CC BY
39
УДК 628.35:579.66
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕСТРУКЦИИ
ПРИОРИТЕТНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ МИКРООРГАНИЗМАМИ
О.В. Колотова, И.В. Могилевская, И.В. Владимцева, А.В. Ермоловский
Проведены выделение из объектов окружающей среды и отбор эффективных микроорганизмов-деструкторов распространённых органических загрязнителей. Изучены скорости роста полученных микробных штаммов и их деструктивная активность в отношении нефтяных углеводородов, липидов и фенолов. Показано, что наибольшей активностью среди исследуемых 18 фенолокисляющих штаммов обладает ВГТУ-13, из 10 липолитических - ВГТУ-02. Эти штаммы являются по результатам исследований активными деструкторами нефтяных углеводородов. Показана возможность использования фенолокисляющих и липолитических бактериальных штаммов для биологической очистки водных сред от нефтяных загрязнений.
Ключевые слова: нефтепродукты, бактериальные штаммы, фенолы, липиды, деструкторы, органические загрязнения.
Актуальной проблемой сегодня является накопление в различных объектах окружающей среды таких распространённых и стойких загрязнителей, как нефть и продукты ее трансформации (в том числе фенолы), жиры и жироподобные вещества. Это приводит к снижению самоочищающей способности водных и почвенных экосистем за счет уменьшения концентрации растворенного кислорода и скорости процессов минерализации органического вещества, накопления токсичных продуктов анаэробного распада, изменения солевого состава и других характеристик среды.
Являясь первым звеном в детритных пищевых цепях, важнейшую роль в обеспечении резистентности природных экосистем к техногенному воздействию играют микроорганизмы, обладающие высокими адаптационными способностями и пластичностью обменных процессов [1, 2]. Поступление нефтяных загрязнений в природную среду стимулирует развитие в ней соответствующей аллохтонной микрофлоры. Поэтому нефте-, фенол- и липидоокисляющие микроорганизмы являются индикаторами загрязнений, по их присутствию и концентрации можно косвенно судить о степени загрязнения природных сред соответствующими компонентами.
Указанные загрязнители являются широко распространенными и поступают в окружающую среду в больших количествах [3, 4]. По сравнению с физико-химическими методами удаления загрязнителей из природных сред и отходов производства, метод биодеградации обычно более предпочтителен, поскольку не требует высоких затрат на очистку, приме-
нения сложной аппаратуры и реагентов, а также обеспечивает возможность удаления разнообразных соединений, находящихся в растворенном, коллоидном и нерастворенном состоянии. Биологическая очистка вод, загрязнённых фенолом и нефтепродуктами, получила широкое распространение, и большое количество видов микроорганизмов-деструкторов фенола были выделены и охарактеризованы на физиологическом и генетическом уровне. Применение микроорганизмов-деструкторов, которые могут использовать в качестве источника питания углеводородсодер-жащие и фенол содержащие компоненты, способствует их разложению до более простых органических и неорганических соединений, не наносящих вреда окружающей среде. При их использовании в ходе биологической очистки нагрузка на различные компоненты окружающей среды может быть существенно снижена. Поэтому выделение и отбор новых штаммов -деструкторов таких соединений, как: нефть, фенолы, липиды - является актуальным направлением в современных исследованиях.
Целью настоящего исследования стало изучение возможности применения микроорганизмов, выделенных из различных объектов окружающей среды, содержащих приоритетные загрязнители, для очистки природных и сточных вод. Для достижения указанной цели решались следующие задачи:
1) выделить чистые культуры фенол окисляющих, липолитиче-ских, углеводородокисляющих микроорганизмов из объектов окружающей среды;
2) провести отбор наиболее эффективных штаммов, использующих фенолы, липиды, нефть и продукты ее переработки в качестве единственного источника углерода;
3) определить возможность применения отобранных активных микроорганизмов для очистки модельных сточных вод, загрязнённых нефтепродуктами, фенолом и жирами животного происхождения.
В ходе исследования осуществляли выделение микроорганизмов накопительным методом с применением селективных сред, а также использовали бактериальные штаммы из коллекции микроорганизмов лаборатории биотехнологии Волгоградского государственного технического университета.
Для накопления нефтеокисляющих микроорганизмов использовали среду Диановой-Ворошиловой, содержащую нефть или дизельной топливо в качестве единственного источника углерода [5], для фенолокисляющих -среду Егоровой, содержащую 0,1 % фенола [6], для липидоокисляющих -среды следующего состава (г/л): К2НРО4 - 1; МgSO4•7H2O - 0,3; СаСЬ-б^О - 0,1; (NH4)2HPO4 - 2,0; ШО - 0,1; рН - 7,6. В качестве источника углерода в состав питательной среды для липидоокисляющих микроорганизмов вводили стерильное оливковое масло в количестве 2 % (об.)
