CC BY
100
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2014 БИОЛОГИЯ Вып. 1
УДК 57.088.1
ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ИММУНОСОРБЕНТОВ НЕИНСТРУМЕНТАЛЬНЫХ ДОТ-ИММУНОАНАЛИТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ АНТИГЕНОВ TREPONEMA PALLIDUM
П. В. Храмцов, М. С. Бочкова, М. Б. Раев
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13; khramtsovpavel@yandex.ru; (342)2807794
Определены оптимальные условия синтеза иммуносорбентов, на основе антигена р17 T. pallidum и процедурные параметры их взаимодействия с исследуемым образцом и углеродным диагностикумом: сенсибилизирующие концентрации антигена составили 0.01 мг/мл для полистирола и 0.05 мг/мл - для нитроцеллюлозы при последовательной инкубации с исследуемой пробой и диагностикумом в течение 30 и 60 мин. соответственно. Показана эффективная сохранность свойств иммуносорбентов в течение года при условии их технологической стабилизации.
Ключевые слова: неинструментальные тест-системы; углеродный диагностикум; T. pallidum.
Введение
В течение последних лет в Пермском крае заболеваемость сифилисом стабильно превышает среднероссийский уровень в два раза [О санитарно-эпидемиологической ..., 2012]. Несомненно, большую роль в снижении числа заболевших и усилении эффективности профилактических мер играют скрининговые методы диагностики, позволяющие выявлять сифилис на ранних стадиях, а также определять случаи скрытого, бессимптомного течения болезни. Использование совершенных скрининговых тестов позволяет оперативно применять терапевтические меры и предотвращать распространение заболевания путем своевременного ограничения контактов больного с окружающими людьми. Подобные методы, предназначенные для массового повсеместного тестирования, должны обладать надлежащими аналитическими свойствами (специфичность, чувствительность, воспроизводимость), быть простыми, оперативными и недорогими.
В РФ для скрининга используются серологические тесты, адаптированные для постановки как в качественном, так и полуколичественном варианте. Обязательному серологическому обследованию подлежат пациенты стационаров, лица, в течение года впервые посещающие амбулатории, декретированные группы населения [Об утверждении ..., 2003]. Основным методом скрининговых серологических исследований является реакция микро-
преципитации с кардиолипиновым антигеном (РМП) и ее модификации: TRUST, VDLR и др. Преимуществами РМП являются: простота, оперативность, высокая специфичность. Чувствительность метода является недостаточно высокой -90% на всех стадиях прогрессирования заболевания [Об утверждении ..., 2003; Реакция ..., 2008]. Это означает, что 10% результатов являются потенциально ложноотрицательными. Кроме того, РМП эффективна лишь спустя 6-7 недель с момента заражения, т.е. в тот период, когда проявляются клинические признаки первичного сифилиса [Родионов, 2007].
Среди других методов, потенциально удобных для использования в качестве скрининговых стоит выделить реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА): она обладает достаточно высокой специфичностью, положительные реакции могут выявляться еще в течение инкубационного периода. Однако чувствительность РНГА на стадии первичного сифилиса недостаточно велика - 76%, что категорически не приемлемо с позиций эффективности мер борьбы с распространением заболевания [Об утверждении ..., 2003; Реакция ..., 2008].
Инструментальные методы диагностики сифилиса: иммуноферментный анализ (ИФА), реакция иммунофлуоресценции (РИФ), несмотря на высокие показатели чувствительности и специфичности, не могут выступать в качестве скрининговых, поскольку требуют применения дорогостоящего и сложного
© Храмцов П. В., Бочкова М. С., Раев М. Б., 2014
оборудования, а также наличия специалистов с соответствующей высокой квалификацией [Родионов, 2007].
Таким образом, в современной клинико-диагностической практике отсутствует метод, пригодный для осуществления массовых диагностических мероприятий, сочетающий в себе процедурную простоту и оперативность с надлежащими аналитическими свойствами, сравнимыми с показателями ИФА и РИФ.
