CC BY
56
О КОЛЕСНИЧЕНКО Л.С., СОТНИКОВА Г.В. -УДК 577.17:612.53:616.831-005.4.
ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ЭФФЕКТОВ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ ГЛУТАТИОНА
Л. С. Колесниченко, Г. В. Сотникова'.
(Иркутский государственный медицинский университет, ректор - акад. МТА и АН ВШ д.м.н., проф.
А.А. Майборода, бионеорганической и биоорганической химии, зав. - проф. Л.С. Колесниченко, кафедра биохимии, зав. - проф. В.И. Кулинский; 'Иркутский Государственный Университет, ректор -проф. д.х.н. А.И. Смирнов, кафедра физико-химической биологии, зав. - доц. В.П. Саловарова)
Резюме. Введение разных метаболических предшественников восстановленного глутатиона (вЭН), повышающих его концентрацию в печени или в мозге, обычно слегка снижало температуру тела и в некоторых сериях изменяло активность отдельных ферментов метаболизма глутатиона (ФМГ). В большинстве серий отсутствовали изменения толерантности к ишемии головного мозга (ИГМ), лишь большая доза диэтилового эфира СЭН (вРЕЕ) резко снижала температуру, значительно увеличивала активность ФМГ и толерантность к ИГМ и лишь немного повышала СЭН мозга. Корреляция толерантности с уровнями вЭН отсутствовала или была слабой. Очевидно, толерантность к ИГМ связана не с аккумуляцией, а со снижением содержания вэн.
вЭН выполняет ряд важнейших функций на молекулярном и клеточном уровне, но его функциональные эффекты плохо изучены [5,10,11,12]. В предыдущей работе мы показали, что выраженное снижение концентрации вЭН снижает температуру тела и увеличивает толерантность к ИГМ. а введение вРЕЕ мало или не влияет на эти показатели [3]. Задачей настоящей работы было изучение эффектов ряда метаболических предшественников вЭН с отличающимися механизмами действия: 1) Ь-2-оксо тиазо лидин-4-карбоксил а та
(ОТС), который при действии фермента у-глута-мильного цикла 5-оксопролиназы превращается в клетках в свободный цистеин, лимитирующий синтез вЭН; 2) сложных эфиров вЭН, гидролиз
которых эстеразами освобождает глутатион [4.5.8, 10]. Использовали и сам йЭН.
Материалы п методы Работа проведена на 101 беспородной мыши обоего пола массой 18-30 г. В качестве биохимических анализаторов использовали н-пропиловый (йРЕ), изопропиловый (йіРЕ), н-бутиловый (йВЕ) и диэтиловый (ОРЕЕ) эфиры йЭН, синтезированные В.Ю. Ковтун по [9], и ОТС фирмы Sigma-Аісігісії. Оптимальные условия уточняли сравнением путей введения и изучения дозовых кривых и динамики. Все вещества вводили в виде водных растворов: ОТС и йРЕЕ - подкожно и в левый латеральный желудочек головного мозга, остальные эфиры - подкожно, а йЭН - только интрацере-
Таблица 1.
Влияние предшественников СЗН на концентрации г:гутатиона, температуру тела и толерантность к ишемии головного мозга
Сери и п Концентрация глутатиона (мкмоль/г) Изменение температуры тела (Al С) Гаспинг (с)
Г ОЛОВІІОЙ мозг Печень
Контрольные II/к 21 2,48±0,05 5,97+0,23 0,24+0,24 16,0 (15-18)
в/ж 17 2,29±0.05 5,85+0,23 -1,48 + 0,46 16,0 (14-20)
Опытные 1. GPE 2,62 ммоль/кг п/к 2 ч 4 2,72+0,08 7,43+0,58" -1,70±0,616 17,5 (16-19)
2. GiPE 2,62 ммоль/кг п/к 2 ч 6 2,64+0,07 8,23+0,15" -1,77+0,60" 16,5 (15-18)
3. G В Е 2,63 ммоль/кг п/к 2 ч 4 2,68+0,08 8,35+0,30" -1,10+0,19" 16,0 (16-16)
4. GDEE 2,5 ммоль/кг п/к 2 ч 10 2,37+1,35 7,73+0,36" -1,26+0,416 18,5 (17-21)"
5. GDEE 8,4 ммоль/кг п/к 2 ч 5 2,77+0,10" 8,06+0,17" -5,00+0,66" 30,0 (30-30)"
6. ОТС 13 ммоль/кг п/к 2 ч 7 2,81 +0,036 6,40+0,30 -1,34 + 0,23® 18,0 (17-19)"
7. GDEE 56 мкмоль/кг в/ж 20 мин 9 2,99+0,14" 6.43+0,46 -3,76+1,57 17,0 (15-20)
8. GSH 115 мкмоль/кг в/'ж 20 мин 5 2,94+0.15° 6,17+0,33 -2,64 + 0,98 17,0 (16-22)
9. ОТС 450 мкмоль/кг в/ж 20 мин 7 2,73+0,08° 8,14+0,44" -0,69+0,27 16,0 (13-17)
Примечание: В 3-5-ых колонках приведены .г ± 5%. в 6-ой - медианы, в скобках - децили ( £), - Dg ). а - р<0.05: б - р<0,01: в - р<0.001 при сравнении с соответствующим контролем; в/ж - в желудочек мозга, п/к - подкожное введение.
