CC BY
57
ФОРМИРОВАНИЕ КОНСОРЦИУМА УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ
МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ ОТ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕНИЙ В ПРИРОДНО-КЛИМАТИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ
ЯКУТИИ
Ерофеевская Лариса Анатольевна научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения РАН, РФ,
г. Якутск e-mail: [email protected] Глязнецова Юлия Станиславовна канд. хим. наук, старший научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем нефти и газа Сибирского
отделения РАН, РФ, г. Якутск
THE FORMATION OF A CONSORTIUM OF ACTIVIZATION OF HYDROCARBON OXIDATIVE MICROORGANISMS TO CLEAN SOIL FROM OIL SPILLS IN THE CLIMATIC CONDITIONS OF THE YAKUTIA
Erofeevskaya Larisa Anatoljevna
research associate Institute of Oil and Gas Problems, Siberian Branch of the Russian
Academy of Sciences, Russia Yakutsk Gliaznetzova Yulja Stanislavovna candidate. chem. sciences, senior researcher Institute of Oil and Gas Problems, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Russia Yakutsk
АННОТАЦИЯ
Проведены лабораторно-полевые эксперименты по изучению влияния биопрепаратов на основе природного сырья на очистку мерзлотной почвы от загрязнений нефтепродуктами. По результатам изучения состава и химической структуры выделенных экстрактов почвенных проб после обработки углеводородокисляющими бактериями Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 и Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 установлена высокая степень деградации нефтезагрязнения. За один летний сезон, на делянах с биопрепаратами, деструкция нефти составила 73,8 %.
ABSTRACT
The aim of these works has been the study of permafrost soil purification from oil products contamination. A high degree of degradation and contamination by oil is established according to the results of studying the composition and chemical structure of isolated extracts of soil samples after their treating with indigenous
hydrocarbon oxidizing bacteria Bacillus vallismortis VKPM V-11017 and Exiguobacterium mexicanum VKPM V -11011. During one summer season on the plots with the biological preparations carriers the oil fuel destruction has made 73,8 %.
Ключевые слова: нефть; бактерии; экологическая безопасность; нефтепродукты; деградация; микроорганизмы; экология; биопрепараты; почва; углеводородное загрязнение.
Keywords: oil; bacteria; environmental safety; ой products; degradation; microorganisms; ecology; biological products; soil; hydrocarbonic pollution.
Одним из экологически обоснованных и наиболее эффективных методов восстановления почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в настоящее время является микробиологический метод, основанный на активации почвенных микроорганизмов, способных к утилизации нефтяных углеводородов. Для мерзлотных почв Якутии выбор нефтедеструкторов, эффективно работающих в климатических условиях криолитозоны, требует специальных исследований и мониторинга за процессами трансформации и биологической деструкции нефтезагрязнений.
Цель работы. Разработать консорциум углеводородокисляющих микроорганизмов перспективный для очистки нефтезагрязненных почв в природно-климатических условиях Якутии.
Материалы и методы исследований. В работе исследованы штаммы Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 и Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011, депонированные во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика, Москва.
Для культивирования штамма использовали метод жидких накопительных культур на минеральной среде Мюнца [2, с. 1024—1030].
В качестве единственного источника углерода использовали нефть Талаканского месторождения, с содержанием 0,82 % парафиновых и 12,4 % смолистых веществ [9, с. 165—170].
Оценку показателя жизнеспособности штамма проводили чашечным методом Коха [7, c. 40].
Идентификацию выделенного штамма проводили на основе изучения их морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств [3, c. 830; 4, с. 800] с привлечением анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S pРНК.
Построение деревьев родства проводили с использованием технических возможностей сайта [10].
Определение нефтепродуктов в водной среде определяли спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-025» [8].
Качество очистки почв от нефтезагрязнений контролировалось геохимическими методами [1, с. 1030—1033; 5, с. 3—9; 6].
Результаты исследований.
В результате целенаправленных исследований сформирован консорциум УОМ, перспективный для очистки почв от нефтезагрязнений. Консорциум представлен штаммами Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 и Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011.
Полученные штаммы характеризуются следующими признаками:
1. Штамм Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 получен методом накопительных культур из пробы нефтезагрязненной почвы, отобранной на 1351,5 км участка трассы магистрального нефтепровода «Восточная Сибирь-Тихий Океан».
Культурально-морфологические признаки. Грамположительные споровые палочки, в мазках расположены одиночно и короткими цепочками. На МПА формирует сморщенные суховатые колонии бежевого оттенка, диаметром до 1 см; через 1—3 суток колонии окрашиваются в коричневый цвет, субстрат не
пигментируют. В МПБ растет в виде морщинистой плёнки бежевого цвета поверх бульона. На агаризированной минеральной среде Мюнца с нефтью формирует непрозрачные матовые серо-бежевые колонии, диаметром 0,1— 0,2 см.