В сложившихся условиях перспективной является разработка скрининговой аналитической системы на основе углеродного диагностикума, представляющего собой суспензию наноразмерных частиц углерода, конъюгированных с аффинным соединением посредством системы ковалентных связей. Подобные системы, ранее разработанные в нашей лаборатории, обладают простотой, оперативностью, специфичностью, достаточными для использования в качестве скрининговых тестов [Раев, 2012]. В частности были сконструированы твердофазные дот-иммуноаналитические системы определения антител к столбнячному анатоксину, токсину возбудителя псевдотуберкулеза, ВИЧ [Раев, Амбросов, Брико, 1997; Разработка ..., 2001]. Чувствительность их превосходит традиционные неинструментальные аналоги (РНГА, РА, РСК, реакции иммунодиффузии). Таким образом, аналитические системы на основе углеродных диагностикумов являются перспективными для создания высокочувствительных неинструментальных скрининговых тест-систем для диагностики сифилиса.
Конструирование твердофазных тест-систем требует оптимизации процедуры постановки анализа, подбора экономичной и удобной для практического применения форматной аранжировки. Фундаментом такой работы являются знания о кинетике взаимодействия отдельных компонентов системы анализа, определение их наилучших концентрационных соотношений, зависимости этих параметров от материала твердой фазы, природы антигена и т.д.
Основой создания твердофазных аналитических систем является конструирование иммуносорбента - сенсибилизированной антигеном твердой фазы, готовой для проведения анализа. Особенности синтеза и структура твердофазного реагента являются одним из критических параметров, определяющих эффективность диагностической системы: ее чувствительность, наличие неспецифических реакций, воспроизводимость результатов анализа. Условия сорбции и оптимальные сенсибилизирующие концентрации антигена находятся в зависимости от его природы и от материала подложки.
Материалы твердой фазы обладают отличающимися механическими свойствами, сорбционной емкостью, величиной удельной поверхности, требуют применения различных буферных растворов для сенсибилизации; варьируют их устойчивость к из-
менениям условий окружающей среды, влияющих на структуру поверхности твердой фазы, и доступность сорбированного антигена для молекул соответствующей специфичности. По-разному проявляется активность контаминирующей микрофлоры, приводящая к деградации антигена. Таким образом, структура и технология получения иммуносорбента существенным образом определяют условия и длительность хранения тест-системы.
Целью работы являлось определение оптимальных параметров синтеза и хранения иммуносорбентов, сконструированных на основе антигена р17 T. pallidum.
Материалы и методы
Материалы
Для тестирования использовали антиген бледной трепонемы р17 производства ЗАО БТК «Биосервис» (Россия), стандартную референсную панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела к Treponema pallidum ЗАО «Медико-биологический союз» (Россия), материалы твердой фазы: полисти-рольные плоскодонные планшеты «Linbro» (США) и нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,45 мкм «Bio-Rad» (США), бычий сывороточный альбумин (БСА) «Sigma» (США), Sepharose CL-6B «Pharmacia Fine Chemicals» (Швеция), углеродный диагностикум с G белком был изготовлен по оригинальной методике [Плаксин, Раев, Громаковская, 1997] (приведена в разделе Методы).
Буферные растворы: 0.15М раствор NaCl, забу-ференный 0.015М Na-фосфатами, рН 7.25 (ЗФР); ЗФР, содержащий 0.05% Твина-20 (ЗФРТ), 0,02 М карбонат-бикарбонатный буфер, pH 9,6 (КББ).
Методы
Для проведения экспериментов по тестированию сконструированных иммуносорбентов синтезировали диагностический реагент - конъюгат на-норазмерных частиц углерода с G белком стрептококка. Частицы углерода выполняют функцию цветной метки, G белок определяет специфическое взаимодействие частиц конъюгата с Fc фрагментами IgG высших млекопитающих. В ходе синтеза использовали глутаровый альдегид для ковалентного связывания между собой сорбированных на поверхности углеродных частиц молекул БСА на первом этапе синтеза и добавляемых на втором этапе молекул G белка. Описанная система ковалентных связей обусловливает прочность получаемой конструкции и, как следствие, стабильность частиц конъюгата. Условная схема функционали-зированной частицы конъюгата представлена на рис. 1.
