CC BY
94
УДК 612.1:616.45-001.1/3.001.6 И.И. Дигурова, А.Г. Гущин, Ю.В. Карева
ИССЛЕДОВАНИЯ ЭЛЕКТРО-РЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КРОВИ ПРИ ИММОБИЛИЗАЦИОННОМ СТРЕССЕ У КРЫС
Авторами статьи на моделях иммобилизации разной продолжительности у крыс исследованы электро-реологические свойства крови. Полученные данные свидетельствуют об адаптационных изменениях, проявляющихся в оптимизации агрегации и деформируемости на ранних этапах. Ограничение подвижности в течение 24 часов приводит к нарушению электрической стабильности крови. Разнонаправленность изменений гемореологических показателей в этом периоде можно расценить как истощение компенсаторных механизмов.
Стрессорные воздействия приводят к серьезным последствиям для организма, способствуя развитию ряда заболеваний. Одним из видов стресса является вынужденное ограничение подвижности. Иммобилизация может иметь место при чрезвычайных ситуациях природного и техногенного характера. Нахождение в условиях ограниченной подвижности сопутствует проведению экспериментов на животных, сопровождает их содержание в клетках и возникает во время стойлового периода. Таким образом, эта проблема существует в животноводстве и звероводстве, и имеет общебиологическое и хозяйственное значение. На действие экстремальных факторов активно реагирует система крови. Среди последствий гипокинезии и гиподинамии ведущее место занимает резкое увеличение заболеваний сердечно-сосудистой системы [6]. Изучение происходящих гемореологических и микроциркуляторных нарушений возможно путем создания моделей различных стрессов на животных, в частности, на крысах. Ограничение подвижности вызывает у них выраженную стресс-реакцию, причем изменения, характерные для стресса, преобладают над нарушениями, связанными со снижением двигательной активности [15]. Состояние организма можно оценить с помощью макро- и мик-рореологических показателей крови. В разные периоды иммобилизации (1, 3 и 24 часа) имеет место прогрессивное усиление оседания эритроцитов, изменение микроциркуляции, связанное с повышенной активностью катехоламинов [4; 12]. Иммобилизация крыс на спине в течение 10 минут приводит к увеличению гематокритного показателя и содержания гемоглобина [8]. Через 30 минут, 1 и 3 часа ограничение подвижности вызывает повышение концентрации адреналина и норадреналина в плазме крови [1; 13-14], что свидетельствует о возбуждении симпато-адреналовой системы. После 24-часовой иммобилизации ее активность снижается. На это указывает увеличение массы надпочечников, падение в крови уровней адреналина и дофамина, а также концентрации 11-оксикортикостероидов [5; 16]. Критерием функционального состояния крови являются и ее пассивные электрические параметры, тесно связанные с объемной концентрацией эритроцитов, с состоянием их мембран и белковым составом плазмы [18-20].
При вынужденном ограничении подвижности реологические и электрические показатели крови недостаточно изучены. В связи с вышеизложенным, целью работы явилось исследование макро- и микрореологи-ческих показателей, а также электрических характеристик крови при иммобилизационном стрессе у крыс.
Материалы и методы исследований. Эксперимент проведен на 106 белых беспородных крысах-самцах массой 180-240 г. Разброс по массе в каждой группе не превышал 10%. С животными работали в соответствии с Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных [10].
Стресс вызывали помещением неадаптированных и ненаркотизированных крыс в тесные клетки-футляры цилиндрической формы объемом 0,5-0,6 * 10-3 м-3, что не создавало жесткой иммобилизации, но ограничивало естественную свободу движения. Распределение животных по группам для изучения макро- и микрореологических показателей показано в табл. 1.
Таблица 1
Распределение животных (п=80) по группам для изучения гемореологических показателей в зависимости от срока иммобилизации
Условия эксперимента Интактная группа Срок иммобилизации, ч
1 3 6 24
Количество животных 16 17 11 18 18
Для гемореологических исследований использовали микрометоды, позволяющие не умерщвлять крыс и изучать показатели в динамике у одних и тех же животных. Забор крови производили из хвостовой вены до опыта и после его окончания. В качестве антикоагулянта использовали гепарин в микродозах.