[7]. Подготовленные стерильные селективные среды заражали образцами донных отложений из проб, отобранных при мониторинговых экологических исследованиях акватории Северного Каспия. Накопление во всех случаях вели при 28... 30 °С в стационарных условиях в течение 14 суток, после чего производили высев на пластинки агаризованной среды в чашки Петри для получения изолированных колоний.
Одним из приоритетных загрязнителей водных экосистем является фенол, поэтому в ходе исследования были проведены выделение и отбор штаммов, активных по отношению к фенолу в качестве единственного источника углерода.
При посеве из накопительных культур на чашки с плотной средой Егоровой по результатам визуальной оценки вида и размеров колоний были отобраны 18 штаммов фенолокисляющих микроорганизмов.
Из 18 исследуемых штаммов были отобраны 5 культур, обладающих наилучшими ростовыми характеристиками при концентрации фенола от 0,05 до 0,15 %. Для данных штаммов была детально изучена возможность утилизации фенола в условиях стационарного культивирования (рис. 1).
1.1.1
Ф1-05.1 Ф2-07 Ф2-13.1 Ф2-13.2 Ф1-18.3
■ 0,05% и0,10% ■ 0,15%
Рис. 1. Зависимость оптических плотностей бактериальных взвесей наиболее активных фенолокисляющих микроорганизмов от концентрации фенола в среде (0,05 %, 0,1 %, 0,15 %)
Данные, приведённые на рис. 1, свидетельствуют, что наибольшей активностью при высокой концентрации фенола в среде (0,1 % и 0,15 %) обладают штаммы Ф1-05.1, Ф2-13.1 и Ф-18.3. Их отобрали для дальнейшей проверки деструктивной активности в отношении фенола.
По результатам исследований [8] в последующих экспериментах для культивирования выше указанных штаммов применяли среду Диано-вой-Ворошиловой с добавлением фенола в количестве 1,5 г/л (0,15 %).
16
Для установления начальной и конечной концентраций фенола в исследуемых модельных средах использовали метод, основанный на образовании окрашенного соединения в результате реакции фенола с продуктом диазотирования п-нитроанилина [9]. С целью определения остаточного количества фенола в среде после культивирования микроорганизмов культуральную жидкость объёмом 10 мл отделяли от биомассы на центрифуге СМ-6 МТ (БЬМ1 Латвия) в течение 10 мин при 3000 об. /мин. Через 20 минут после проведения химической реакции измеряли оптическую плотность растворов. Концентрацию фенола в культуральной жидкости определяли по калибровочному графику, построенному по известной концентрации этого соединения.
Результаты проведенных экспериментов представлены на рис. 2.
Ф1-05.1 Ф2-13.1 Ф1-18.3
■ 240 ч, 30 °С "240 ч,37 °С
Рис.2. Остаточные концентрации фенола в средах с исследуемыми штаммами после стационарного культивирования в течение 240 ч
Полученные результаты свидетельствуют о том, что штаммы Ф1-05.1 и Ф2-13.1 обеспечивают практически равные остаточные концентрации фенола при температуре культивирования 30 0С. При 37 0С наиболее низкое содержание фенола 0,060 мкг/мл обнаружено в культуральной жидкости штамма Ф2-13.1. Концентрации фенола в пробах штамма Ф1-18.3 остаются практически одинаковыми при обеих температурах по истечении 10 суток выращивания, но более высокими, чем в пробах с культурами Ф1-05.1 и Ф2-13.1. Все штаммы были проверены на наличие пирокатехина (промежуточного продукта при биологическом окислении фенола). Установлено его отсутствие только в культуральной жидкости штамма Ф2 -13.1, что свидетельствует о более полном окислении фенола этими микроорганизмами [10].
Таким образом, для дальнейших исследований был отобран штамм Ф2-13.1, который способен с наибольшей скоростью и практически полностью расщеплять фенол, содержащийся в среде культивирования. Данный
штамм по результатам исследований относится к аэробам, видимые колонии на МПА вырастают в течение 72 ч (рис.3). На селективной среде с содержанием фенола 0,15 % (масс.) колонии до 1 мм формируются в течение 24 - 48 ч. Колонии круглые, гладкие, со временем приобретают розоватый оттенок, на 7 сутки появляется видимый субстратный мицелий, при рассмотрении на небольшом увеличении микроскопа (х40) представляет собой синнемы, при этом воздушный мицелий отсутствует. Клетки обладают подвижностью, кислотоустойчивостью, окраска по Граму положительная. Температурный оптимум 28...37 0С (сплошной рост на плотной питательной среде за 24 ч), при снижении температуры до 210С и или повышении до 43 0С скорость роста снижается (сплошной рост на скошенном агаре за 48 ч). По описанным выше признакам выделенный штамм был отнесен к семейству ЛсИпотусМасвав, роду Шойососст и обозначен ВГТУ-13.