Получение углеродного конъюгата с G белком проводили, суспендируя 1 г аморфного углерода в
19 мл 2%-ного БСА в ЗФР в течение суток при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Концентрация углерода в пересчёте на сухой вес составила 5%. Полученную суспензию подвергали ультразвуковой дезинтеграции при частоте 22 кГц. Общее время озвучивания составило 1 ч. С целью удаления оставшихся крупных частиц озвученную суспензию центрифугировали 5 мин. при 3000 об/мин.
Рис. 1. Условная схема функционализированной углеродной частицы:
1 - углеродная частица, 2 - БСА, 3 - глутаровый альдегид, 4 - белок G
Супернатант инкубировали в течение 40 мин. при комнатной температуре с равным объемом 25%-ного раствора глутарового альдегида. После чего смесь центрифугировали 5 мин. при 3000 об/мин и проводили хроматографию на колонке с Sepharose ^-6В для удаления несвязавшегося БСА и глутарового альдегида. Вышедшие в холостом объёме фракции объединяли и концентрировали до исходного объема углеродной суспензии в ультрафильтрационной ячейке.
Полученный активированный глутаровым альдегидом суспензоид объемом 4,5 мл инкубировали с 0,5 мл белка G с концентрацией 10 мг/мл в течение 100 мин. при мягком перемешивании. Полученную суспензию центрифугировали 5 мин. при 3000 об/мин. Несвязавшийся белок G удаляли гель-хроматографией на колонке с Sepharose ^-6В. Фракции, вышедшие в холостом объёме и содержащие конъюгат, объединяли, добавляли БСА и глицерин до конечной концентрации 1% и 20% соответственно.
Тестирование иммуносорбентов осуществляли в модельных аналитических системах, предназначенных для полуколичественного определения антител в референсных антитрепонемных сыворотках при помощи углеродного диагностикума. Ниже описаны принципиальные схемы проведения анализа для различных материалов твердых фаз.
На дно лунок полистирольных планшетов дотами из капель сорбировали антиген T. pallidum в КББ, планшеты выдерживали 30 мин. во влажной камере, капли удаляли при помощи водоструйного насоса. Сенсибилизированные планшеты последовательно инкубировали с исследуемой пробой и диагностикумом при мягком перемешивании. После завершения каждого этапа инкубации планшеты трехкратно промывали ЗФРТ. Результаты оценивали визуально по наличию или отсутствию окрашивания в зоне сорбции антигена. Титр сыворотки определяли по последней достоверно отличной от фона окрашенной точке в ряду серийных разведений.
Для проведения анализа на нитроцеллюлозной мембране из нее изготавливали диски диаметром 5 мм. Диски сенсибилизировали, нанося на них 5 мкл раствора антигена в ЗФР, высушивали, промывали ЗФРТ и инкубировали с исследуемым образцом. После этого диски трехкратно промывали ЗФРТ и инкубировали в растворе конъюгата углеродных частиц с G белком. Результаты анализа оценивали так же, как и при постановке анализа в полистирольном планшете.
Исследование стабильности
иммуносорбентов при хранении
Для оценки сохранения свойств иммуносорбентов при хранении их обрабатывали согласно оригинальной методике: инкубировали в течение 1 ч. в 30%-ном растворе сахарозы и высушивали. Стабилизированные таким образом твердофазные реагенты хранили в течение 12 месяцев при комнатной температуре. По окончании срока их промывали в течение 60 мин. в ЗФРТ и тестировали параллельно с свежесинтезированными, результаты сравнивали между собой. Стабильность иммуносорбентов при хранении оценивали по наличию/отсутствию различий в показателях чувствительности и специфичности. Для исследований использовали оптимизированные в ходе предварительных испытаний схему синтеза иммуносорбента и процедуру анализа [Раев, 2008].