Предварительно была сделана количественная оценка влияния различных объемов первоначально взятой крови на результаты дальнейших исследований. Для этого кровь у интактных крыс брали дважды с интервалом 45 минут. В первой группе интактных животных (п =6) начальная проба составляла примерно 8% от объема циркулирующей крови и около 0,5% от массы тела. Во второй группе животных (п = 10) объем первой пробы составил не более 4-5% от объема циркулирующей крови, а масса была примерно равна
0,3% массы тела. Расчеты сделаны с условием, что масса циркулирующей крови составляет примерно 6,57,5% от массы тела крысы, а плотность крови равна 1050-1075 кг/м3 [7].
Таким образом, у крыс массой 200 г объем первоначально взятой крови был равен 1 мл в первой группе, а во второй - 0,6 мл.
Для изучения электрических характеристик были сформированы две группы крыс: интактные (п=11) и подвергнутые 24-часовой иммобилизации на спине (п=15). Кровь для этих исследований брали путем дека-питации под эфирным наркозом. Стабилизация крови осуществлялась 5% раствором этилендиаминтетра-ацетата (1 мл на 4 мл крови).
Объемная концентрация была определена путем центрифугирования образцов крови в микрокапиллярах при 3000 об/мин в течение 30 минут, а концентрация гемоглобина - гемиглобинцианидным методом на спектрофотометре СФ-46. Индекс деформируемости эритроцитов (ИДЭ) рассчитывали по скорости фильтрации их суспензии в физиологическом растворе с гематокритным показателем, равным 2%, через фильтры с диаметром пор 2-4,5 мкм. Индекс агрегации эритроцитов (ИА) определяли по отношению числа агрегатов к числу неагрегированных клеток при исследовании в камере Горяева. Электрические показатели крови и плазмы (электроемкость, электросопротивление, электропроводимость) изучали с помощью измерителя RLC Е7-8 в кювете объемом 0,9*10-6 м-3 с плоскопараллельными электродами на частоте 1 МГц. Погрешность прибора составляет 1%. Содержание общего белка определено рефрактометрическим методом. Статистическая обработка данных проводилась с помощью компьютерных программ.
Результаты и обсуждение. Исследование влияния первоначально взятого объема крови на реологические показания во второй пробе дало следующие результаты. Через 45 минут во второй пробе крови у животных первой интактной группы отмечено уменьшение гематокритного показателя и концентрации гемоглобина по сравнению с контрольными цифрами (1-я проба). Эти данные представлены в табл. 2.
Таблица 2
Макрореологические показатели у животных первой интактной группы
Показатель 1-я проба 2-я проба
Гемоглобин, г/л 153,3 ± 23,9 132,7 ± 24,5
Гематокритный показатель, % 47,6 ± 2,1 43,2 ± 2,3*
* - р < 0,05.
Такие изменения, вероятно, связаны с тем, что исходная кровопотеря являлась значительной для организма крысы.
При исследовании крови у второй группы животных было обнаружено, что гематокритный показатель и концентрация гемоглобина через 45 минут не отличались достоверно от исходного уровня. Эти результаты представлены в табл. 3.
Таблица 3
Макрореологические показатели у животных второй интактной группы
Показатель 1-я проба 2-я проба
Гемоглобин, г/л 113,9 ± 16,0 114,8 ± 12,7
Гематокритный показатель, % 40,0 ±3,5 39,6 ± 3,9
Полученные данные свидетельствовали, что первоначальное взятие крови у крыс этой группы не оказывало серьезного воздействия на значение макрореологических показателей в следующей пробе.
Таким образом, исходная кровопотеря в объеме 0,6 мл не являлась существенной для крыс массой 200 г и более. Этого количества крови достаточно для изучения гематокритного показателя, концентрации гемоглобина и микрореологических показателей (деформируемости методом фильтрации суспензии эритроцитов в физиологическом растворе с гематокритным показателем, равным 2%, и агрегации микроскопирова-нием в камере Горяева). Поскольку количество взятой крови является небольшим, то плазму для определения содержания общего белка можно брать из гематокритных микрокапилляров. После измерения объемной концентрации эритроцитов капилляр следует разломить по границе плазмы и эритроцитарной массы, и плазму осторожно выдуть на призму рефрактометра.
При анализе разных воздействий на организм измерения проводят до и после опыта. Вторая проба может быть любого объема, достаточного для исследования, но не причиняющая вреда животному. Если количество взятой крови у крысы в обеих пробах одинаково, то общая кровопотеря составит не более 0,6% от массы тела и около 10% от объема циркулирующей крови, и будет хорошо переноситься животными. При необходимости потерю крови можно восполнить инъекцией физиологического раствора. Для крыс другой массы сделать расчеты максимально допустимого объема первой пробы не представляет сложности.
Под влиянием иммобилизационного стресса разной продолжительности наблюдалось изменение ге-мореологических показателей крови. Эти результаты представлены в табл. 4.
Таблица 4
Макро- и микрореологические показатели крови при 1-, 3-, и 6-часовом иммобилизационном стрессе
Показатель Срок иммобилизации, ч
3 6
Контроль Стресс Контроль Стресс Контроль Стресс
Гематокритный 41,4± 34,0± 39,3± 29,0± 40,3± 30,6±
показатель, % 4,22 4,72 5,03 2,99**** 3,87 6,49****
ИА, отн. ед. 0,163± 0,273± 0,205± 0,344± 0,317± 0,207±
0,025 0,039* 0,023 0,067* 0,030 0,030****
ИДЭ, отн. ед. 0,157± 0,244± 0,299± 0,187± 0,184± 0,400±
0,035 0,025*** 0,047 0,039**** 0,047 0,060**
* - р < 0,001; ** - р < 0,01; *** - р < 0,02; **** - р < 0,05 по сравнению с контролем.
Ограничение подвижности в течение 1, 3, и 6 часов приводило к уменьшению гематокритного показателя в среднем на 15-26%, а концентрации гемоглобина - на 15-23% по сравнению с исходными цифрами. Снижение этих показателей приводит к улучшению текучести крови, следовательно, такие изменения можно рассматривать как приспособительные реакции.
Возрастание индекса агрегации на данных этапах иммобилизации отмечено у тех животных, у которых исходное его значение не превышало 0,3 отн.ед. Через 1 и 3 часа после начала эксперимента увеличение составило 68%, а через 6 часов - 35%. Если же до опыта индекс агрегации был выше 0,3, то после иммобилизации наблюдалось его снижение. На этих же этапах изменялась деформируемость эритроцитов. Так, после одночасового ограничения подвижности у большинства животных увеличение индекса деформируемости составляло в среднем 55%. Исходные цифры при этом были невысокие (среднее значение 0,16). Если контрольное значение было выше (в среднем 0,35), то индекс деформируемости снижался. Через 3 и 6 часов после начала иммобилизации в отношении этого показателя отмечена такая же закономерность. Таким образом, на начальных этапах иммобилизационного стресса (1, 3, 6 часов) идет оптимизация агрегации и деформируемости эритроцитов.
При увеличении продолжительности стресса до 24 часов отмечалась разнонаправленность изменений изучаемых показателей. Объемная концентрация эритроцитов у большинства животных (60%) снизилась в среднем на 27% по сравнению с исходным уровнем. Увеличение индекса агрегации составило в среднем 28%. Возрастание этого показателя выявлено и в том случае, если контрольное его значение было выше, чем 0,3. Индекс деформируемости увеличился на 102%. Это свидетельствует об истощении гормонального звена симпато-адреналовой системы, так как активация катехоламинов снижает деформабель-ность [4]. Эти данные представлены в табл. 5.
Таблица 5
Гемореологические показатели после 24-часового иммобилизационного стресса
Показатель Контроль Стресс
ИА, отн.ед. 0,308 ± 0,050 0,394 ± 0,074 **
ИДЭ, отн.ед. 0,079 ± 0,015 0,160 ± 0,022 *
Гематокритный показатель, % 44,8 ± 1,3 33.0 ± 2,4 **
* р < 0,05; ** р < 0,01 по сравнению с контролем.
У остальных животных микрореологические показатели на этом этапе иммобилизации были ниже исходных значений. Отсутствие корреляционной связи между индексами деформируемости и агрегации может указывать на то, что изменения этих показателей происходят при участии различных механизмов, что согласуется с литературными данными [2].
Полученные результаты соответствуют представлениям о разнонаправленном содержании катехоламинов во внутренних органах и железах внутренней секреции после 24-часовой иммобилизации [17] и о том, что индивидуальная устойчивость к стрессу имеет связь с генетически обусловленными особенностями обмена катехоламинов [11].
Таким образом, увеличение продолжительности иммобилизации до 24 часов приводило, по-видимому, к снижению компенсаторных возможностей.
Результаты исследований электрических характеристик крови после 24-часового иммобилизационного стресса представлены в табл. 6.
Таблица 6
Электрические показатели крови при 24-часовом иммобилизационном стрессе
Показатель Интактные После стресса
Электропроводимость, 10-3см 9,24 ± 0,29 8,78 ± 0,42
Электросопротивление, Ом 98,96 ± 2,60 108,54 ± 5,54 *
Электроемкость, 10-6 Ф 0,415 ± 0,028 0,319 ± 0,031 **
* - р< 0,01; **-р < 0,02.
Полученные данные свидетельствуют о нарушении электрической стабильности крови. Так, электропроводимость ее снижалась в среднем на 9,5%, электроемкость - на 26%, а электросопротивление увеличилось на 10% по сравнению с результатами, полученными в группе интактных животных. Возрастание электросопротивления согласуется с повышением индекса агрегации, что соответствует представлениям о влиянии электрического состояния среды на процесс агрегации форменных элементов [3]. Не слишком значительное увеличение электросопротивления можно объяснить снижением гематокритного показателя и увеличением индекса деформируемости эритроцитов. После 24-часовой иммобилизации отмечено также уменьшение электроемкости плазмы на 15% (р<0,02) по сравнению с данными, полученными в группе животных, не подвергшихся стрессу. Снижение электроемкости крови и плазмы согласуется с отмеченным в этом периоде уменьшением содержания общего белка в среднем на 20 % (р<0,05). Это соответствует представлениям о связи электроемкости как с состоянием клеточных мембран, так и с диэлектрической проницаемостью плазмы.
Таким образом, при развитии иммобилизационного стресса наблюдается снижение гематокритного показателя, концентрации гемоглобина и содержания общего белка. Изменения микрореологических показателей (агрегации и деформируемости эритроцитов) при 1-,3- и 6-часовом ограничении подвижности проявляются в их оптимизации и имеют приспособительное значение. При увеличении продолжительности иммо-
билизации до 24 часов начинается истощение компенсаторных механизмов, на что указывает разнонаправ-ленность изменений гемореологических показателей. Ограничение подвижности в течение 24 часов приводит к нарушению электрической стабильности крови (повышению электросопротивления и снижению электроемкости крови и плазмы).
Применяемые в работе методы, апробированные на животных, открывают перспективу изучения возникающих в организме изменений в ответ на иммобилизацию. Использование данных методов позволяет выявить негативные или позитивные гемореологические сдвиги.
Литература
1. Братко, А.А. Действие производных (хинальдин-4-интио) карбоновых кислот на содержание катехоламинов при стрессе / А.А. Братко // Вестн. Запорожского госуниверситета. - 2002. - №2.
2. Липиды плазмы крови и реологические свойства эритроцитов у больных со стабильной стенокардией / И.Е. Ганелина, А.Д. Денисенко, Л.Н. Катюхин [и др.] // Кардиология. - 2000. - № 8. - С. 62-63.
