CC BY
40
DOI: 10.23868/201903009
исследование фактора роста эндотелия сосудов у пациентов с ибс, которым выполняется операция коронарного шунтирования
Ю.Л. Шевченко, Г.Г. Борщев, В.С. Фомина, К.Ф. Ким
Национальный медико-хирургический Центр им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
vascular endothelial growth factor IN TissuEs of pATiENTs wiTH iHD, before and AFTER coronary BYpass suRGERY
Yu.L. Shevchenko, G.G. Borshchev, V.S. Fomina, K.F. Kim
N.I. Pirogov National Medical and Surgical Center, Moscow, Russia
e-mail: glebcenter@mail.ru
В статье изложены сравнительные результаты исследования фактора роста эндотелия (VEGF) в тканях пациентов с ИБС и без нее. Выявлено, что концентрация исследуемого фактора роста выше в тканях у пациентов с наличием ИБС (p<0,05). Произведён поиск ткани с наибольшей концентрацией VEGF — выявлено высокое стабильное (без признаков снижения концентрации в течение 3 суток) содержание VEGF в жировой ткани из инволютивного тимуса и эпикардиальной жировой ткани. Среди потенциальных источников VEGF отмечена жидкость, выделяемая по дренажам у пациентов в 1 сутки после выполненной открытой реваскуляризации миокарда. Попытка удаления из нее форменных элементов снизило концентрацию в ней VEGF незначимо (p>0,05), однако уменьшило общий объем жидкости почти в 4 раза (p<0,05).
ключевые слова: VEGF, ишемическая болезнь сердца, жировая ткань, иммунофлуоресценция
Результаты многочисленных исследований свидетельствуют, что ишемическая болезнь сердца (ИБС) является основной причиной возникновения и прогресси-рования сердечной недостаточности, а также смертности среди взрослого населения, как в России, так и в мире [1].
Пациенты, у которых стандартная антиангинальная терапия не приносит облегчения, нуждаются в проведении интервенционных процедур, таких как ангиопластика или аортокоронарное шунтирование (АКШ) [2]. И хотя эффективность хирургического лечения больных ИБС давно доказана, и ни у кого сомнения не вызывает, остаётся немалое количество пациентов [3] помочь которым подобным способом невозможно ввиду диффузного характера поражения сосудов сердца [4]. Внедрение в клиническую практику так называемого терапевтического ангиогенеза позволило расширить возможности лечения больных ИБС [5]. Введение в миокард или системный кровоток ангиогенных факторов способствует развитию коллатерального русла в ишемизированном миокарде, что само по себе или в сочетании с хирургической реваскуляризацией миокарда может явиться альтернативным способом лечения больных, страдающих сложной формой поражения венечных артерий [6].
Изучение ангиогенеза и факторов, его вызывающих, вышло за рамки эмбриологии и привлекло внимание клиницистов [7]. Выявлены цитокины, ответственные за неореваскуляризацию, в опухолевых образованиях, очагах воспаления и ишемизированных тканях [8, 9]. Согласно современным представлениям основными факторами ангиогенеза являются: кислый (aFGF) и основной (bFGF) фибробластические факторы роста, ангиопоэтин, гепарин-связанный эпидермальный фактор роста (HB-EGF), трансформирующий бета фактор роста (TGF-b), сосудистый эндо-телиальный фактор роста (VEGF) и некоторые другие [10]. Особый интерес представляет семейство факторов VEGF, представленное 7 изоформами и имеющее несколько типов специфических рецепторов, степень экспрессии
We present the comparative results of the study of endothelial growth factor (VEGF) in the tissues of patients with and without coronary artery disease. Concentration of the investigated growth factor was found to be higher in tissues of patients with IHD (p<0.05). Identified high content of VEGF in adipose tissue of in-volutive thymus and epicardial adipose tissue was stable (without signs of decreasing concentration for 3 days). Among the potential sources of VEGF, the fluid aspirated from the drains in patients on 1 day after open myocardial revascularization was proposed. Removal of blood corpuscle from the liquid did not significantly reduce the concentration of VEGF (p>0.05), but decreased the total volume of the liquid by almost 4 times (p<0.05).
Keywords: VEGF, ischemic heart disease, adipose tissue, immunofluorescence
которых тесно связана с выраженностью тканевой ишемии. Интересно, что эндотелиальные клетки обладают рецепторами для VEGF, но продуцируют VEGF только в состоянии аноксии. В отличие от других факторов роста, стимулирующих пролиферацию многих типов клеток, VEGF является селективным митогеном для эндотелия [11].
