CC BY
8
STUDY OF THE DYNAMICS OF REPRODUCTION OF M. LEPRAE UNDER THE CONDITIONS OF APPLICATION OF ANISEED LOFANT EXTRACT OBTAINED FROM SUPERCRITICAL FLUID EXTRACTION METHOD
Yurtaeva1 E.A., Luzhnova1 S.A., Tyrkov2A.G.
'Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University, Pyatigorsk, Russian Federation
2Astrakhan State University, Astrakhan, Russian Federation
ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ РАЗМНОЖЕНИЯ M.LEPRAE В УСЛОВИЯХ ПРИМЕНЕНИЯ ЭКСТРАКТА ЛОФАНТА АНИСОВОГО, ПОЛУЧЕННОГО МЕТОДОМ СВЕРХКРИТИЧЕСКОЙ ФЛЮИДНОЙ ЭКСТРАКЦИИ
Юртаева1 Е.А., Лужнова1 С.А., Тырков2А.Г.
'Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБУ ВО ВолгГМУ, г. Пятигорск, Российская Федерация
2 ФГБОУ ВО «Астраханский государственный университет», г. Астрахань, Российская Федерация
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
RESEARCH ARTICLE | НАУЧНАЯ СТАТЬЯ
©Yurtaeva E.A., Luzhnova S.A., Tyrkov A.G., 2021
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2021-23-7-38-43
Принята 10.07.2021 | Accepted 10.07.2021
Abstract. One of the ways to solve the problem of drug resistance in the therapy of infectious diseases is to develop herbal preparations with high antibacterial activity, which have a good drug safety profile, is extremely significant for long-term therapy, the use of which could complement and improve the used combination therapy regimens. The aim of our study was to study the anti-leprosy activity of lofant anise extract obtained by supercritical fluid extraction using CO2 containing phenolic compounds such as gallic acid, coumarin, umbelliferon, luteolin, quercetin, taxifolin, rutin. Materials and methods. The anti-leprosy activity had been studied on Shepard's model. Blood parameters were examined on a SYSMEXXT - 2000i hematological analyzer (Japan). Conclusion. Lofant anise extract, obtained by supercritical fluid extraction using CO2, has a bacteriostatic effect on M. leprae, which is not only comparable to the effect of dapsone, but also with a more
Аннотация. Одним из путей решения проблемы лекарственной резистентности при терапии инфекционных заболеваний, является разработка фитопрепаратов с высокой противомикробной активностью, обладающих хорошим профилем лекарственной безопасности, что особенно важно при длительном лечении, применение которых могло бы дополнить и усовершенствовать применяемые схемы комбинированной терапии. Целью нашего исследования явилось изучение противолепрозной активности экстракта лофанта анисового, полученного методом сверхкритической флюидной экстракции с применением СО2, содержащего фенольные соединения такие, как кверцетин, лютеолин, галловая кислота, кумарин, умбеллиферон, таксифолин, рутин. Материалы и методы. Исследование противолепрозной активности
prolonged course exceeding it. Unlike the drug of choice (dapsone), the extract, when administeredfor 30 days, does not cause changes in red blood parameters and does not cause neutropenia. The identified effects actualize further research of the extract for the development of dosage forms based on it for practical health care.
Keywords: Lofant anise extract, flavonoids, anti-leprosy activity, toxicity, blood parameters.
REFERENCES
[1] Maslov A.K., Nazarova G.N., Suhenko L.T. Method of treatment of experimental leprosy infection. Russian Patent No 2467742. Patent holder of the Federal State Budgetary Institution "Research Institute for the Study of Leprosy" of the Ministry of Health of the Russian Federation. 2012. Byul. No. 33.
[2] Chelpachenko O.E., Perunova N.B., Ivanova E.B., Andrjushhenko S.V., Danilova E.I., Fedotova L.P. Microbiological aspects of antimycotic phytotherapy (review) // Problems of medical mycology, 2014, vol. 16, no. 3. - P. 13-19.
[3] Yurtaeva E.A., Remezova I.P., Tyrkov A.G., Luzhnova S.A., Popova O.I. Dry extract of aniseed lofant leaves: preparation and analysis of phenolic compounds // Pharmacy. 2019. Vol. 68. no. 2. P. 2832.
[4] Wozel G., Blasum C. Dapsone in dermatology and beyond. Archives of Dermatological Research. 2014. 306 (2), 103-124. DOI: 10.1007 / s00403-013-1409-7.
[5] European parliament and of the council of 11 February 2004 on the inspection and verification of good laboratory practice (GLP) // Official J. of the Europ.Union. 2004. № EU 2004/9/EC. P. 29-43.
осуществляли на модели Shepard C.C. Показатели крови исследовали на гематологическом анализаторе SYSMEXXT- 2000i (Япония). Заключение. Экстракт лофанта анисового, полученный методом сверхкритической флюидной экстракции с применением СО2, оказывает бактериостатическое действие на M. leprae, которое не только сопоставимо с действием дапсона, но и при более длительном курсе, превосходящем его. В отличие от препарата выбора (дапсона) экстракт при 30-и дневном введении не вызывает изменений показателей красной крови и не вызывает нейропении. Выявленные эффекты актуализируют дальнейшие исследования экстракта для разработки на его основе лекарственных форм для практического здравоохранения.
Ключевые слова: экстракт лофанта анисового, флавоноиды, противолепрозная активность, токсичность, показатели крови.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
[1] Маслов А.К., Назарова Г.Н., Сухенко Л.Т. Способ лечения экспериментальной лепрозной инфекции // Патент РФ № 2467742. Патентообладатель ФГБУ «Научно-исследовательский институт по изучению лепры» Минздрава России. 2012. Бюл. № 33
[2] Челпаченко О.Е., Перунова Н.Б., Иванова Е.Б., Андрющенко С.В.. Данилова Е.И., Федотова Л.П. Микробиологические аспекты антимикотической фитотерапии (обзор)// Проблемы медицинской микологии. 2014. Т. 16. №3. С.13-19.
[3] Юртаева Е.А., Ремезова И.П., Тырков А.Г., Лужнова С.А., Попова О.И. Сухой экстракт листьев лофанта анисового: получение и анализ фенольных соединений // Фармация. 2019. Т. 68. №2. С.28-32.
[4] Wozel G., Blasum C. Dapsone in dermatology and beyond. Archives of Dermatological Research. 2014. 306 (2), 103-124. DOI: 10.1007 / s00403-013-1409-7.
[5] European parliament and of the council of 11 February 2004 on the inspection and verification of good laboratory practice (GLP) // Official J. of the Europ.Union. 2004. № EU 2004/9/EC. P. 29-43.
Authors Contributions. Yurtaeva E. A.-collection and processing of the material; Luzhnova S. A. - analysis of materials,
writing the text; Tyrkov A. G.-concept and design of the study.
Conflict of Interest Statement. The authors declare no conflict of interest.
Yurtaeva E.A. - SPIN ID: 49 79-0783; ORCID ID 0000-0002-1639-1881
Research interests, number of main publications: preparation and study of antimicrobial activity of substances of synthetic and plant origin, more that 58 publications were published, 20 in the Higher Attestation Commission, 10 of them in Scopus/Web of Science, patents 5.
Luzhnova S.A. - SPIN ID: 4312-6200; ORCID ID 0000-0002-6952-0974
Research interests, number of main publications: investigation of the effect of plant and synthetic substances on the growth and viability of microorganisms, more that 185 publications were published, 56 in the Higher Attestation Commission, 21 of them in Scopus/Web of Science, patents 6. Tyrkov A.G. - SPIN ID: 4953-7707; ORCID ID 0000-0003-3229-5248
Research interests, number of main publications: production of new compounds and intermediates, isolation of biologically active substances from plant raw materials that have biological activity, more that 257 publications were published, 124 in the Higher Attestation Commission, 55 of them in Scopus/Web of Science, patents 33.
Вклад авторов. Юртаева Е.А.- сбор и обработка материала; Лужнова С.А.- анализ материалов, написание текста, Тырков А.Г. - концепция и дизайн исследования.
Заявление о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Юртаева Е.А. - SPIN ID: 49 79-0783; ORCID ID: 0000-0002-1639-1881
Сфера научных интересов, количество основных публикаций: получение и изучение противомикробной активности субстанций синтетического и растительного происхождения. Опубликовано - 58, из них ВАК -20, Scopus/Web of Science -10, патентов - 5.
Лужнова С.А. - SPIN ID: 4312-6200; ORCID ID: 0000-0002-6952-0974
Сфера научных интересов, количество основных публикаций: Исследование влияния растительных и синтетических субстанций на процессы роста и жизнеспособности микроорганизмов. Опубликовано 185, из них ВАК-56, Scopus/ Web of Sceinse -21, патентов- 6.
Тырков А.Г. - SPIN ID: 4953-7707; ORCID ID: 0000-0003-3229-5248
Сфера научных интересов, количество основных публикаций: получение новых соединений и полупродуктов, выделение биологически активных веществ из растительного сырья, обладающих биологической активностью. Опубликовано 257, из них ВАК- 124, Scopus/ Web of Sceinse - 55, патентов 33.
For citation: Yurtaeva E.A., Luzhnova S.A., Tyrkov A.G. STUDY OF THE DYNAMICS OF REPRODUCTION OF M. LEPRAE UNDER THE CONDITIONS OF APPLICATION OF ANISEED LOFANT EXTRACT OBTAINED FROM SUPERCRITICAL FLUID EXTRACTION METHOD // Medical & pharmaceutical journal "Pulse". - 2021. -№7. Vol. 23. - C 38-43. Doi: http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2021-23-7-38-43.
Для цитирования: Юртаева Е.А., Лужнова С.А., Тырков А.Г. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ РАЗМНОЖЕНИЯ M.LEPRAE В УСЛОВИЯХ ПРИМЕНЕНИЯ ЭКСТРАКТА ЛОФАНТА АНИСОВОГО, ПОЛУЧЕННОГО МЕТОДОМ СВЕРХКРИТИЧЕСКОЙ ФЛЮИДНОЙ ЭКСТРАКЦИИ // Медико-фармацевтический журнал "Пульс". - 2021. - №»7. Т. 23. - С. 38-43 Doi: http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2021-23-7-38-43.
Введение. Ежегодно в мире, по данным ВОЗ, выявляют около 300 тыс. новых случаев заболевания лепрой. На территории Российской Федерации более 90% всех зарегистрированных больных приходится на эндемичные районы -Нижнее Поволжье и Северный Кавказ.
Большое значение имеет проблема лекарственной резистентности (ЛР). Появление микобактерий лепры, устойчивых к применяемым антибактериальным
лекарственным препаратам, значительно снижает эффективность антибактериальной терапии. Кроме этого, у препаратов, применяемых для лечения данной инфекции, имеется множество противопоказаний и тяжелых побочных эффектов. При широком спектре активности, дапсон, являющийся препаратом выбора, обладает большим количеством негативных побочных эффектов, обусловленных
формированием в ходе его метаболизма гидроксиламин - производных. Он противопоказан при гиперчувствительности, в том числе к сульфаниламидам, при нарушении функции печени, тяжелой анемии, дефиците глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФД) или метгемоглобинредуктазы; может вызвать метгемоглобинемию, гемолитическую анемию, дозозависимый гемолиз с понижением уровня гемоглобина и повышением числа ретикулоцитов (у всех больных), агранулоцитоз, гипопластическую анемию и др. [4].
Поиск новых высокоэффективных препаратов в отношении M. leprae, обладающих хорошим профилем лекарственной безопасности, что особенно важно при длительном лечении (годы), остается крайне актуальным. Одним из путей решения данной проблемы, на наш взгляд, может быть разработка фитопрепаратов с
высокой противомикробной активностью, применение которых могло бы дополнить и усовершенствовать применяемые схемы комбинированной терапии [1]. Немаловажное значение в этом отношении имеют такие факторы, как широкий спектр действия, разносторонняя направленность, хорошая совместимость с синтетическими препаратами и минимальный побочный эффект при длительном применении.
Масс-спектр экстракта лофанта анисового, полученного методом
сверхкритической флюидной экстракции с применением СО2 [3], показал достаточно выраженные молекулярные ионы галловой кислоты, кумарина, умбеллиферона, лютеолина, кверцетина, таксифолина, рутина, а также ионы различной интенсивности, характеризующие структуры этих веществ. Количественное определение суммы флавоноидов в экстракте, проведенное посредством дифференциальной спектрофотометрии по реакции
комплексообразования, позволило установить, что в экстракте содержится 58,45-60,90% суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин.
Известно, что «флавоноиды
синтезируются растениями в ответ на микробное инфицирование». Они способны встраиваться в клеточные стенки бактерий, нарушая их целостность, что способствует подавлению их росту и размножению [2].
Целью нашего исследования явилось изучение противолепрозной активности лофанта анисового листьев экстракта сухого, полученного методом сверхкритической флюидной экстракции с применением СО2.
Материалы и методы исследования.
Исследование противолепрозной активности осуществляли на модели Shepard C.C. [1]. Использовали 80 мышей (самцы) весом 18-22 г линии Balb/с (питомник ФГБУ «НИИ по изучению лепры» МЗ РФ, г. Астрахань). Животных содержали в контролируемых условиях вивария при свободным доступе к воде на стандартном пищевом рационе. Исследование противолепрозной активности проводили на базе ФГБУ «Научно-исследовательский институт по изучению лепры» Министерства
здравоохранения России, г. Астрахань.
Животных заражали M. leprae, III пассаж от б-го Ш.: каждой особи интраплантарно вводили 0,03 мл суспензии, которая содержала
104 микробных тел. Вводить изучаемый экстракт и препарат сравнения (дапсон - основной противолепрозный препарат) начинали на следующий день после заражения. Через 4 и 7 месяцев из каждой группы забивали посредством хлороформного наркоза 10 особей, отсекали правую заднюю лапу. Из мякоти подушечки лапы готовили суспензию для подсчёта микобактерий. Подсчёт количества микобактерий проводили под микроскопом с использованием иммерсии в 20 полях зрения по диаметру каждого круга: из суспензии каждой особи готовили по 3 препарата, суммарно просчитывали 60 полей зрения. Общее количество микобактерий в суспензии рассчитывали по формуле:
КУМ
Сумма КУМ в 60 полях зрения 1,0мл л"й2 60 (число сосчитанных полей зрения)' 10 мкл' тсй1 ,
где КУМ - количество кислотоустойчивые микобактерии в 1,0 мл, Ri - радиус круга, нанесенного на предметное стекло, R2 - радиус поля зрения микроскопа.
Дапсон животным в дозе 25 мг/кг вводили вместе с кормом (максимально эффективная доза, сопоставимая по воздействию с дозой, применяемой при лечении дапсоном больных лепрой людей - 100 мг в сутки). Экстракт лофанта вводили через зонд в желудок в дозах 25; 50 мг/кг веса в пересчете на лютеолин.
Исследование токсичности экстракта при хроническом введении выполнено на 80 нелинейных крысах самцах и самках, весом 320340 г и 280-310 г, соответственно. Животные содержались в стандартных условиях вивария и были синхронизированы по времени введения экстракта, питанию, освещению, температуре и влажности воздуха. Крысы каждого пола были разделены на 4 группы: 1 - контроль (получали в качестве плацебо воду), 2, 3, 4 - получали экстракт лофанта анисового в дозе 25; 50; 100 мг/кг (в пересчете на лютеолин). Экстракт и плацебо животным вводили через зонд в желудок один раз в день в период с 10 до 11 часов в течение 30 дней. По завершению эксперимента крыс забивали декапитацией под хлороформным наркозом, забирали кровь. Показатели крови исследовали на гематологическом анализаторе SYSMEX XT - 2000i (Япония). Определяли: RBC (количество эритроцитов, х1012/л), HGB (концентрация гемоглобина, г/л), HCT (показатель гематокрита: доля объема крови, занимаемая эритроцитами, %), МСУ(средний
объем эритроцита, фл), MCH (среднее содержание гемоглобина в эритроците, пгр), MCHC (средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах, г/л), Я^^СУ(расчетная ширина распределения эритроцитов по объему, коэффициент вариации, %); WBC (количество лейкоцитов, 109/л), NEUT (относительное количество нейтрофилов,%),
LYMPH(относительное количество
лимфоцитов, %), MONO (относительное количество моноцитов,%), ЕО (относительное количество эозинофилов,%), BASO
(относительное количество базофилов,%). Все манипуляции с животными проводили согласно правилам GLP [5].
Статистическую обработку результатов осуществляли, используя «BIOSTAT 2009» (AnalystSoft Inc., США), используя t - критерий Стьюдента.
Результаты и обсуждение. Результаты исследования противолепрозной активности экстракта представлены в таблице 1.
Таблица 1
Динамика размножения М. leprae в подушечках лап мышей (кол-во х108/мл)
Группы Длительность введения
4 мес. 7 мес.
Контроль (без лечения) 2,62±0,15 744,5±226,2
Дапсон, 25 мг/кг 0,77± 0,16*** 75,1±12,08***
Экстракт, 50 мг/кг 0,12±0,04***### 7,14±0,31***###
Экстракт, 100 мг/кг 0,23±0,02***### 8,03±0,28***###
Примечание. **- Рк<0,01;***- Рк <0,001 относительно контроля; ### - Рд<0,001 относительно дапсона.
Table 1
Reproduction dynamics of M. leprae in mouse paw pads (number x 108/ml)
Groups The period of the administration
4 months 7 months
Control (without treatment) 2,62±0,15 744,5±226,2
Dapsone, 25 mg/kg 0,77± 0,16*** 75,1±12,08***
Extract, 50 mg/kg 0,12±0,04***### 7,14±0,31***###
Extract, 100 mg/kg 0,23±0,02***### 8,03±0,28***###
Note. **- Pc<0, 01;***- Pc <0,001 regarding control; ### - Pd<0,001 regarding dapsone.
Как видно из таблицы, у мышей, не получавших лечения, среднее количество микобактерий в лапах через 4 и 7 месяцев с начала эксперимента было более чем на два и четыре порядка, соответственно, выше. В группах, получавших дапсон и экстракт лофанта в обеих дозах наблюдали статистически достоверное угнетение процесса размножения микобактерий. Действие экстракта при этом было более эффективно и не зависело от концентрации экстракта (табл. 1).
Результаты исследования показателей периферической крови крыс (самцов и самок) при введении экстракта в течение 30 дней свидетельствуют, что введение крысам экстракта
оказывает дозозависимое влияние на показатели белой крови. У самцов наблюдается повышение процентного содержания нейтрофилов, статистически значимое при использовании экстракта в дозе 100 мг/кг, в этой же группе более чем в два раза снижается доля моноцитов, наблюдается тенденция к понижению содержания эозинофилов. При применении экстракта в дозе 25 мг/кг выявлено статистически достоверное повышение доли моноцитов. У самок достоверных изменений показателей белой крови не наблюдали (табл. 2). Статистически значимых изменений параметров красной крови не выявлено.
Таблица 2
Показатели лейкограммы у экспериментальных крыс
Группы Показатели
WВС,109/л LYMPH, % NEUT, % MONO., % ЕО, % BASO, %
самцы
Контроль (вода) i0,3±2,i 60,6±8,4 24,8±i,7 6,0±i,0 3,4±0,9 0,i±0,09
Экстракт, 25мг/кг 7,5±3,6 5i,0±ii,6 36,3±5,5 i0,6±3,i* 3,7±0,4 0,03±0,05
Экстракт, 50мг/кг i3,5±2,9 54,6±7,i 32,8±4,8 9,i±i,8 3,3±0,7 0,2±0,2
Экстракт, 100мг/кг 9,9±5,i 53,7±i2,2 40,3±6,i* 2,4±0,7** 2,5±i,6 0,i±0,i
самки
Контроль (вода) 8,i±4,8 58,4±3,9 34,i±3,4 4,3±3,2 3,0±0,i 0,i±0,i
Экстракт, 25 мг/кг 7,4±i,6 58,4±8,3 3i,7±4,7 6,7±4,6 3,i±0,6 0,i±0,i
Экстракт, 50 мг/кг 8,6±3,3 5i,i±6,6 33,4±4,i 5,i±3,i 3,i±i,3 0,2±0,i5
ЭкстрактД00 мг/кг 6,3±i,8 63,0±7,6 27,i±7,i 6,8±4,3 2,8±i,2 0,i±0,i
Примечание. * - p <0,05; ** - p <0,01 - 05 - относительно контроля.
Table 2
Leukogram parameters in experimental rats
Groups Parameter
WВС,109/л LYMPH, % NEUT, % MONO, % ЕО, % BASO, %
males
Control (water) i0,3±2,i 60,6±8,4 24,8±i,7 6,0±i,0 3,4±0,9 0,i±0,09
Extract, 25 mg/kg 7,5±3,6 5i,0±ii,6 36,3±5,5 i0,6±3,i* 3,7±0,4 0,03±0,05
Extract, 50 mg/kg i3,5±2,9 54,6±7,i 32,8±4,8 9,i±i,8 3,3±0,7 0,2±0,2
Extract, 100 mg/kg 9,9±5,i 53,7±i2,2 40,3±6,i* 2,4±0,7** 2,5±i,6 0,i±0,i
females
Control (water) 8,i±4,8 58,4±3,9 34,i±3,4 4,3±3,2 3,0±0,i 0,i±0,i
Extract, 25 mg/kg 7,4±i,6 58,4±8,3 3i,7±4,7 6,7±4,6 3,i±0,6 0,i±0,i
Extract, 50 mg/kg 8,6±3,3 5i,i±6,6 33,4±4,i 5,i±3,i 3,i±i,3 0,2±0,i5
Extract, 100 mg/kg 6,3±i,8 63,0±7,6 27,i±7,i 6,8±4,3 2,8±i,2 0,i±0,i
Note. * - p <0, 05; ** - p <0, 01 - 05 - regarding control.
Заключение. Экстракт лофанта анисового, полученный методом сверхкритической флюидной экстракции с применением СО2, в условиях in vivo, обладает выраженной противолепрозной активность: оказывает бактериостатическое действие на M. leprae, которое не только сопоставимо с действием дапсона, но и при более длительном курсе,
превосходящем его. В отличие от препарата выбора (дапсона) экстракт при 30-и дневном введении не вызывает изменений показателей красной крови и не вызывает нейропении. Выявленные эффекты актуализируют дальнейшие исследования экстракта для разработки на его основе лекарственных форм для практического здравоохранения.
Corresponding Author: Yurtaeva Ekaterina Alekseevna - Teacher of the Department of Microbiology and Immunology with a course in biological Chemistry, Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute-branch of the Federal State Budgetary Institution of Higher Education of the Russian Ministry of Health, Pyatigorsk, Russian Federation
E-mail: tyrkova. katerina@yandex. ru
Ответственный за переписку: Юртаева Екатерина Алексеевна -преподаватель кафедры микробиологии и иммунологии с курсом биологической химии, Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБУ ВО ВолгГМУ Минздрава России, г.
Пятигорск, Российская Федерация
E-mail: tyrkova. katerina@yandex. ru