3. Ганузин, В.М. Концепция развития патогенетических механизмов при пневмонии у детей с позиций нарушения электрического гомеостаза: Актуальные проблемы педиатрии / В.М. Ганузин, Т.Ю. Широкова. -Ярославль, 1998. - С. 121-126.
4. Горизонтова, М.П. Микроциркуляция при стрессе / М.П. Горизонтова // Патол. физиол. и экспер. терапия. - 1986. - Вып. 3. - С. 79-85.
5. Дигурова, И.И. Адаптационные свойства стандартизированного экстракта ГИНКГО билоба: методы исследования регионарного кровообращения и микроциркуляции в клинике / И.И. Дигурова, В.В. Катаев. -СПб., 2004. - С. 25-27.
6. Коваленко, Е.А. Гипокинезия / Е.А. Коваленко, Н.Н. Гуровский. - М.: Медицина, 1980. - С. 9-13.
7. Клетки крови / Г.И. Козинец, В.М. Погорелов, Д.А. Шмаров [и др.] // Современные технологии и их анализ. - М., 2002. - 200 с.
8. Крайнов, К.Е. Влияние иммобилизационного стресса на показатели красной крови белых крыс на фоне предварительного введения лектина Р. ро1утуха / К.Е. Крайнов, Л.В. Карпунина, М.Д. Сметанина // Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии. - Новосибирск, 2002.
9. Нарушение внешнего дыхания, транспорта и утилизации кислорода при стрессе / Ф.З. Меерсон, Т.Д. Миняйленко, В.П. Пожаров [и др.] // Патол. физиол. и экспер. терапия. - 1989. - № 6. - С. 20-26.
10. Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных // Хроника ВОЗ. - 1985. - № 3. - С. 3-9.
11. Мезенцева, Л.Н. Роль индивидуальных особенностей биогенных аминов в устойчивости к развитию патологических последствий стресса: автореф. дис. ... канд. биол. наук / Л.Н. Мезенцева. - М., 1982.
12. Соотношение содержания катехоламинов и простагладинов в крови у крыс при остром стрессорном воздействии и адаптации к стрессу / М.Г. Пшенникова, Б.А. Кузнецова, М.В. Шимкович [и др.] // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1990. - Т. 109. - № 6. - С. 534-535.
13. Пшенникова, М.Г. Феномен стресса. Эмоциональный стресс и его роль в патологии / М.Г. Пшенникова // Патол. физиол. и экспер. терапия. - 2001. - №1. - С. 23-26.
14. Сейдахметова, З.Ж. Влияние иммобилизационного стресса на реактивность симпато-адреналовой системы и резистентность эритроцитов у крыс в периоды маммо- и лактогенеза / З.Ж. Сейдахметова, Г.К. Ташенова // Бюлл. СО РАМН (118). - 2005. - № 3-4. - С. 93-95.
15. Федоров, Б.М. Стресс и система кровообращения / Б.М. Федоров. - М.: Медицина, 1991. - 320 с.
16. Федоров, В.Н. Фармакодинамика адаптогенов: экспериментальное и клиническое исследование: автореф. дис. ... д-ра мед. наук / В.Н. Федоров. - М., 1999.
17. Фурдуй, Ф.И. Физиологические механизмы стресса и адаптации при остром действии стресс-факторов / Ф.И. Фурдуй. - Кишинев, 1986.
18. An electronic method for rapid measurement of haematocrite in blood samples / K. Cha, R.G. Farís, E.F. Brown, D.W. Wilmore//Physiol Means - 1994. - Vol. 15 (2). - Р. 129-37.
19. Zhao, T.X. Electrical impedance alterations of red blood cells during storage / T.X. Zhao, А. Shanwell. // Vox Sang. - 1994. - Vol. 66 (4). - Р. 258-63.
20. Zhao, T.X. Quantitative correlations among fibrinogen concentration, sedimentation rate and electrical impedance of blood. / T.X. Zhao, В. Jacobson // Med. Biol End Comput. - 1997. - Vol. 35 (3). - Р. 181-5.
