CC BY
26
ЕСТЕСТВОЗНАНИЕ
И.И. Дигурова, А.Г. Гущин
ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕМОРЕОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ С ПОМОЩЬЮ МИКРОМЕТОДОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДАХ СТРЕССА У КРЫС
Стрессорное воздействие может стать пусковым механизмом развития ряда заболеваний [14]. Одним из важных направлений физиологии является изучение возникающих в организме изменений и процессов адаптации при действии экстремальных факторов.
Чрезвычайные ситуации, длительное хирургическое лечение, проведение экспериментов на животных приводят к ограничению подвижности. При иммобилизации изменения, характерные для стресса, существенно преобладают над изменениями, связанными со снижением двигательной активности [4]. Предельные мышечные нагрузки также являются экстремальным воздействием, приводящим к нарушению гемореоло-гического статуса [6]. Наличие стресса при этих состояниях подтверждается данными об изменении в крови уровней адреналина, норадренали-на, дофамина, концентрации 11-оксикортикосте-роидов [3; 9; 10; 12]. В разные сроки иммобилизации происходит уменьшение концентрации гемоглобина [7], усиление реакции оседания эритроцитов, изменение микроциркуляции [2]. Плавание с грузом приводит к увеличению объёма и количества эритроцитов, повышению концентрации гемоглобина. Стрессорным воздействием является перемещение тела в антиортостатическое положение, вследствие чего возникает существенная перестройка системы кровообращения [11].
Таким образом, влияние на организм внешних факторов вызывает его реакцию, в том числе и со стороны системы крови. Однако, гемореологи-ческие изменения недостаточно исследованы при этих воздействиях.
Биохимические механизмы, вовлекаемые в стрессорные реакции, однотипны у животных и человека [1]. Поэтому, использование животных для изучения стресса является оправданным. При экспериментальных исследованиях, проводимых на крысах, для получения крови часто производят декапитацию или перерезку сонной артерии. Эти методы имеют недостатки. При дека-
питации в пробу крови попадает кислое содержимое желудка. Умерщвление крыс нежелательно и делает невозможным изучение динамики исследуемых характеристик. Альтернативой, поэтому, является применение микрометодов для изучения реологического состояния крови у мелких лабораторных животных.
В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явился анализ гемореологических показателей при различных стрессах с использованием микрометодов.
Материалы и методы. Эксперимент проведён на 66 белых беспородных крысах-самцах массой 180-240 г. Все животные находились в одинаковых условиях содержания и кормления. С ними работали в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» [8]. Беспородные крысы имеют более широкие нормы реакций, чем линейные что позволяет с большей точностью экстраполировать данные на человека [12]. Животные были неадаптированы к стрессам и ненаркотизированы.
Для оценки влияния первоначально взятого объёма крови на макрореологические показатели во второй пробе их измерение осуществлялось дважды с интервалом 45 минут. В течение этого времени животные не подвергались никаким воздействиям. Объём начальной пробы составлял не более 5% от объёма циркулирующей крови, а масса - 0,3% от массы тела. Расчёты сделаны с учётом того, что масса циркулирующей крови составляет 6,5-7,5% от массы тела крысы, а плотность её крови равна 1050 кг/м3 [5]. Таким образом у животного массой 200 г объём первоначальной пробы не превышал 0,6 мл.
Ограничение подвижности моделировали помещением крыс в тесные клетки-футляры на 1, 3, 6 и 24 часа. Такая иммобилизация не являлась жёсткой. В качестве физической нагрузки применяли плавание с грузом, составляющим 7,5% от массы тела в воде с температурой 33° С до полно-
6
Вестник КГУ им. Н.А. Некрасова ♦ № 6, 2006
© И.И. Дигурова, А.Г Гущин, 2006
Исследование гемореологических показателей с помощью микрометодов при различных видах стресса..,
го утомления. Ортостатический стресс осуществляли помещением крыс вниз головой под углом 90° к горизонтальной поверхности на 45 минут.
Забор крови из хвостовой вены производили до опыта и после окончания действия стрессового фактора. В качестве стабилизатора использовали гепарин в микродозах. Гематокритный показатель определяли путём центрифугирования крови в микрокапиллярах в течение 30 минут при 3000 об/мин., а вязкость - с помощью капиллярного визкозиметра. Концентрацию гемоглобина измеряли гемиглобинцианидным методом на спектрофотометре СФ-46, а содержание общего белка - рефрактометрическим способом. Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерных программ.
Результаты и обсуждение. В ходе эксперимента установлено, что взятие первой пробы в количестве, составляющем не более 5% от объёма циркулирующей крови и 0,3% от массы тела, не оказывало серьёзного воздействия на значения макрореологических параметров в следующей пробе. Так, гематокритный показатель, концентрация гемоглобина и содержание общего белка не отличались от исходного уровня. Вязкость крови, являющаяся комплексным параметром, также статистически достоверно не изменялась. Следовательно, первоначальная кровопотеря в объёме 0,6 мл не является существенной для крыс массой 200 г и более. Так как количество взятой крови небольшое, то плазму для определения содержания белка можно брать из гематокрит-ных микрокапилляров. После измерения объёмной концентрации эритроцитов капилляр следует разломить и плазму выдуть на призму рефрактометра. Так как для определения вязкости требуется 0,3 мл крови, а концентрации гемоглобина - 0,02 мл, то общий расход для измерения всех четырёх показателей составляет не более 0,4 мл. При взятии 0,6 мл оставшуюся кровь можно использовать для изучения деформируемости методом фильтрации суспензии эритроцитов в физиологическом растворе с гематокритным показателем, равным 2%, и агрегации микроскопиро-ванием в камере Горяева.
При различных воздействиях на организм измерения проводят до и после опыта. Вторая проба может быть любого объёма, достаточного для исследования, однако, его потеря не должна причинить вреда животному. Если количество взятой крови будет таким же, как до опыта (0,4-
0,6 мл), то общая кровопотеря составит 0,4-0,6% от массы тела и не более 6-10% от объёма циркулирующей крови и будет хорошо переноситься животными. При необходимости после опыта потерю крови можно восполнить инъекцией физиологического раствора.
Исследования макрореологических показателей с помощью микрометодов при воздействии стрессовых факторов дали следующие результаты. Под влиянием одночасового иммобилизаци-онного стресса гематокритный показатель снизился в среднем на 15% (р<0,001). Через 3 и 6 часов его уменьшение стало более заметным: соответственно 26% (р<0,02) и 24% (р<0,001). Это улучшает текучесть крови и может иметь приспособительное значение. Снижение концентрации гемоглобина через 1, 3 и 6 часов после начала эксперимента составило 15-18%. Такие изменения можно объяснить меньшими энергозатратами при ограничении подвижности. После 24-часового стресса у 60% крыс гематокритный показатель был ниже контрольной цифры в среднем на 27%, а у остальных животных он повысился. Таким же разнонаправленным было изменение концентрации гемоглобина. Это можно объяснить истощением компенсаторных механизмов. Такое представление согласуется с данными литературы о разнонаправленном содержании катехоламинов во внутренних органах и железах внутренней секреции после 24-часовой иммобилизации [13].
Плавание с грузом вызвало увеличение гема-токритного показателя в среднем на 10% по сравнению с данными, полученными до опыта, а концентрации гемоглобина - на 13% (р<0,05). Повышение соотношения гемоглобин/гематокрит может указывать на снижение деформируемости эритроцитов. Увеличение основных макрореоло-гических показателей можно расценить как адаптивную реакцию на гипоксию, которую вызывает плавание.
Ортостатический 45-минутный стресс не привёл к статистически достоверным изменениям гематокритного показателя, концентрации гемоглобина и содержания общего белка.
Выводы
1. Исследования гемореологических показателей у мелких лабораторных животных целесообразно проводить с использованием микрометодов. Количество взятой крови, составляющее не более
Вестник КГУ им. Н.А. Некрасова ♦ № 6, 2006
ЕСТЕСТВОЗНАНИЕ
Н.П. Здюмаева
0,3% от массы тела, не вызывает достоверных изменений этих показателей в следующей пробе.
2. Для однократного измерения вязкости крови, гематокритного показателя, концентрации гемоглобина, содержания общего белка микрометодами достаточным является объём крови, равный 0,4 мл.
3. При иммобилизационном стрессе через 16 часов происходит снижение основных геморе-ологических характеристик. После 24-часовой иммобилизации возникают их разнонаправленные изменения.
4. Плавание с грузом до полного утомления приводит к увеличению гематокритного показателя и концентрации гемоглобина.
5. Ортостатический 45-минутный стресс не вызывает статистически достоверных изменений макрореологических показателей крови.
Библиографический список.
1. Вальдман А.В., Козловская М.И., Медведев О. С. Фармакологическая регуляция эмоционального стресса. - М., 1979.
2. Горизонтова М.П. Микроциркуляция и сосудистая проницаемость при стрессе: Вопросы общего учения о болезни. - М., 1976.
3. Дигурова И.И., Катаев В.В. Адаптационные свойства стандартизированного экстракта ГИНКГО билоба: Методы исследования регионарного кровообращения и микроциркуляции в клинике. - СПб., 2004. - С. 25-27.
4. Ковалёв О.А., Коровин К. Ф., Радченко Е.Р., Парфёнова М.И. Особенности изменения кровообращения и адренергической активности при помещении крыс в тесную клетку и их иммобилизации на станке // Патол. физиол. - 1988. - №№1. -С. 29-32.
5. КозинецГ.И., ПогореловВ.М., Шмаров Д.А. Клетки крови. Современная технология их анализа. - М., 2002.
6. МалиновскаяМ.Н., ВологдинаН.К., Антонова Е.М. Влияние статических мышечных нагрузок различной интенсивности на ряд показателей свёртывания крови // Реактивность организма при мышечной деятельности и её возрастные особенности. - Ярославль, 1980. - С. 34-37.
7. Меерсон Ф.З., Миняйленко Т.Д., Пожаров В.П., Середенко М.М. Нарушение внешнего дыхания, транспорта и утилизации кислорода при стрессе // Патол. физиол. и экспер. терапия. -1989. - №№6. - С. 20-26.
8. Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использование лабораторных животных // Хроника ВОЗ. - 1985. - №>3. - С. 3-9.
9. Пшенникова М.Г. Феномен стресса. Эмоциональный стресс и его роль в патологии // Патол. физиол. и экспер. терапия. - 2001. - №°1. - С. 23-26.
10. Сейдахметова З.Ж., Ташенова Г.К. Влияние иммобилизационного стресса на реактивность симпато-адреналовой системы и резистентность эритроцитов у крыс в периоды маммо- и лактоге-неза // Бюлл. СО РАМН. - 2005. - №№4. - С. 93-95.
11. Фёдоров Б.М. Стресс и система кровообращения. - М., 1991.
12. Фёдоров В.Н. Фармакодинамика адапто-генов: экспериментальное и клиническое исследование: Дис. ... д-ра наук. - Л., 1999.
13. Фурдуй Ф.И. Физиологические механизмы стресса и адаптации при остром действии стресс-факторов. - Кишинёв, 1986.
14. Mezzacappa E. S. Breastfeeding and maternal stress response and health // Nutr. Rev. - 2004. -№2. - Р. 261-268.
8
Вестник КГУ им. Н.А. Некрасова ♦ № 6, 2006