Для оценки возможности штамма ВГТУ-13 осуществлять биологическую очистку сточных вод, содержащих фенол проводили модельную очистку в условиях глубинного культивирования штамма в ферментере при непрерывном аэрировании жидкой питательной среды с содержанием фенола 1,5 г/л. Концентрацию фенола в пробах определяли через 24, 48, 72 и 120 ч после начала выращивания микроорганизмов. При глубинном культивировании штамма ВГТУ-13 в среде, содержащей фенол, происходит практически полная деструкция загрязнителя. Остаточная концентрация фенола после глубинного выращивания культуры (0,067 мкг/мл) практически соответствует его конечной концентрации после стационарного культивирования данного штамма (0,060 мкг/мл), однако скорость достижения этой концентрации при выращивании микроорганизмов в ферментере увеличивается в 2 раза [11].
Рис. 3. Штамм ВГТУ-13 на питательном агаре
Жиры являются распространенными загрязнителями промышленных и хозяйственно-бытовых сточных вод. Их негативное воздействие на водные экосистемы связано со значительной химической стойкостью и способностью покрывать водоёмы прочной пленкой, обусловливающей протекание анаэробных процессов. Последние, в свою очередь, приводят к накоплению в водоёмах токсичных для живых организмов веществ, появлению неприятного запаха и ухудшению других органолептических свойств воды. В настоящее время проблема очистки сточных вод от жиров и масел решается разнообразными методами, специфика которых связана с природой загрязнителей (природные жиры и масла, синтетические продукты), их концентрацией, температурой стока, необходимой степенью очистки и др. Традиционной является схема очистки жиросодержащих сточных вод, включающая этапы механической (в жироловушках) и биологической (в биофильтрах и аэротенках) очистки [12].
Выделение липидоокисляющих микроорганизмов проводили методом накопительных культур из проб морских донных отложений, т.к. данная группа микроорганизмов является индикаторной для морской среды. В качестве источника углерода в состав питательной среды вводили стерильное оливковое масло в количестве 2 % (об.). Во флаконы со 100 мл стерильной питательной среды вносили морскую воду (5 проб) или образцы донных отложений (4 пробы), в которых в ходе предварительного мониторинга были обнаружены максимальные концентрации нефтеокисля-ющих микроорганизмов (250.2500 м.к./мл). Пробы инкубировали при 30 0С в течение 7 суток. Полученные суспензии накопительных культур оценивали визуально по скорости и степени помутнения, что косвенно свидетельствовало о концентрации и активности липидоокисляющих микроорганизмов. С целью получения изолированных колоний суспензии высевали на пластинки плотной среды, приготовленной на основе накопительной среды с добавлением 2 % (масс.) агар-агара и 2 % (об.) оливкового масла.
После разведения и высева полученных микробных суспензий на плотную питательную среду были получены чистые культуры 10 бактериальных штаммов.
Культивирование 10 изолированных культур на средах специального состава (среде Селибера и бульоне Штерна) позволило выявить различия в интенсивности роста и способности менять рН среды, связанной со скоростью деструкции жиров и образованием свободных жирных кислот. Визуально активность исследуемых штаммов сопоставляли, используя систему балльной оценки по двум средам: 2 балла - наличие роста, изменение цвета питательной среды; 3 балла - интенсивный рост; 1 балл - слабый рост; 0 баллов - отсутствие роста, изменения цвета питательной среды.
Результаты изучения активности выделенных липидоокисляющих штаммов представлены на рис. 4.
Данные, представленные на рис. 4, свидетельствуют о том, что штаммы Л-2, Л-3, Л-4, Л-5 и Л-8 показали в ходе эксперимента наиболее интенсивный рост, используя в качестве источника углерода оливковое масло и расщепляя его при этом с образованием жирных кислот, что, в свою очередь, приводит к снижению рН среды и изменению цвета индикаторов в составе среды Селибера (бромфеноловый синий) и бульона Штерна (фуксин). Для 5 отобранных штаммов провели оценку экзолипазной активности по методу, предложенному П.Н. Золотарёвым [13]. Результаты экспериментов приведены на рис. 5.
| Среда Селибера ■ Бульон Штерна
Рис. 4. Активность липидоокисляющих штаммов при культивировании на среде Селибера и бульоне Штерна (в баллах)
Рис. 5. Экзолипазная активность изолированных бактериальных штаммов по отношению к твинам
20
Результаты, представленные на рис. 5, позволяют заключить, что максимальной активностью среди отобранных бактериальных штаммов в отношении всех взятых в опыт твинов обладает штамм № 2. Штамм № 8 активно утилизирует три субстрата, штамм № 4 - 2 субстрата. Штаммы №3 и № 5 не обладали экзолипазной активностью.