Результаты
Исследование свойств иммуносорбентов
на основе нитроцеллюлозы
Исследование функциональных свойств сенсибилизированной антигеном р17 нитроцеллюлозной мембраны производили в двух вариантах: последовательной и одновременной инкубации пробы в смеси с диагностикумом. При последовательном варианте после внесения пробы диски промывали ЗФРТ и затем добавляли конъюгат, разведенный ЗФРТ до рабочего титра. В альтернативном варианте диски инкубировали с 70 мкл смеси пробы и
диагностикума. При этом конъюгат доводили до рабочего титра раствором исследуемого образца.
Помимо схемы внесения пробы варьировали длительность инкубации иммуносорбента с образцом/смесью образца с конъюгатом: 15, 30, 60 мин. Также сравнивали иммуносорбенты, полученные при различных сенсибилизирующих концентрациях антигена: 0.1, 0.05, 0.01 мг/мл.
В качестве исследуемой пробы использовали положительную референсную иммунную сыворотку. Отрицательным контролем служила отрицательная референсная сыворотка и ЗФРТ.
Тестирование иммуносорбентов на основе нитроцеллюлозы в варианте последовательного внесе-
0.1 мг/мл 15 мин
1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400
ООО • • • • •
1/100 30 мин ЗФРТ
1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400
ООО • о О • в
1/100 60 мин ЗФРТ
1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400
ООО# • • N В
ния пробы и конъюгата показало, что наивысшая чувствительность системы анализа достигается при сенсибилизации твердой фазы антигеном р17 в концентрациях 0.1 и 0.05 мг/мл и при длительности инкубации ее с сывороткой более получаса. Титр тестируемой сыворотки в этих случаях был равен 1/3200. При меньшей длительности инкубации наблюдалось снижение чувствительности системы (рис. 2). Уменьшение концентрации сенсибилизирующего антигена до 0.01 мг/мл также негативно влияло на чувствительность системы анализа, титр положительной сыворотки в этом случае был менее 1/800.
0.05 мг/мл 15 мин
1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400
О О О ф • • «
1/100 1/200 1/400
30 мин
1/800 1/1600 1/3200 1/6400
1/100 1/200 1/400
60 мин
1/800 1/1600 1/3200 1/6400
Рис. 2. Тестирование нитроцеллюлозных иммуносорбентов, различающихся по концентрации сорбированного антигена: 0.1 и 0.05 мг/мл в варианте последовательной инкубации:
«+» - ряд дисков, инкубированных с положительной референсной сывороткой, выше указаны ее разведения; «-» - диск, инкубированный с отрицательной референсной сывороткой в разведении 1/100; ЗФРТ - диск, инкубированный с ЗФРТ, время указывает длительность инкубации дисков с сывороткой. Стрелкой обозначена последняя визуализируемая точка в ряду серийных разведений
Специфичность аналитической системы при тестировании нитроцеллюлозных иммуносорбентов в варианте последовательного внесения пробы и диагностикума оставалась одинаково высокой независимо от концентрации сорбируемого антигена и длительности инкубации с исследуемым образцом. Появления аналитического сигнала не было отмечено ни при использовании в качестве пробы контрольной отрицательной сыворотки, ни ЗФРТ.
При тестировании нитроцеллюлозных иммуносорбентов в варианте одновременного внесения исследуемой пробы и диагностикума чувствительность аналитической системы была значительно ниже, чем при последовательной инкубации (менее 1/200), независимо от концентрации антигена. Ложноположительных реакций выявлено не было.
Исследование свойств иммуносорбентов на основе полистирола
Тестирование сенсибилизированных антигеном р17 T. pallidum производили по схеме последовательного и одновременного внесения пробы и диагностикума. На дно каждой лунки полистирольно-го планшета сорбировали антиген в концентрациях 0.1, 0.05, 0.01 мг/мл, в каждую лунку вносили образец в одном из разведений. Инкубацию иммуносорбента с пробой производили в течение 15, 30 и 60 мин. Анализу подвергали положительную и отрицательную сыворотки из референс-панели.
При последовательном внесении объем пробы и конъюгата составлял 300 мкл, объём смеси при одновременном внесении диагностикума с образцом также был равен 300 мкл.