Физиолого-биохимические признаки. Штамм хорошо растёт при температуре от +8 до +37 °С, в аэробных условиях, при рН 6,0—8,0. Оптимум роста + 30 °С. Способен к росту в солевом бульоне с добавлением 0,1—2,0 % №0. Штамм каталаза положителен, оксидаза отрицателен. Не усваивает лизин и орнитин. Не потребляет цитрат и малонат натрия. Желатин не гидролизует. Крахмал не разлагает. Индол отрицателен. Не образует сероводород. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная. Фенилаланиндезоксаминаза отрицательная. Ферментирует бета галактозидазу.
При секвенировании вариабельных участков 16S rDNA была получена следующая нуклеотидная последовательность:
TCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGG GTGAGTAACACGT
GGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCT AATACCGGATGCTT
GTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACT TACAGATGGACCC
GCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGA TGCGTAGCCGACC
TGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTC CTACGGGAGGCAGC
AGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCC GCGTGAGTGATGAA
GGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGT TCAAATAGGGCGG
CACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAG CAGCCGCGGTAAT
ACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCG CAGGCGGTTTCTT
AAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGA AACTGGGGAACTTG AA
Результаты обработки секвенсов при помощи компьютерной программы находящейся на сайте RDB II (Ribosomal Database Project II), предназначенной для определения родства микроорганизмов и построения филогенетических деревьев, представлены в графическом виде:
S000003473 0.994 0.942 1423 Bacillus subtilis (T); DSM10; AJ276351 S000006847 0.994 0.942 1435 Bacillus mojavensis (T); IFO15718; AB021191 S000012241 0.998 0.998 1440 Bacillus vallismortis (T); DSM11031; AB021198
S000014133 0.996 0.986 1426 Bacillus atrophaeus (T); JCM9070; AB021181 S000428475 0.998 0.964 1337 Bacillus subtilis (T); NRRL B-23049; AF074970 S000734915 0.994 0.967 1389 Bacillus amyloliquefaciens (T); NBRC 15535 S000858651 0.988 0.863 1465 Bacillus licheniformis (T);ATCC 1458; DSM 13 S000858655 0.988 0.863 1466 Bacillus licheniformis(T);ATCC 14580; DSM 13 S000858658 0.988 0.863 1468 Bacillus licheniformis (T); ATCC 14580; DSM13
Скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus, гомология с видом Bacillus vallismortis составляет 99 %.
2. Штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 получен методом накопительных культур из пробы нефтезагрязненной почвы, отобранной на 4,038 км шлейфа участка трассы магистрального нефтепровода «Восточная Сибирь-Тихий Океан».
Культурально-морфологические признаки. Грамположительные палочки, размером 0,8—1,0 мкм. В мазках располагаются скоплениями и попарно.
Факультативные анаэробы. Спор и капсул не образуют. На МПА формируют влажные, от грязно-желтого до оранжевого цвета колонии округлой формы. В МПБ вызывает диффузное помутнение с образованием пленки поверх бульона. На агаризированной минеральной среде Мюнца с нефтью растет в виде непрозрачных матовых колоний, диаметром 1—3 мм.
Физиолого-биохимические признаки. Штамм растёт при температуре от +4 до +37 °С при рН 6,0—8,0, лучше в аэробных условиях. Оптимум роста + 20+25 °С. Растёт в солевом бульоне с добавлением 0,1—2,0 % №0. Штамм каталаза положителен, оксидаза отрицателен. Не усваивает многоатомные спирты. Слабо ферментирует глюкозу и сахарозу. Не усваивает лизин и орнитин. Не потребляет цитрат и малонат натрия. Желатин не гидролизует. Крахмал не разлагает. Индол отрицателен. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная. Фенилаланиндезоксаминаза отрицательная. Ферментирует бета галактозидазу.
При секвенировании вариабельных участков 16S rDNA получена следующая собранная нуклеотидная последовательность:
GACGGAACCCTTCGGGGGGAAGTCGACGGAATGAGCGGCGGACGGG TGAGTAACACGTAA
AGAACCTGCCCTCAGGTCTGGGATAACCACGAGAAATCGGGGCTAAT ACCGGATGGGTCA
TCGGACCGCATGGTCCGAGGATGAAAGGCGCTTCGGCGTCGCCTGGG GATGGCTTTGCGG
TGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGATGCA TAGCCGACCTGAG
AGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTAC GGGAGGCAGCAGTA
GGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGT GAACGATGAAGGCC
TTCGGGTCGTAAAGTTCTGTTGTAAGGGAAGAACAAGTGCCGCAGGC AATGGCGGCACCT
TGACGGTACCTTGCGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCC GCGGTAATACGTA
GGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGC GGCCTCTTAAGTC
TGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAAGGCNTTGAACGGGAA GCTGAGTATA
Результаты обработки секвенсов при помощи компьютерной программы (Ribosomal Database Project II) представлены в графическом виде:
S000417444 0.938 0.711 1403 Exiguobacterium indicum (T); HHS 31; AJ846291
S000439502 0.940 0.723 1423 Exiguobacterium oxidotolerans (T); AB105164 S000466589 0.975 0.870 1405 Exiguobacterium profundum (T); 10C; AY818050
S000504076 0.977 0.898 1422 Exiguobacterium aestuarii (T); TF-16; AY594264
S000504078 0.973 0.872 1420 Exiguobacterium marinum (T); TF-80; AY594266
S000571530 0.990 0.972 1321 Exiguobacterium mexicanum (T); 8N; AM072764
5000650873 0.942 0.716 1458 Exiguobacterium antarcticum (T); DSM 14480
5000650874 0.943 0.725 1458 Exiguobacterium undae (T); DSM 14481; DQ019165
5000650875 0.990 0.930 1448 Exiguobacterium aurantiacum (T); DSM 6208
5000650876 0.936 0.709 1451 Exiguobacterium acetylicum (T); DSM 20416 Скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый
штамм принадлежит к следующим систематическим группам Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Exiguobacterium, гомология с видом Exiguobacterium mexicanum составляет 99 %.
Установлено, что штаммы не проявляют антагонистической активности по отношению друг к другу, способны расти на минеральной среде Мюнца,
обладают утилизирующей способностью по отношению к нефти, сохраняют свою жизнеспособность после зимнего периода, что позволяет использовать консорциум для очистки нефтезагрязненных почв в течение всего вегетационного периода.
За 1 северное лето деградация нефти в почве обработанной суспензиями на основе монокультур штаммов Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 составила 63,9 и 64,3 % соответственно, при этом обработка почвы смесью культур в соотношении 1: 1 способствовала утилизации нефтепродуктов до 73,8 %, в то время, как естественные потери нефти в почве, не обработанной бактериальной суспензией, составили 4,1 % за тот же промежуток времени (таблица 1).
Таблица 1.
Динамика деструкции нефтезагрязнения под влиянием штаммов Bacillus
vallismortis ВКПМ В-11017 и Exiguobacterium mexicanum ВК ПМ В-11011
Вариант опыта Содержание НП, мг/кг Степень деградаци и, %
май сентябр ь
Контроль (почва + нефть) 29823 28598 4,1
Почва + нефть + В. уаШБтогйБ В-11017 19742 7050 64,3
Почва + нефть + Ех.техсапит В-11011 10689 3862 63,9
Почва + нефть + смесь штаммов В-11017+В-11011 15101 3960 73,8
Таким образом, разработан консорциум штаммов на основе бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 перспективный для очистки почв от нефтезагрязнений в природно-климатических условиях Якутии.
Вывод.
Применение консорциума штаммов на основе бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 актуально в следующих направлениях:
1. Стимуляция естественной углеводородокисляющей микрофлоры мерзлотных почв, участвующей в биодеградации нефтяных загрязнений;
2. Оптимизация процессов биологического окисления нефти и нефтепродуктов с целью достижения высокого эффекта в очистке и доочистке нефтезагрязненных мерзлотных почв;
3. Снижение токсичности почв и стимулирование появления естественного растительного покрова на загрязненных участках, что значительно улучшает санитарно-экологическое состояние нарушенных земель.
Авторы выражают благодарность сотрудникам ФГУП ГосНИИгенетика за выполнение таксономических исследований.
Список литературы:
1. Зуева И.Н., Глязнецова Ю.С., Чалая О.Н, Лифшиц С.Х. Методы органической геохимии при мониторинге нефтезагрязнений и ремидиации почв // Известия Самарского научного центра РАН. — Том 12(33) — № 1 (4), — 2010. — С. 1030—1033.
2. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки // Микробиология, — 1963, — № 5,
— С. 1024—1030.
3. Красильников Н.А. Определитель бактерий и актиномицетов, М.-Л., Изд. АН СССР,1949. — 830 с.
4. Определитель бактерий Берджи / под Ред. Д. Хоулта, Н. Крига, П. Снута и др. М.: Мир, — 1997, — т. 1—2, — 800 с.
5. Петров С.И., Тюлягина Т.Н., Василенко П. А. Определение нефтепродуктов в объектах окружающей среды (обзор) // Заводская лаборатория. — 1998.
— № 9. — Том 65. — С. 3—19.
6. РД 52.18.647-2003. Методические указания определения массовой доли нефтепродуктов в почвах. Методика измерений гравиметрическим методом.
7. Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов: Методические указания. Екатеринбург: ГОУ ВПО УГТУ-УПИ, 2005. — 40 с.
8. ФР.1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117 Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025».
9. Чалая О.Н., Зуева И.Н., Лифшиц С.Х., Трущелева Г.С., Иванова И.К. Состав и свойства нефти Талаканского месторождения //Малотоннажная переработка нефти и газа в Республике Саха (Якутия): Материалы конференции (26—27 июля 2001 г., г. Якутск). Якутск, Изд-во ЯЧНЦ СО РАН, 2001. — С. 165—170.
10. Ribosomal Database Project II. [Электронный ресурс] — Режим доступа. — URL: http://rdp.cme.msu.edu (дата обращения: 02.09.12)