Таблица 3.
Влияние предшественников GS1T на активность ферментов метаболизма глутатиона.
Серии п Показатели активности ферментов
ГПО ГР ГТ
Мозг Печень Мозг Печень Мозг Печень
Контрольные п/к 11 39,8+4,25 200+24,2 45,6+2,86 43,7+3,05 228+21,0 756+59,3
в/ж. 17-20 31,1+2,72 179+17,1 34,2+2,95 30,6+1,85 163+10,2 661+63,9
Опытные 1. GPE 2,62 ммоль/кг п/к 2 ч 4 40,5+2,75 237+13,4 48,8+5,52 36,9+2,93 224+10,3 740+61,9
2. GiPE 2,62 ммоль/кг п/к 2 ч 6 37,5+3,01 259+26,2 54,9+2,38° 46,1+2,72 224+17,6 1003+108"
3. GBE 2,63 ммоль/кг п/к 2 ч 4 43,2+2,17 258+26,3 58,6+10,6 33,9+4,45 257+26,2 690+25,2
4. GBEE 2,5 ммоль/кг п/к 2 ч 9 38,0+4,02 281+35,4 38,9+4,63 36,9+3,46 165+16,9" 687+95,6
5. GBEE 8,4 ммоль/кг п/к 2 ч 5 68,8+8,64® 386+32,5е 69,5+5,28" 58,9+4,12" 378+43,4® 1244+120®
6. ОТС 13 ммоль/кг п/к 2 ч 6 21,1+2,81" 126+18,4 33,9+3.13" 32,6+2,20" 119+12,2® 661+67,3
7. GBEE 56 мкмоль/кг в/ж 20 мин 5-9 50,2+4,67е 288+55,0" 39,4+3,34 34,5+3,98 156+15,0 705+80,3
8. GSH 115 мкмоль/кг в/ж 20 мин 5 54,9+1,66е 280+29,6" 32,0+2,54 34,9+1,60 165+12.9 796+81,9
9. ОТС 450 мкмоль/кг 1 в/ж 20 мин 23,5+1,51 123+1 1,2 39,5+1,77 36,2+2,92 167+11,2 463+28,4
Примечание: Активность ферментов выражена в нмоль/мин на 1 мг белка. Остальные обозначения как в таблице 1.
бровентрикулярно. Растворы ОТС и GSH доводили NajCOj до рН=6,5. Концентрацию GSH и активность ФМГ определяли стандартными спектрофотометрическими методами [2,7]. Температуру тела измеряли электротермометром ТТТЭМ-1 в кишечнике на глубине 3,5 см, толерантность к полной глобальной ишемии головного мозга оценивали на декапитационной модели Lowry по продолжительности гаепинга (атонального дыхания) [6]. Данные по GSH и ФМГ анализировали по критериям F и I, температуру тела (1°) - по критерию t для связанных выборок, данные по гаепингу (ввиду отклонений от нормального распределения [6]) - по непараметрическому критерию U Манна-Уитни; корреляционный анализ проводили по Спирмену (rs) [1].
Результаты и обсуждение Влияние всех веществ на систему GSH и функциональные показатели представлено в таблицах 1-2. GPE, GiPE, GBE и GDEE в дозах 2,52,6 ммоль/кг подкожно увеличивали концентрацию GSH в печени (в среднем на 24-40%), несколько снижали температуру тела (на 1,1-1,8° С) и в большинстве серий не влияли на уровень GSH в мозге, на активность ФМГ и толерантность к ИГМ. Только GiPE несколько повышал активность глутатионредуктазы (ГР) в мозге и глутати-онтранеферазы (ГТ) в печени, a GDEE снижал активность ГТ и слегка (на 16%) увеличивал толерантность мозга. ОТС в дозе 13 ммоль/кг подкожно слегка увеличивал GSH и толерантность мозга (в среднем на 12-13%) и уменьшал в нем актив-
ноеть всех трех ФМГ, а ГР - и в печени (на 2548%); несколько снижал температуру тела. Особняком стоят эффекты высокой дозы вБЕЕ (8,4 ммоль/кг) подкожно: она значительно (на 35-93%) активировала 7 из 8 показателей системы 05Н (05Н мозга повышался всего на 12%), снижала температуру тела (на 5° С) и значительно увеличивала толерантность к ИГМ (на 88%). Вероятно, увеличение в обоих органах активности всех трех ФМГ связано с их индукцией глутатионом. В свою очередь индукция ГПО и ГТ могла вторично относительно понизить вЗН в мозге.
Интрацеребровентрикулярное введение как в опытных сериях, так и в контроле снижало температуру тела. Малые дозы вБЕЕ, вЗН и ОТС увеличивали концентрацию вЗН в мозге (в среднем на 31, 28 и 19%), но не изменяли толерантность к ИГМ, снижение температуры тела и активность ГР и ГТ в обоих органах. вБЕЕ и вЗН повышали активность ГПО в мозге и печени, а ОТС увеличивал вЗН в печени.
Общая картина сдвигов представлена на рисунке, построенном как ранее [3]. Аккумуляция вЗН в головном мозге при подкожном введении метаболических предшественников происходит только в сериях с ОТС и большой дозой вБЕЕ, и, как правило, достигается при введении непосредственно в мозг намного меньших доз (в 29 раз для ОТС и в 45 раз для ОБЕЕ). Последний вариант оптимален при изучении роли вЗН головного мозга. Наоборот, для повышения концентрации вЗН в печени целесообразно подкожное введе-
Рнс. I. Сдвиги биохимических н функциональных показателей при введении предшественников глутатнона.
А - н-пропнловый эфир ОБН 2.62 ммоль/кг п/к за 2 ч: Б - изопропиловый эфир ОБН 2,62 ммоль/кг п/к за 2 ч; В - бутиловый эфир ОБН 2.63 ммоль/кг п/к за 2 ч: Г - дготиловый эфир ОБН 2,5 ммоль/кг п/к за 2 ч; Д - диоти-ловый эфир ОБН 8.4 ммоль/кг п/к за 2 ч: Е - Ь-2-оксотназол11Д11н-4-карбокснлат 13 ммоль/кг п/к за 2 ч: Ж - ди-этиловый эфир ОБН 56 мкмоль/кг в/ж за 20 мин: 3 - ОБН 115 мкмоль/кг в/ж за 20 мин: И - Ь-2-оксотиазолидин-4-карбоксилата 450 мкмоль/кг в/ж за 20 мин. 1 - гаспинг. 2-5 - система ОБН в головном мозге. 6 - температура тела. 7-10 - система ОБН в печени: 2.1 - концентрация ОБН. 3. 8 - активность глутатионпероксидазы, 4. 9 - активность глутатионредуктазы. 5.10 - активность глутатионтрансферазы. • - Р<0,05. о - Р>0,05.
ТаблицаЗ,
Корреляция биохимических и функциональных показателей
Показатели По индивидуальным данным (п=101)
GSI1 мозга GSI1 печени Температура тела Г аспинг
GSI1 мозга + 0,223" -0,247° +0,138
GSI1 печени -0,285 -0,146 +0,094
Температура тела -0,612 +0,018 -0,288й
Г аспинг +0,209 -0,136 -0,579
По средним 9 серий и объединенного контроля
ние. Введение ОТС в мозг вызывает накопление ОвП в печени, а при подкожном введении есть только транзиторный подъем через 20 мин, но не через 1 и 2 ч. Интрацеребровентрикулярное введение малых доз ОЭЕЕ и ОвП (56 и 115 мкмоль/кг) увеличивает активность ГПО в головном мозге и печени, в то время как при подкожном введении это проявляется при дозе ОЭЕЕ 8,4 ммоль/кг, то есть в 150 раз большей. Эти факты означают, что ОвП головного мозга неизвестным механизмом регулирует систему ОвП в печени.
Значимое, но небольшое снижение температуры тела и увеличение толерантности к ИГМ по сравнению с контролем наблюдалось лишь в части опытных серий (соответственно в шести и трех из 9). Только при введении большой дозы ОЭЕЕ эти сдвиги были выраженными, но ОвП мозга повышался лишь слегка. В то же время, более выраженное накопление ОвП в мозге в сериях с ин-трацеребровентрикулярным введением предшественников не приводило к увеличению толерантности к ИГМ. Корреляционный анализ (табл.З) по средним величинам серий не выявил взаимосвязей
данным показал положительную связь между ОвП печени и мозга и отрицательные корреляции температуры тела с ОвП мозга и толерантности к ИГМ с температурой. Во всех случаях взаимосвязь была слабой (г5<0,30). Исключение из корреляции контрольной серии почти не повлияло на результаты.
Таким образом, разные по структуре и механизмам действия метаболические предшественники ОвИ мало или не влияют на температуру тела и толерантность к ИГМ, а корреляция этих показателей с уровнями ОвИ слаба или отсутствует. Это существенно отличается от вызванных снижением ОвИ резких сдвигов обоих функциональных показателей и закономерной и тесной их корреляции с концентрациями ОвИ [3]. Очевидно, под влиянием сдвигов концентрации глутатиона изученные функциональные показатели изменяются по-разному, но каждый из них однонаправ-лено: температура тела снижается, а толерантность мозга увеличивается; противоположные изменения отсутствуют. Толерантность к ИГМ связана не с аккумуляцией, а со снижением содержания 0811.
изученных показателей, а по индивидуальным
THE INVESTIGATION OF FUNCTIONAL EFFECTS OF GLUTATHIONE METABOLIC PRECURSORS
L.S. Kolesnichenko, G.V. Sotnikova (Irkutsk State Medical University, Irkutsk State University)
The introduction of different metabolic precursors of reduced glutathione (GSI1), increasing its concentration in the liver or the brain, usually decreased slightly the body temperature and changed the activity of separate glutathione metabolizing enzymes (GMEs) in some series. The changes in tolerance to cerebral ischemia
(Cl) are absent in most series, only the great dose of GSI1 diethyl ester (GDEE) decreased sharply a temperature, increased considerably GMEs activity and tolerance to Cl and induced only some increase in cerebral GSI1. Correlation of tolerance with GSI1 levels is absent or weak. Evidently the tolerance to Cl is bound with
the decrease of GSI1 concentration but not with its accumulation.
Литература
КЗакс Л. Статистическое оценивание, - М: Статистика. - 1976.- 598 с.
2. Колесниченко Л,С,. Кулинский В.И.. Манторо-ва П.С. и др. Влияние фенобарбитала, ионола и цАМФ на активность ферментов метаболизма глутатиона у грызунов // Укр. биохим. журнал. -1990. -Т.62. №4* - С.60-66.
3. Колесниченко Л.С.. Сотникова Г.В.. Кулинский
B.И. Исследование функциональных эффектов направленного изменения концентрации глутатиона // Сибирский медицинский журнал. - 2002. - №1. -
C.23-24.
4. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Обмен глутатиона // Успехи биологической химии. - 1990. -Т.31.-С.157-179.
5. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Биологическая роль глутатиона // Успехи соврем, биологии. -1990. - Т, 110. Вып. 1(4). - С.20-33.
6. Кулинский В.И.. Усов Л.А.. Суфианова 1.3. и др. Сравнительная характеристика и рецепторные механизмы эффекта агониетов аденозиновых рецепторов при полной ишемии головного мозга // Эксп. клин, фармакол. - 1993. - Т.56. N"6. - С. 13-16.
7. Anderson М.Е. Enzymatic and chemical metods for the determination of glutathione // Glutathione / Eds Dolphin D. et al.-N.Y.- 1989. - Pt.A. - P.339-366.
8. Anderson. M.E. Glutathione and glutathione delivery compounds // Adv. Pharmacol. - 1997. - Vol.38. -P.65-78,
9. Anderson. M.E., Powrie, F.. Puri. R.N., and Meister, A.(1985) Glutathione monoethyl ester: preparation.
uptake by tissues, and conversion to glutathione // Arch. Biochem. Biophys. - 1985. - Vol.239. - P.538-548.
10. Dallon. T.P.. Shert/er. H.G., and Pugo. A. Regulation of gene expression by reactive oxygen. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 1999. - Vol.39. - P.67-101.
11. Moran. L.K.. Gutteridge. J.M., and Quinlan. G.J. Thiols in cellular redox signaling and control // Curr. Med. Chem. - 2001. - Vol.8(7)7 - P.763-772.
12. Sies H. Glutathione and its role in cellular functions // Free Radicals Biol. Med. - 1999. - Vol.27. - P.916-921.
О 1ЛПРАХ ВВ., НЕФЕДОВА E.B. -УДК 616.441-002+616.831-073.97-075.86
ЦЕРЕБРАЛЬНЫЕ И ВЕГЕТАТИВНЫЕ НАРУШЕНИЯ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ АУТОИММУННЫМ ТИРЕОИДИТОМ
В. В. Шпрах, Е.В. Нефедова.
(Иркутский государственный институт усовершенствования врачей, ректор - член-корр. РАМН А.А. Дзизинский, кафедра неврологии и нейрохирургии, зав. - проф. В.В. Шпрах, Иркутский областной эндокринологический диспансер, гл. врач - к.м.н. Ф.Я. Бровина)
Резюме. Представлены результаты исследования состояния центральной и вегетативной нервной системы у 116 женщин в возрасте от 18 до 56 лет с хроническим аутоиммунным ти-реоидитом. Обследование включало исследование головного мозга (электроэнцефалография, магнитно-резонансная томография), изучение состояния вегетативной нервной системы, ней-ропсихологическое исследование. На основании результатов клинических, лабораторных, МРТ и ЭЭГ- исследований в 89,6% случаев обследованных выявлен синдром энцефалопатии. Отмечено позитивное влияние заместительной гормональной терапии тироксином на состояние когнитивной функции, психоэмоциональный статус больных, биоэлектрическую активность головного мозга, а также нормализацию вегетативной дисфункции у больных хроническим аутоиммунным тиреоидитом.
Хронический аутоиммунный тиреоидит (ХАТ) -часто встречающаяся тиреоидная патология. Распространенность ХАТ среди взрослых женщин составляет от 3 до 10% [3]. ХАТ проявляется гипотиреозом, основной причиной которого является деструкция фолликулярного эпигелия щитовидной железы [6]. При тиреоидите Хашимото фолликулярные клетки щитовидной железы, окруженные лимфоцитами, обнаруживаю!' все признаки апоптоза [13]. Показано, что окислительный стресс усиливает апоптоз в клетках разного типа [6]. Патогенетическое лечение аутоиммунных заболеваний щитовидной железы в настоящее время невозможно, поэтому целью лечения является нормализация функционального состояния щитовидной железы (поддержание эутиреоидного статуса).
Неврологические проявления гипотиреоза многочисленны и разнообразны. У больных ХАТ с гипотиреозом часто наблюдаются признаки поражения центральной и периферической нервной системы: энцефалопатия, полинейропатия, миопа-тический И псевдомио тонический синдромы, 110-лирадикулоалгии и миалгии, вегетативные и аффективные расстройства [1,10,14,15].
Целью данной работы явилось изучение клинических особенностей энцефалопатического синдрома у больных хроническим аутоиммунным тиреоидитом.
Материалы п методы
Под наблюдением находились 116 женщин с хроническим аутоиммунным тиреоидитом в возрасте от 18 до 56 лег, из них лиц молодого возрас-
та (до 45) было 59, среднего возраста (45-56) - 57. Диагноз ХАТ устанавливался эндокринологом на основании результатов комплексного клиникоинструментального, лабораторного и цитологического обследования [2]. Клинически и сонографически гипертрофическая форма ХАТ - тиреоидит Хашимото (ТХ) - обнаружена у 88 больных, атрофический тиреоидит (АТ) - у 28. Определяли титр антител к тиреоидным антигенам - перокси-дазе (Ат-ТПО) и тиреоглобулину (Ат-ТГ). Изучение функции щитовидной железы проводили им-муноферментным методом: исследовали содержание в крови тирсотронного гормона (ТТГ), тирсо-идных гормонов - тироксина (Т4) и трийодтиро-нина (Тз). Гипотиреоз был выявлен у 90 (77,6%) больных ХАТ, эутиреоз - у 26 с тиреоидитом Хашимото. Показано, что присутствие в сыворотке крови антител к ТПО не коррелирует с функцией щитовидной железы [6].
Всем обследованным больным проводилось углубленное общеклиническое и неврологическое обследование. Состояние вегетативной нервной системы изучали в соответствии с методическими рекомендациями Всероссийского центра вегетативной патологии [4]. Исследовали вегетативный тонус по таблице Гийома-Вейна, вегетативную реактивность (проба Даньини-Ашнера) и вегетативное обеспечение деятельности (ортоклиноста-тическая проба). Состояние надсегмсн гарного отдела вегетативной нервной системы (неспецифических систем мозга) изучали методом регистрации ЭЭГ в покое и после проведения гипервентиляционной пробы. При этом анализировали час-