Чувствительность аналитической системы при варианте последовательного внесения образца и диагностикума составила 1/400 при 15 мин. инкубации, 1/800 при 30 мин. инкубации, 1/1600 при 60 мин. инкубации и была одинаковой для всех концентраций антигена. Специфичность системы ана-
лиза была высокой, ложнопозитивных результатов при тестировании отрицательной контрольной сыворотки и ЗФРТ выявлено не было. Оптимальной для сенсибилизации поверхности полистирола была признана концентрация антигена 0.01 мг/мл (рис. 3).
1/100
1/200
1/400
1/800
1/1600
1/3200
1/100
1/200
1/400
1/800
1/1600
ЗФРТ
р17 0.1 мг/мл
р17 0.05 мг/мл
р17 0.01 мг/мл
Рис. 3. Тестирование полистирольного иммуносорбента в варианте последовательной инкубации с сывороткой 60 мин. и конъюгатом 15 мин.:
«+» - ряд лунок, в которые вносили положительную референсную сыворотку, выше указаны ее разведения, «-» - ряд лунок, в которые вносили отрицательную референсную сыворотку, ниже указаны ее разведения 1/100, ЗФРТ - лунка, в которую вносили ЗФРТ. Черным кругом обведена лунка, в которой находятся последние визуализируемые точки в ряду серийных разведений сыворотки. Схема сорбции антигенов в лунке приведена ниже
При тестировании полистирольного иммуносорбента в варианте одновременного внесения пробы и конъюгата аналитический сигнал был выявлен лишь при максимальной длительности инкубации - 60 мин.; его уровень соответствовал титру положительной сыворотки 1/100. При меньшей длительности инкубации окрашивания на дне лунок планшетов не было.
Исследование стабильности нитроцеллюлозных иммуносорбентов при хранении
Длительное сохранение иммуносорбентом аналитических свойств является важным условием создания эффективных систем диагностики. Основными повреждающими факторами являются проте-азная активность контаминирующих твердую фазу микроорганизмов, а также колебания условий окружающей среды. Они вызывают структурно-конформационные изменения молекул антигена, приводящие к нарушению процесса распознавания антигенных детерминант антителами и к снижению чувствительности и специфичности систем диагностики.
Исследование стабильности сенсибилизированных антигеном р17 нитроцеллюлозных дисков производили в предварительно подобранном оптимальном режиме: концентрация антигена для сенсибилизации составила 0,05 мг/мл, анализ проводили в варианте последовательной инкубации 30 мин. с сывороткой и 15 мин. - с диагностикумом.
Иммуносорбент, обработанный 30%-ным раствором сахарозы, сохранил свои свойства при хранении в течение года при комнатной темпера-
туре. Об этом свидетельствуют идентичные по показателям чувствительности и специфичности результаты сравнительного анализа, с использованием свежесинтезированного и обработанного раствором сахарозы и хранившегося в течение 12 месяцев при +25°С иммуносорбента (рис. 4).
А
1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400
1/100 ЗФРТ
Б
1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400
О О О О О • •
• 14 •
1/100 ЗФРТ
Рис. 4. Тестирование стабильности нитроцеллюлозных иммуносорбентов, при хранении:
А - нитроцеллюлозные диски, сенсибилизированные 0.05 мг/мл антигена р17 хранились при температуре +25°С, Б - све-жесинтезированные сенсибилизированные 0.05 мг/мл антигена р17 нитроцеллюлозные диски; «+» - ряд дисков, инкубированных с положительной референсной сывороткой, выше указаны ее разведения, «-» - диск, инкубированный с отрицательной референсной сывороткой в разведении 1/100, ЗФРТ - диск, инкубированный с ЗФРТ, время указывает длительность инкубации дисков с сывороткой. Тестирование производили в варианте последовательной инкубации с сывороткой 30 мин. и 15 с конъюгатом. Стрелкой обозначена последняя визуализируемая точка в ряду серийных разведений сыворотки Проведенные исследования функциональных свойств иммуносорбентов на основе антигена Т.