Экспериментально доказана безопасность VEGF и его эффективность в устранении ишемии нижних конечностей при введении в периферические артерии [12]. Тем не менее, в исследовании терапевтического ангиогенеза остаётся немало вопросов. Основные касаются его клинического применения. Однако, на данный момент, не было исследовано содержание VEGF в различных тканях и жидкостях организма человека, страдающего ИБС. Ранние исследования уделяли внимание лишь периферической крови. Нет данных о получении аутогенных факторов роста эндотелия из организма человека, подвергающегося хирургической реваскуляризации миокарда. Нет данных о стойкости этих факторов во времени. Этим вопросам посвящено настоящее исследование.
материал и методы
Исследование проведено на базе отделения сердечно-сосудистой хирургии НМХЦ им. Н.И. Пирогова (Москва). В качестве определяемого источника стимуляции неоангиогенеза был выбран фактор роста эндотелия сосудов (VGEF).
Случайным образом были выбраны 22 пациента, находившихся на лечении в отделении сердечно-сосудистой хирургии, поступивших для выполнения хирургической реваскуляризации миокарда. Всем больным при поступлении в клинику установлен диагноз ИБС, который подтверждён данными инструментального обследования. Контрольную группу составили 20 пациентов, ожидавших операций на органах грудной клетки по поводу буллезной эмфиземы. У каждого пациента было получено информированное согласие на проведение исследования.
Рис. 1. Иссечение жира в области инволютивно изменённого тимуса
Исследование проведено в соответствии с протоколом и стандартными операционными процедурами. Они гарантируют строгое соблюдение следующих документов согласно Good Clinical Practice [13-15]. Протокол, согласительная форма и другие документы, касающиеся объекта исследования, рассмотрены и утверждены независимыми членами этического комитета ФГБУ НМХЦ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.
Основную часть составляли пациенты мужского пола: мужчин было 20 (91%), женщин — 2 (9%).
Во время выполнения прямой реваскуляризации миокарда проводилось изъятие и предподготовка тканевого материала.
Процедура выполнялась в 3 этапа:
1 этап — интраоперационный — включал изъятие и предподготовку тканевого материала;
2 этап — подготовка проб для проведения дальнейшего анализа белковых компонентов материала;
3 этап — лабораторный анализ содержания факторов роста в полученном материале.
1 этап. У пациента во время операции коронарного АКШ производилось изъятие тканевого аутоматериала (количество стандартизировано до 1 г):
• Жировой ткани в области инволютивно изменённого тимуса (рис. 1); Жировой ткани эпикарда; Фрагмент левой внутренней грудной артерии; Фрагмент перикарда; Фрагмент большой подкожной вены; Фрагмент ушка правого предсердия; Периферическая кровь.
Все манипуляции осуществлялись асептически. В контрольной группе забирали только периферическую кровь, жировую ткань эпикарда и участка перикарда.
Жировая ткань иссекалась острым путем (рис. 1 ). Электрокоагуляционная техника иссечения исключалась из-за термического повреждения тканей.
Далее следовал этап предподготовки тканевого материала, заключавшийся в его гомогенизации и подготовке к хранению, а также последующем контроле содержимого гомогената. Гомогенизация заготовленного тканевого материала проводилась острыми инструментами и в ступе с пестиком.
Полученный тканевой гомогенат в стерильных условиях завальцовывали в герметичную упаковку, маркировали и помещали для дальнейшего хранения в специальном боксе с заданными условиями хранения (t° - 2-4°C).
При подготовке биоматериала осуществлялся бактериологический и цитологический контроль стерильности полученных тканей.
2 этап. В дальнейшем в лабораторных условиях проводилась окончательная подготовка материала для проведения исследований. Выделение белка из материала производилось набором ReadyPrep™ Protein Extraction Kit производство Bio-Rad.
3 этап. Учитывая, что VEGF — это стресс-индуцированный белок, его регуляция сравнивается с другими кислород — и глюкозорегулируемыми белками, поэтому физиологический и ростовой ангиогенез можно рассматривать как адаптационный ответ на дефицит кислорода. Исходя из этого, было принято решение оценить влияния гипоксии на материал пациентов, в связи с чем материал (на данном этапе исследовался только аутожир из области инволютивно изменённого тимуса у 15 пациентов) хранился при t° 2-4°C и подготовка материала для лабораторного исследования проводилась на 1, 2, 3 сутки от взятия.
Для исследования содержания факторов роста в материале был выбран иммунофлуоресцентный метод.
Результаты и обсуждение
Иммунофлуоресцентным методом определялось суммарное содержание VEGF в исследуемом материале, включая все его фракции. При анализе содержания VEGF
2 300
3 250
ш 200
| 150 £ 100 5 50 0
г
# * /// </ ' -у
г
рис. 2. Содержание УЕвР в различных тканевых материалах (опытная группа); *р<0,05. ЖТ — жировая ткань, ЛВГА — левая внутренняя грудная артерия, БПВ — большая подкожная вена, ПП — правое предсердие
_ 100 Е
£ 80 и. Ш ш
> Сп
£ 40
эпикардиальная ЖТ ЖТ передней участок перикарда перефирическая брюшной стенки кровь
рис. 3. Содержание УЕвР в различных тканевых материалах (контрольная группа). Жт — жировая ткань
120
350
20
0
Е 1
та
рис. 4. Содержание УЕвР в материале аутожира в области инволютивно изменённого тимуса (опытная группа) *р=0,17 (1 и 2 сутки), **р=0,74 (2 и 3 сутки), *** р=0,09 (2 и 3 сутки)
Е 300 8
1Т 250
(5
ш
« 200
5 X
^ 150
6
ф
£ 100 и
50 0
перифирическая кровь д/о
перифирическая кровь п/о
перикардиальная жидкость д/о
перикардиальная жидкость п/о
рис. 5. Содержание УЕвР в различных тканевых материалах (контрольная группа), *р<0,05. Д/о — до операции, п/о — после операции
140
400
350
120
* * *
*
ш 80
60
40
20
0
1 сутки
2 сутки
3 сутки
в различных тканевых материалах были получены следующие данные (рис. 2).
При сравнении полученных результатов с контрольной группой, в которой отсутствовала ИБС, а, следовательно, и дефицит кровоснабжения сердечной мышцы (и другие заболевания, причиной который является ишемия), выявлено, что показатели содержания УЕвР в контрольной группе, как в периферической крови, так и в исследуемых тканях, находится на низком уровне (р<0,05) (рис. 3).
Полученные результаты коррелируют с данными мировой литературы. Наибольшую концентрацию УЕСР выявили при исследовании ткани эпикардиального жира (р<0,05). В жировой ткани области инволютивно изменённого тимуса содержание УЕСР было выше, чем в периферической крови (р<0,05), однако ниже, чем в ткани эпикардиального жира (р>0,05). Во всех остальных тканях содержание факторов роста эндотелия было существенно ниже (р<0,05).
При анализе содержания УЕвР в материале аутожира в области инволютивно изменённого тимуса на 1, 2, 3 сутки от забора были получены следующие данные (рис. 4).
Средние концентрации составили 90,17±6,61 рд/ т1 при обработке материала на 1 сутки и 83,61±5,25 рд/ т1 и 87,04 ±3,25 рд/т1 на 2 и 3 сутки, соответственно. При индивидуальном анализе тенденций к изменению факторов роста в течение 3 суток никаких стабильных тенденций не выявлено (р>0,05). Все изменения колеблются в пределах погрешности теста, что позволяет сделать предположение об относительной постоянности содержания фактора роста в материале. Данный факт позволяет сделать предположение, о возможности
использования материла как депо, из которого будет постепенно высвобождаться фактор роста.
В последующем были проанализированы результаты концентрации УЕвР в периферической крови, отделяемому по дренажам после операции АКШ у пациентов опытной группы. Выявлено, что концентрация УЕСР в жидкости, выделяемой по дренажам, превосходит концентрацию данных факторов в периферической крови (р<0,05). При этом интраоперационные данные (до выполнения реваскуляризации) и послеоперационные также значимо отличались в сторону увеличения концентрации УЕвР после проведенной операции (р<0,05) (рис. 5).
Ввиду того, что в жидкости, выделяемой по дренажам после операции АКШ, наряду с белковыми фракциями, содержатся форменные элементы и сопровождающие вещества, была предпринята попытка отделения форменных элементов центрифугированием и увеличения общего количества фактора роста в заданном объеме — 75-100 мл.
В результате проводимых манипуляций, был получен концентрат. Измерено общее количество УЕвР в полученном концентрате иммунофлуоресцентным методом, выявлено, что концентрация УЕСР до центрифугирования в образцах составляла 289±20,44 рд/т1, после центрифугирования 216±6,44 рд/т1 (р>0,05), при этом общее количество раствора уменьшилось с 406±31,2 мл до 116±8,8 мл (р<0,05).
Таким образом, предложенный метод позволяет уменьшить количество получаемой жидкости с сопоставимой концентрацией фактора роста эндотелия, что в дальнейшем может быть использовано при разработке методов терапевтического ангиогенеза.
Выводы
Выявлено, что у пациентов с ИБС в тканях организма содержится УБЭГ, причём наибольшая его концентрация определялась в жировой ткани эпикардиального жира. Второе по значимости депо находится в ткани инволю-тивно изменённого тимуса.
При анализе стабильности данного фактора в течение 3 суток выявлено, что содержание данного белка не меняется в этот период, что может говорить о возможности использования жировой ткани для доставки и поддержания постоянной концентрации фактора роста
в зоне ишемии. Определено, что в данной ткани содержатся в относительно равном количестве все фракции УБЭГ, что говорит о более комплексном их влиянии на процессы ангиогенеза.
Полученные результаты позволяют предложить применение ткани эпикардиального жира и ЖТ инволютивно изменённого тимуса, как источника факторов стимуляции неоангиогенеза у пациентов с ИБс во время проведения реваскуляризации миокарда. Особого внимания заслуживает возможность использования жидкости, отделяемой по дренажам в послеоперационном периоде операции АКШ.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Бокерия Л.А., Гудкова Л.Г. Сердечно-сосудистая хирургия. Болезни и врожденные аномалии системы кровообращения. Москва: НЦССХ им. А.Н. Бакулева, 2012: 121.
2. Neumann F.J., Sousa-Uva M., Ahlsson A. et al. ESC Scientific Document Group. 2018 ESC/EACTS Guidelines on myocardial revascularization. Eur. Heart J. 2019; 40(2): 87-165.
3. Lozano I., Capin E., de la Hera J.M. et al. Diffuse Coronary Artery Disease Not Amenable to Revascularization: Long-term Prognosis. Rev. Esp. Cardiol. (Engl. Ed.) 2015; 68(7): 631-3.
4. Акчурин Р.С., Ширяев А.А., Дземешкевич С.Л. и др. Оценка факторов госпитальной летальности у больных ишемической болезнью сердца с высоким операционным риском. Грудная и сердечно-сосудистая хирургия 2005; 2: 14-20.
5. Deveza L., Choi J., Yang F. Therapeutic angiogenesis for treating cardiovascular diseases. Theranostics 2012; 2(8): 801-14.
6. Ahn A., Frishman W.H., Gutwein A. et al. Therapeutic angiogenesis: a new treatment approach for ischemic heart disease. Рart I. Cardiol. Rev. 2008; 16(4): 163-71.
7. Chu H., Wang Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther. Deliv. 2012; 3(6): 693-714.
8. Lewis C.E., Leek R., Harris A. et al. Cytokine regulation of angiogenesis in breast cancer: the role of tumor-associated macrophages. J. Leukoc Biol. 1995; 57(5): 747-51 .
9. Neufeld G., Kessler O. Pro-angiogenic cytokines and their role in tumor angiogenesis. Cancer Metastasis Rev. 2006; 25(3): 373-85.
10. Freedman S.B., Isner J.M. Therapeutic angiogenesis for coronary artery disease. Ann. Intern. Med. 2002; 136(1): 54-71.
11. Ferrara N. Vascular endothelial growth factor. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2009; 29(6): 789-91.
12. Takeshita S., Zheng L.P., Brogi E. et al. Therapeutic angiogenesis. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revasculariza-tion in a rabbit ischemic hind limb model. J. Clin. Invest. 1994; 93(2): 662-70.
13. ICH Harmonized Tripartite Guidelines for Good Clinical Practice 1996.
14. Directive 91/507/EEC, The Rules Governing Medicinal Products in the European Community.
15. Declaration of Helsinki, concerning medical research in humans (Recommendations Guiding Physicians in Biomedical Research Involving Human Subjects, Helsinki 1964, amended Tokyo 1975, Venice 1983, Hong Kong 1989, Somerset West 1996, Edinburgh, 2000, 64th WMA General Assembly, Fortaleza, Brazil, October 2013).
Поступила: 18.122018