Природные жиры, в отличие от твинов, содержат остатки различных жирных кислот, поэтому они являются более труднодоступными субстратами для микроорганизмов. Для оценки липидоокисляющей способности отобранных бактериальных штаммов их выращивали в течение 48 ч на плотных питательных средах, содержащих 1 % (масс.) природных жиров в качестве единственных источников углерода, измеряя диаметры образующихся колоний. Полученные результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1
Размеры колоний исследуемых липолитических штаммов на средах _с различными жирами_
№ штамма Диаметр колоний, мм
Оливковое масло Говяжий жир Свиной жир
Л-2 2-3 <1 3-4
Л-4 5-7 4-6 -
Л-8 6-12 - 9-10
Приведенные в табл. 1 данные свидетельствуют о том, что штаммы Л-2, Л-4 и Л-8 способны утилизировать природные жиры, используя их в качестве единственного источника углерода. Штамм Л-2 хуже растет на жировых субстратах, особенно на среде с говяжьим жиром, что, по -видимому, объясняется более длительным периодом адаптации, связанной с продукцией соответствующего набора липолитических ферментов. Липазы являются индуцируемыми ферментами и в литературе имеются сведения об индукции липаз жирными кислотами и липидами [14, 15]. По истечении 7 суток колонии штамма Л-2 на среде, содержащей говяжий жир, достигали 2 - 3 мм в диаметре, через 12 суток - 6 - 7 мм.
Штамм Л-4 образовывал колонии приблизительно одинакового размера на средах с оливковым маслом и говяжьим жиром, однако не проявил активности в отношении свиного жира. Возможно, это объясняется высоким содержанием в свином жире пальмитиновой кислоты (до 30 %). Как показали эксперименты, бактерии данного штамма не способны к утилизации монопальмитата - твина-40 (см. рис. 5). Штамм Л-8 образовывал крупные колонии на средах с оливковым маслом и свиным жиром, но оказался не способным к росту на среде с говяжьим жиром.
21
Таким образом, в результате проведенных исследований изолированы чистые культуры липолитических бактерий. Изучена способность выделенных бактериальных штаммов использовать в качестве единственного источника углерода твины, оливковое масло и животные жиры. Установлено, что наибольшим спектром липолитической активности из 10 выделенных бактериальных штаммов обладает штамм Л-2, способный к утилизации всех взятых в опыт жировых субстратов. Максимальную деструктивную активность по отношению к оливковому маслу и свиному жиру проявил штамм Л-8, по отношению к говяжьему жиру - штамм Л-4. Полученные экспериментальные данные показали перспективность использования выделенных бактериальных штаммов для очистки жиросо-держащих сточных вод в виде монокультур или в составе комплексных биопрепаратов, содержащих ассоциации различных штаммов микроорганизмов.
Штамм Л-2 был отобран в коллекцию микроорганизмов лаборатории биотехнологии ВолгГТУ, присвоено наименование ВГТУ-02.
Штаммы ВГТУ-02 и ВГТУ-13 среди других штаммов из коллекции лаборатории биотехнологии ВолгГТУ были использованы на следующем этапе исследований для выявления микроорганизмов, способных проявлять активность по отношению к нефти и дизельному топливу как единственным источникам углерода. Для этого использовали балльную систему после визуального наблюдения в течение 14 суток [16]. В качестве контроля в данной методике использовали среду, не засеянную микроорганизмами (рис. 6).
4,5
ЁЕЁЁЁЁЁттй>>>>> >
^ ш ш ш са ш со
Наименование штамма ■ нефт ь ■ д изе/1 ь ное то пл и в о
Рис. 6. Результаты скрининга углеводородокисляющей активности
исследуемых штаммов
По полученным данным 4 штамма (ВГТУ-13, ЗСК-1, УВ-2, УВ-18) показали активность 4 балла при использовании в качестве источника углерода 2 % нефти, у 4 штаммов (УВ-17, ВГТУ-22, УВГ-11) активность по отношению к нефти 3 балла; у 2 штаммов (ЗСК -1, УВ-17) наблюдали активность в 4 балла по отношению к дизельному топливу 2 %, и 2 бактериальных штамма (ВГТУ-02 и ВГТУ-13) проявили активность к данному виду источника углерода в 3 балла. При росте наиболее активных штаммов в жидкой среде с нефтью (2 % об.) визуально замечено отсутствие маслянистости на стенках колб, значительное помутнением среды, при этом нефть на поверхности жидкости находилась в диспергированном состоянии в виде эмульсии. В контрольной колбе (без микроорганизмов) среда прозрачная без изменений состояний нефти или дизельного топлива. Визуально замеченное диспергирование нефти в колбах с активными бактериальными штаммами говорит о возможной способности активных штаммов к синтезу ПАВ в определенных условиях культивирования, что способствует эмульгированию нефти. По результатам скрининга из 23 штаммов было выбрано 6 - ВГТУ-02, ЗСК-1, ВГТУ-13, УВ-2, УВ-18, УВ-17.
Далее для данных штаммов была поведена серия экспериментов по определению динамики роста. В стерильные колбы объемом 200 мл поместили 50 мл среды Диановой - Ворошиловой с концентрацией нефти 2 % (об.) и 5 мл бактериальной взвеси исследуемого штамма с концентрацией 109 м.к./мл. Культивирование осуществляли при 30°С. Определение концентрации биомассы исследуемых на данном этапе микроорганизмов осуществляли макрокультуральным методом непосредственно после посева в жидкую питательную среду (начальная концентрация), а также через 1, 2, 3, 5, 7 суток. В табл. 2 приведены результаты определения максимальной концентрации микроорганизмов изучаемых штаммов на селективных средах.
Таблица 2
Максимальные концентрации нефтеокисляющих микроорганизмов
при культивировании на селективных средах
Наименование штамма Максимальная концентрация на среде с нефтью, 2%, КОЕ/мл Максимальная концентрация на среде с дизельным топливом 2%, КОЕ/мл
ВГТУ-02 1,80 хЮ11 2,12х1010
ЗСК -1 1,05х1010 1,15х 1010
ВГТУ-13 9,00х107 1,40х107
УВ-2 6,42х107 1,55х 107
УВ-18 6,40х107 0,25х106
УВ-17 2,58х105 0,50х106
Из данных, приведённых в табл. 2, следует, что наиболее активным ростом на среде с нефтью в качестве единственного источника углерода
характеризуются штаммы ВГТУ-02, ЗСК-1, ВГТУ-13 и УВ-2, на среде с дизельным топливом - штаммы ВГТУ-02, ЗСК-1 и УВ-2. По визуальным наблюдениям через 7 суток культивирования во флаконах с модельными средами наблюдали отсутствие начального количества нефти и обильное образование хлопьев на поверхности. По результатам изучения динамики роста нефтеокисляющих штаммов для дальнейших исследований выбраны 4 штамма: ВГТУ-02, ВГТУ-13, ЗСК -1 УВ-2.
При взаимодействии нефтеокисляющих бактерий с углеводородным субстратом в некоторых случаях обнаруживается способность к непосредственному контакту с углеводородом за счет гидрофобной клеточной поверхности, что обусловлено наличием в ней липидных компонентов [6]. Определение гидрофобности поверхности клеток проводили по методу Ро-зенберга в модификации Серебряковой [17].
Расчеты показателя гидрофобности (ПГ) и эмульгирующей активности (ЭА) осуществляли по методике, приведённой в источнике [18]. Результаты расчетов представлены на рис. 7.
¡ИИ
о -И—™ , —™ I —^
ВГТУ-02 ВГТУ-13 УВ-2 ЗСК-1
п ПГ ■ ЭА
Рис. 7. Показатели гидрофобности (ПГ) и эмульгирующая активность (ЭА) исследуемых нефтеокисляющих штаммов
Данные, представленные на рис. 7, показывают, что штамм ЗСК-1 характеризуется максимальным значением показателя гидрофобности, равным 45 %.
Выявлено, что максимальной эмульгирующей активностью из четырёх исследуемых штаммов обладает штамм УВ-2 (67,6 %), практически на том же уровне эмульгирующая активность у ЗСК-1 (67,5 %). Незначительно ниже (66, 55 %) данный показатель у штамма ВГТУ-02. Для утилизации углеводородов подходят микроорганизмы, имеющие индекс эмульгирования больше 50 %. [19]. Поэтому отобранные микроорганизмы ВГТУ-02, ВГТУ -13, ЗСК-1 и УВ-2 являются активными продуцентами поверхностно-активных веществ и, следовательно, характеризуются высоким деструктивным потенциалом в отношении нефтяных углеводородов.
Приведенные в табл. 2 данные показывают, что наибольший прирост биомассы на питательных средах, содержащих в качестве источников
углерода нефть и дизельное топливо даёт штамм ВГТУ-02, что свидетельствует об активном использовании изучаемыми бактериями органических компонентов в качестве источников питания. Визуальная оценка изменений, происходящих в колбах с культивируемыми микроорганизмами также показывает способность бактерий ВГТУ-02 эмульгировать и утилизировать нефть и дизельное топливо - через 7 суток наблюдали отсутствие первоначально присутствовавшего органического слоя и образование обильных хлопьев на поверхности минеральной среды.
Для оценки возможности использования бактерий ВГТУ-02 для очистки водных сред от нефтяных углеводородов провели эксперимент по стационарному культивированию микроорганизмов в модельной водной среде с исходным содержанием нефти 2 % (об.) в течение 7 суток. В ходе опыта в колбы на 200 мл среды поместили 10 % бактериальной взвеси штамма ВГТУ-02, колбы культивировали при 30 0С в течение 7 суток. По истечении времени культивирования провели хроматографическое исследование после экстракции н-гексаном модельной среды с нефтью и контрольной среды, не засеянной микроорганизмами.
Молекулярный анализ нефти и экстракта из загрязненной воды показал преобладание н-алканов над изоалканами, что иллюстрируется хро-матограммой на рис. 8. В экстракте из культуральной жидкости после культивирования ВГТУ-02 преобладают изоалканы, при этом увеличилась концентрация нафтеновых углеводородов (рис. 9). Согласно литературным данным [20], это свидетельствует о деградации нефти исследуемым бактериальным штаммом.
Рис. 8. Хроматограмма экстракта контрольной среды с содержанием
нефти, 2% (об.)
Рис. 9. Хроматограмма экстракта культуральной жидкости ВГТУ-02 (стационарное культивирование на среде в 2 % нефти в течение
7 суток)
Для оценки эффективности применения бактерий ВГТУ-02 в целях очистки модельной среды от нефти исходное и конечное содержание нефтепродуктов в средах определяли флуориметрическим методом (ПНД Ф 14.1:2:4.128-98) на анализаторе жидкости «Флюорат-02-2М».
При измерении на приборе «Флюорат-02-2М» установлено, что исходная концентрация нефтепродуктов в модельной среде составила 647 ± 161,8 г/дм3. В
подготовленную среду Диановой-Ворошиловой засевали 12 мл (10 %, об.) микробной взвеси с концентрацией бактерий ВГТУ-02 109 м.к./мл. Культивирование вели в термостате в течение 10 суток при температуре
30 0С, осуществляя наблюдение за изменением визуальных параметров. По истечении времени культивирования остаточное содержание нефтепродуктов в жидкой фазе составило 199,7 ± 49,9 г/дм . Таким образом, степень очистки от нефти модельного раствора штаммом ВГТУ-02 составила 69,13 %.
Таким образом, в ходе исследований изучены 18 фенолокисляю-щих, 10 липолитических и 23 нефтеокисляющих штамма, использующих фенолы, жиры и нефтяные углеводороды в качестве единственного источника углерода соответственно. Получены данные по динамике роста наиболее активных штаммов, определены показатели гидрофобности и эмульгирующей активности бактерий-деструкторов. В результате для дальнейших исследований выбран наиболее активный фенолокисляющий штамм ВГТУ-13, характеризующихся максимальной деструктивной активностью (99,9 %) и скоростью роста на средах, содержащих фенол в качестве единственного источника углерода в концентрации до 0,15 % (масс.).
Из исследованных липолитических микроорганизмов выявлен наиболее активный штамм бактерий ВГТУ-02, способный утилизировать оливковое масло, свиной и говяжий жиры. Из 23 бактериальных штаммов, способных к деструкции нефтяных углеводородов, выбраны наиболее активные (6 штаммов, в том числе ВГТУ-02 и ВГТУ -13). Из них максимальную активность проявил липолитический штамм ВГТУ-02, обеспечивающий степень очистки модельной среды от нефти 69,13 % за 10 суток.
Результаты проведённых исследований показывают возможность применения бактериальных штаммов ВГТУ-02 и ВГТУ-13 для очистки природных сред от таких распространённых загрязнителей, как нефть, жиры и фенолы. При этом штамм ВГТУ-13 является нефте- и фенолокисля-ющим, штамм ВГТУ-02 нефте- и липидоокисляющим.
Список литературы
1. Курапов А. А., Умербаева Р. И., Гриднева В. В. Микроорганизмы в процессах деструкции нефти в водоемах // Юг России: экология, развитие. 2015. Т. 5. №. 4. С. 86-88.
2. Куликова И. Ю. Микробиологическая оценка вод Северного Каспия в условиях освоения месторождений углеводородного сырья // Исследовано в России. 2005. Т. 8.
3. Галимова Р. З., Шайхиев И. Г. Очистка фенолсодержащих сточных вод нативными и модифицированными адсорбционными материалами на основе отходов сельскохозяйственного и промышленного производства // Белгород-Казань, 2018. 96 с.
4. Коршенко А. Н. Качество морских вод по гидрохимическим показателям. 2015.
5. Теоретические и практические аспекты проблемы биологического окисления углеводородов микроорганизмами / А. В. Брянская [и др.] // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2015. Т. 18. №. 4/2. С. 999-1002.
6. Разработка биосорбента на основе отходов растениеводства для очистки сточных вод от нефтепродуктов / О.В. Колотова [и др.] // Вестник Пермского национального исследовательского политехнического ун-та. Прикладная экология. Урбанистика. 2018. № 4 (32). С. 58-71.
7. Выделение и изучение липидоокисляющих микроорганизмов-обитателей Северного Каспия / О.В. Колотова [и др.] // Вестник Казанского технологического университета. 2017. Т. 20. №. 6. С. 135-138.
8. Исследование фенолокисляющих бактериальных штаммов, выделенных из акватории Северного Каспия /И.В. Соколова [и др.] // Вестник Казанского технологического университета. 2017. Т. 20. №. 10. С. 119-123.
9. Коренман, И.М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений. М.: Химия. 1970. 343с.
10. Харборн Дж. Биохимия фенольных соединений / пер. с англ; под ред. Н. М. Эмануэля. М.: Мир, 1968. 448с.
11. Выделение, культивирование и изучение основных свойств фе-нолокисляющих микроорганизмов с целью получения биопрепарата для биологической очистки промышленных сточных вод / И.В. Соколова [и др.] // Сб. науч. тр.У Междунар. конф. «Школа по химической технологии ХТ16»; сателлитной конф. XX Менделеевского съезда по общей и прикладной химии (г. Волгоград, 16-20 мая 2016 г.). В 3 т. Т. 3. Волгоград: ВолгГТУ 2016.C. 228-230.
12. Чудакова О. Г., Желовицкая А.В., Бескровный Д.В. Очистка сточных вод мясоперерабатывающих предприятий // Вестник Казанского технологического университета. 2016. Т. 19. № 22. С.182-186.
13. Золотарев П. Н. Оценка патогенных свойств бактерий под действием фитосубстанций (на примере липолитической активности) // Сибирский медицинский журнал. 2015. № 6. С. 130 - 132.
14. Рубан Е.Л, Ксандопуло Г.Б., Мурзина Л.П. Условия биосинтеза экзолипазы грибом Oospora fl agrans. // Прикладная биохимия и микробиология, 1978. Т. 14. Вып.6 С.849 - 857.
15. Влияние состава среды на биосинтез и свойства экзолипаз микроорганизмов / Ю.Я. Свириденко [и др.] // Микробиология. 1978. Т. 47. Вып.5. С. 677-682.
16. Нефтеокисляющая активность и идентификация микроорганизмов, выделенных из Каспийского моря / Э.Р. Файзулина [и др.] // Биология жэне медицина сериясы. 2014. С. 25-29.
17. Оценка гидрофобных свойств бактериальных клеток по адсорбции на поверхности капель хлороформа. / Е.В. Серебрякова [и др.] // Микробиология. 2002. Т.71. №2. С.237-239.
18. Колотова О. В., Могилевская И. В., Владимцева И. В. Выделение, отбор и применение углеводородокисляющих микроорганизмов для очистки сточных вод и нефтезагрязненных грунтов // Известия Тульского государственного университета. Науки о Земле. 2020. Вып. 1. С.79-92.
19. Эмульгирующая активность некоторых углеводородокисляю-щих микроорганизмов / А.Ж. Бектурова [и др.] // Вестник КазНУ. Сер. Биологическая. 2013. №3/1(59). С. 56 - 58.
20. Валиев В. С., Иванов Д. В., Шагидуллин Р. Р. Нефтяные углеводороды в донных отложениях: состав, идентификация, механизмы трансформации (обзор) // Российский журнал прикладной экологии. 2020. №. 1(21). С.41-50.
Колотова Ольга Владимировна, канд. техн. наук, доц., [email protected], Россия, Волгоград, Волгоградский государственный технический университет,
Могилевская Ирина Владимировна, канд. биол. наук, доц., [email protected], Россия, Волгоград, Волгоградский государственный технический университет,
Владимцева Ирина Владимировна, д-р биол. наук, проф., [email protected], Россия, Волгоград, Волгоградский государственный технический университет,
Ермоловский Алексей Владимирович, канд. техн. наук, нач. отдела анализа нефти [email protected], Россия, Волгоград, ООО «НИПИморнефть»
THE DESTRUCTION'S EFFICIENCY RESEARCH OF PRIORITY ORGANIC POLL UTANTS BY MICROORGANISMS
I. V. Mogilevskaya, O. V. Kolotova, I. V. Vladimtseva, A. V. Ermolovsky
Isolation from environmental objects and selection of effective microorganisms-destructors of common organic pollutants were carried out. The growth rates of the obtained microbial strains and their destructive activity against petroleum hydrocarbons, lipids and phenols were studied. The greatest activity among the studied 18 phenol-oxidizing strains was shown by VGTU-13, among 10 lipolytic strains- by VGTU-02, these strains are active destructors of petroleum hydrocarbons according to the results of the studies. The possibility of using phenol-oxidizing and lipolytic bacterial strains for biological purification wastewater from oil pollution was shown.
Key words: petroleum products, bacterial strains, phenols, lipids, destructors, organic pollutants.
Kolotova Olga Vladimirovna, candidate of technical sciences, docent, olgakolotova@mail. ru, Russia, Volgograd, Volgograd State Technical University,
Mogilevskaya Irina Vladimirovna, candidate of biological sciences, docent, mogi-irina@yandex. ru, Russia, Volgograd, Volgograd State Technical University,
Vladimtseva Irina Vladimirovna, doctor of biological sciences, professor, alexvlad32@yandex. ru, Russia, Volgograd, Volgograd State Technical University,
Ermolovsky Aleksey Vladimirovich, candidate of technical sciences, head of oil analysis department, [email protected], Russia, Volgograd, OOO «VolgogradNIPImorneft»
Reference
1. Kurapov A. A., Uerbaeva R. I., Gridneva V. V. Microorganisms in the processes of oil destruction in reservoirs.: ecology, development. 2015. Vol. 5. no. 4. pp. 86-88.