pallidum р17 в системах с углеродным диагности-кумом продемонстрировали их перспективность для конструирования систем диагностики сифилиса. Модельные аналитические системы на основе исследованных твердофазных реагентов обладают высокой чувствительностью и специфичностью. Эти свойства критичны при разработке скрининговых диагностических систем, особенно учитывая главную негативную черту существующих методов массовой диагностики - недостаточную чувствительность, предполагающую высокий процент потенциально ложноотрицательных результатов. Полученные данные будут использованы при разработке системы серологической диагностики сифилиса, определении условий и принципов ее хранения и эксплуатации.
Работа выполнена при поддержке гранта 13-4-016-ПЕРМ в рамках программы поддержки ориентированных фундаментальных исследований УрО РАН.
Библиографический список
О санитарно-эпидемиологической обстановке в Пермском крае в 2011 году: гос. доклад / Управление Роспотребнадзора по Пермскому краю, ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Пермском крае». Пермь, 2012. 272 с.
Об утверждении протокола ведения больных сифилисом: приказ МЗ РФ №327 от 25 июля 2003. Плаксин Д., Раев М., Громаковская Е. Метод стерео-специфического анализа и метод получения конъюгата для стереоспецифического анализа: пат.
Рос. Федерации. № 2089912; заявл. 10.09.1997 // Бюл. «Изобретения». 1997. № 25. С. 336.
Раев М.Б. Способ защиты и стабилизации твердофазных реагентов иммуноаналитических систем: пат. Рос. Федерации. № 2327992; заявл. 27.06.2008 // Бюл. «Изобретения. Полезные модели». 2008. № 18. С.785.
Раев М.Б. Нанобиотехнологии в неинструментальной иммуноаналитике / под. ред. В.А. Демако-ва. Екатеринбург: УрО РАН, 2012. 140 с.
Раев М., Амбросов И., Брико Н. Новый метод для определения антител к Стрептококку гр. А. Streptococci and the Host. Ad. // Thea Horaud at al. Advances in Experimental medicine and biology. N. Y.; London: Plenum Press, 1997. Vol. 418. Р. 327329.
Разработка новых тест-систем для неинструментального определения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2. (Новый биотехнологический подход к диагностике) / М. Раев, Д. Плаксин, Н. Кеворков, В. Черешнев // Научно-технический потенциал Западного Урала в области конверсии военно-промышленного комплекса. Пермь, 2001. С. 333-337.
Реакция пассивной гемагглютинации в диагностике сифилиса: возможности и горизонты применения в республике Беларусь / О.В. Панкратов, В.Г. Панкратов, Ю.В. Салук, И.В. Петрикина, А.П. Карпович, И.П. Сысова // Сб. науч. тр. / Г ос. учреждение «НИИ эпидемиологии и микробиологии». Минск: Белпринт, 2008. Вып. 1. С. 272-275.
РодионовА.Н. Сифилис. СПб.: Питер, 2007. 320 с.
Поступила в редакцию 23.12.2013
Investigation of immunosorbent functional properties in non-instrumental dot-immunoanalytical test systems based on Treponema Pallidum antigens
P. V. Khramtsov, PhD student M. S. Bochkova, candidate of biology, scientist M. B. Raew, doctor of biology, senior scientist
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; khramtsovpavel@yandex.ru; (342)2807794
Optimal conditions for immunosorbent synthesis based on p17 antigen of T. pallidum have been determined, as well as procedural parameters of their interaction with test sample and carbon diagnosticum, namely sensitizing antigen concentrations amounted 0,01 mg/ml for polystyrene and 0,05 mg/ml for nitrocellulose during sequential incubation with test sample and diagnosticum for 30 and 60 min, respectively. An effective persistence of immunosorbent properties was demonstrated to retain within a year provided their technological stabilization.
Key words: non-instrumental test-system; carbon diagnosticum; T. pallidum.
Храмцов Павел Викторович, аспирант
Бочкова Мария Станиславовна, кандидат биологических наук, научный сотрудник Раев Михаил Борисович, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук
