определяли через 12 дней по общепринятой методике [12]. Одновременно измеряли длину корней проростков и высоту стебля. После окончания эксперимента проводили взвешивание зеленой массы пшеницы и массы тест-растений после их высушивания контактным способом в течение пяти суток.
Экспериментальные исследования, проведенные выше описанным способом, показали, что оба штамма: Bacillus atropheus ELA-2 и Pseudomonas panipatensis ELA-3, обладают гибер-реллиновой активностью. Обработка семян жидкой культурой бактерий способствовала увеличению прорастания и всхожести тестового растения пшеницы «Приленская 19». В экспериментах наблюдалась, что семена пшеницы прорастали быстрее в тех случаях, когда применялась обработка спорами бактериального штамма Bacillus atropheus ELA-2. Немного ниже уровень прорастания был зафиксирован в опыте с применением штамма Pseudomonas panipatensis ELA-3. Прирост зеленой массы тест растения также был выше в варианте с бактеризацией семян пшеницы споровой культурой Bacillus atropheus (табл. 1).
Таблица 1 - Влияние бактеризации семян на всхожесть пшеницы сорта «Приленская 19» и наращивание зеленой массы в почвах с различной концентрацией нефтезагрязнения
Всхожесть семян, % Вес зеленой массы, г
Содержание нефти, % в варианте до бактери- в варианте после бактери- в варианте без проведения бакте- в варианте после бактеризации
зации зации ризации
Bacillus atropheus ELA-2
0,5 52,2±2,0 78,6±3,2 0,426±0,02 0,638±0,03
5,0 42,4±2,0 64,4±3,1 0,422±0,02 0,638±0,03
10,0 28,6±1,3 51,4±2,5 0,418±0,02 0,602±0,03
Чистая почва 96,0±4,2 99,8±4,4 0,433±0,02 0,713±0,03
Pseudomonas panipatensis ELA-3
0,5 52,2±2,0 63,0±3,1 0,428±0,02 0,542±0,02
5,0 42,4±2,0 52,0±2,0 0,436±0,02 0,513±0,02
10,0 28,6±1,3 33,0±1,6 0,438±0,02 0,501±0,02
Чистая почва 96,0±4,2 98,2±4,3 0,430±0,02 0,698±0,03
Контроль - не обработанная почва
0,5 52,2±2,0 38,0±1,8 0,434±0,02 0,304±0,01
5,0 42,4±2,0 24,2±1,1 0,430±0,02 0,268±0,01
10,0 28,6±1,3 4,0±2,0 0,414±0,02 0,202±0,01
Чистая почва 96,0±4,2 96,4±4,7 0,426±0,02 0,712±0,03
p<5 по коэффициенту Ньюмена-Кейлса
Также стоит отметить, что при загрязнении почвы нефтью в концентрации 10% всходы пшеницы, не обработанной бактериальными штаммами через 10-15 суток начинали желтеть и сохнуть.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о наличии гиберрилиновой активности у исследованных штаммов УОМ: Bacillus atropheus ELA-2 и Pseudomonas panipatensis ELA-3. Более высокую эффективность проявляет штамм Bacillus atropheus. Опыты с семенами пшеницы «Приленская 19», обработанные жидкой спорообразующей бациллярной культурой, демонстрировали несколько ускоренные темпы прорастания и накопления зеленой массы по сравнению с вариантом опыта, в котором для бактеризации семян тест-растения использовали жидкую культуру Pseudomonas panipatensis. Тем не менее, эффект обработки семян бактериями рода Pseudomonas также был значимым. В контрольном варианте, где почва и семена не подвергались бактеризации, наблюдалась фитотоксичность, что выражалось в низкой прорастаемости семян и слабом росте и накоплении зеленой массы пшеницы. Это указывает на возможность использования штаммов Bacillus atropheus ELA-2 и Pseudomonas panipatensis ELA-3 в качестве агрономических биопрепаратов для стимулирования роста и повышения урожайности фитомелиорантов, что может иметь практическое значение в агрономии и экологии в целом. Таким образом, для дальнейшего улучшения методов агрозащиты и реабилитации нарушенных земель целесообразно продолжить исследования потенциала бактериальных штаммов в условиях производственного эксперимента, определяя их метаболизм, наилучшие сочетания, способы применения, а также их эффективность в очистке почв от нефтезгрязнений в условиях криолитозоны.
Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (рег. № 122011200369-1) с использованием научного оборудования Центра коллективного пользования ФИЦ ЯНЦ СО РАН.
Список литературы
1. Гузев В.С., Левин С.В., Селецкий Г.И., Бабьева Е.Н., Калачникова И.Г., Колесникова Н.М., Оборин А.А., Звягинцев Д.Г. Роль почвенной микробиоты в рекультивации нефтезагрязнен-ных почв // Микроорганизмы и охрана почв. М.: Издательство МГУ, 1989. С. 121-150.
2. Халимов Э.М., Левин С.В., Гузев В.С. Экологические и микробиологические аспекты повреждающего действия нефти на свойства почвы // Вестник Московского Университета. Серия 17. Почвоведение. 1996. № 2. С. 59-64.
3. Алехин В.Г., Емцев В.Т., Рогозина Е.А., Фахрутдинов А.И. Биологическая активность и микробиологическая рекультивация почв, загрязненных нефтепродуктами // Биологические ресурсы и природопользование: Сборник науч. трудов. - Нижневартовск: Издательство Нижневартовского педагогического института, 1998. С. 95.
4. King D.H., Perry J.J. The origin of fatty acids in the hudrocardon-utilizing microorganism Mycobacterium vaccae. Canadian journal of Microbiology, 1975. № 21(1). P. 85-89. DOI: 10.1139/m75-012.
5. ГОСТ 17.4.3.01-2017 Охрана природы (ССОП). Почвы. Общие требования к отбору проб. - Введ. 2019-01-01. - М.: Стандарт информ, 2018. 8 с.
6. ГОСТ 17.4.4.02-2017. Охрана природы. Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа. - Введ. 2019-01-01. - М.: Стандарт информ, 2018. 16 с.
7. ГОСТ Р ИСО 22030-2009. Качество почвы. Биологические методы. Хроническая фито-токсичность в отношении высших растений. М.: Стандарт информ, 2010. 20 с.
8. ГОСТ Р 51426. Микробиология. Корма, комбикорма, комбикормовое сырьё. Общее руководство по приготовлению разбавлений для микробиологического исследования. М.: Стандарт информ, 2016. 10 с.
9. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки // Микробиология, 1963, № 5, С. 1024-1030.
10. ГОСТ Р ИСО 22030-2009. Качество почвы. Биологические методы. Хроническая фито-токсичность в отношении высших растений. М.: Стандарт информ, 2010. 20 с.
11. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. М., Практика, 1998. 459 с.