2. Kulikova I. Yu. Microbiological assessment of the waters of the Northern Caspian Sea in the conditions of the development of hydrocarbon deposits. 2005. Vol. 8.
3. Galimova R. Z., Shaikhiev I. G. Purification of phenol-containing wastewater by native and modified adsorption materials based on agricultural and industrial production waste/ / Belgorod-Kazan, 2018. 96 p.
4. Korshenko A. N. Quality of sea waters by hydrochemical indicators. 2015.
5. Theoretical and practical aspects of the problem of biological oxidation of hydrocarbons by microorganisms / A.V. Bryanskaya [et al.] // Vavilovsky Journal of Genetics and Breeding. 2015. Vol. 18. no. 4/2. p. 999-1002.
6. Development of a biosorbent based on crop production waste for wastewater treatment from petroleum products / O. V. Kolotova [et al.] // Bulletin of the Perm National Research Polytechnic University. Applied Ecology. Urban studies. 2018. № 4 (32). C. 58-71.
7. Isolation and study of lipid-oxidizing microorganisms-inhabitants of the Northern Caspian Sea / O. V. Kolotova [et al.] //Bulletin of the Kazan Technological University. 2017. Vol. 20. no. 6. pp. 135-138.
8. Research of phenol-oxidizing bacterial strains isolated from the water area of the Northern Caspian Sea / I. V. Sokolova [et al.] /Bulletin of the Kazan Technological University. 2017. Vol. 20. no. 10. pp. 119-123.
9. Korenman, I. M. Photometric analysis. Methods for the determination of organic compounds. M: Chemistry. 1970. 343c.
10. Harborne J. Biochemistry of phenolic compounds. TRANS. from English. / ed. M. Emanuel. Moscow: Mir, 1968. 448c.
11. The selection, cultivation, and study of the basic properties of Fe-holocyclus microorganisms with the aim of obtaining a biological product for the biological treatment of industrial waste water / I. V. Sokolov [et al.] / / Coll. nauch. Tr.V mezhdunar. Conf. School of Chemical Technology HT ' 16; satellite conference of the XX Mendeleev Congress on General and Applied Chemistry (Volgograd, May 16-20, 2016). In 3 vol. t. 3 / VolgSTU [et al.]. Volgograd, 2016. p. 228-230.
12. Chudakova O. G., Zhelovitskaya A.V., Beskrovny D. V. Wastewater treatment of meat processing enterprises // Vestnik Kazanskogo tekhnologicheskogo universiteta. 2016. Vol. 19. No. 22. Pp. 182-186.
13. Zolotarev P. N. Assessment of pathogenic bacteria under the action of phytosub-stances (for example lipolytic activity) // Siberian medical journal, 2015. No. 6. P. 130 - 132.
14. Ruban E. L, Ksandopulo G. B., Murzin, L. P. Terms of the biosynthesis of aksel-erasi fungus Oospora fl agrans. // Applied biochemistry and Microbiology, 1978. T. 14. Vol.6 Pp. 849 - 857.
15. The influence of the composition of the medium on the biosynthesis and properties of ecolips MIK-of reorganiza / J. I. Sviridenko [et al.] // Microbiology, 1978. T. 47. Vol.5. P. 677-682.
16. Oil-oxidizing activity and identification of microorganisms MOV, isolated from the Caspian Sea / E. R. Faizulin [et al.] // Biology and medicine serialy. 2014. pp. 25-29.
17. Evaluation of the hydrophobic properties of bacterial cells by adsorption on the surface of chloroform droplets. / E. V. Serebryakova [et al.] // Microbiology. 2002. Vol. 71, no. 2. pp. 237-239.
18. Kolotova O. V., Mogilevskaya I. V., Vladimtseva I. V. Isolation, selection and application of hydrocarbon-oxidizing microorganisms for wastewater treatment and oil-contaminated soils // Izvestiya Tulskogo gosudarstvennogo universiteta. Earth Sciences. 2020. Issue 1. pp.
79-92. 19. Emulsifying activity of some hydrocarbon-oxidizing microorganisms / A. Zh. Bekturova [et al.] // Vestnik KazNU. Ser. Biological. 2013. No. 3/1(59). pp. 56-58.
20. Valiev V. S., Ivanov D. V., Shagidullin R. R. Oil hydrocarbons in bottom sediments: composition, identification, mechanisms of transformation (review) // Russian Journal of Applied Ecology. 2020. No. 1(21). pp. 41-50.
