ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЕТОРОЛАКА В МОЧЕ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гуськова ТА. Токсикология лекарственных средств. М.: НП «ТЭМП», 2008.

2. Илябаев К. З., Камаев Ф. Г., Выпова Н. Л., Юлдашев А. М., Ибрагимов Б. Т., Талипов С. А. Синтез, структура и «острая» токсичность несимметричных альдегидных производных госсипола. / Биоорганическая химия, 2010. -Т. 36. - № 3. - С. 423-428.

3. Методические рекомендации по изучению репродуктивной токсичности лекарственных средств. / Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 1. - М.: Изд. «ФГБУ НЦЭСМП», 2012. - С. 80-93.

4. Нестеренко В.Г., Сергеева Э.М. Профилактика гриппа и других ОРВИ среди групп населения высокой степени

риска инфицирования. Интерферон - 2011. //Сборник научных статей. М., 2012. - С. 225-231.

5. Оспельникова Т.П., Полонский В.О., Наровлянский А.Н. и др. Эффективность Кагоцела при хроническом рецидивирующем генитальном герпесе. // Клиническая фармакология и терапия, 2004. - № 2. - С. 74-76.

6. An T, Ouyang W, Pan W, Guo D. , Li J, Li L, Chen G, Yang J, Wu S, Tien P. Amino acid derivatives of the (-) enantiomer of gossypol are effective fusion inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 / Antiviral Res. 2012 Jun; 94(3):276-87.

7. European Food Safety Authority. Scientific opinion. Gossypol as undesirable substance in animal feed. Scientific Opinion of the Panel on Contaminants in the Food Chain (Question No EFSA-Q-2005-222). Adopted on 4 December 2008 // The

EFSA Journal. - 2008. - Vol. 908. - P. 1-55.

8. Huang J.X., Zhao SX., Gu Z.P., Zhu Y.Q., JiR.Y. Studies on the synthesis of gossypol derivatives and their anti-fertility action //Shengzhi Yu Biyun. 1986. - Vol. 6. - № 1. - P. 48-52.

9. Juanjuan Yin. Chemical modification and biological activity exploration of the natural product-gossypol / A Dissertation for the Degree of Doctor of Philosophy The Graduate School of Clemson University. - August 2010.

10. Kalliopi D. Investigations on gossypol: past and present developments / Expert Opin. Investig. Drugs. - 2005. - Vol.14. - № 11. - P.1419-1434.

S.P. Rybalkin1, Ye.V. Kovalyova1, T.A. Guskova2, T.B. Savinova2 Experimental evaluation of the Kagocel preparation effect on the animals generative function

1Research Center for Toxicology and Hygiene Regulation of Biopreparations, Federal Medico-.Biological Agency, settlement Bolshevik, Moscow Region 2 Institute of General Pathology and Pathophysiology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

In experiments on white rats, the influence of the anti-virus preparation Kagocel on the generative function was studied. It was found out that a long-lasting daily peroral administration of this preparation to experimental animals did not produce an adverse effect on animals gonads and their fertility which is proved out by results of morphological analysis of testicles and spermatozoons functional status in males, as well as by results of the evaluation of the preparations exposure on embryogenesis and on the offspring of rats to which the preparation was long administrated during the premating period.

Материал поступил в редакцию 24.07.2012 г

УДК 615.034.61 (21)

Исследование динамики изменения концентрации кеторолака в моче

1 М.С. Саркисян*, !Д.С. Лазарян, 2Л.С. Зарбежан, 2Н.Н. Самарскова

'ГБОУ Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России 2БГУ РО «Наркологический диспансер»

Кеторолак - один из наиболее широко применяемых анальгетиков. При определённых условиях он может вызвать острые отравления, в том числе со смертельным исходом. В связи с этим разработаны методики его изолирования, идентификации (методы ТСХ, ГХ/МС, ВЭЖХ) и количественного определения (метод ВЭЖХ) в моче. При этом нами была решена задача по изучению динамики изменения концентрации в моче. В результате исследования установлено, что наибольшая концентрация кеторолака в моче достигается через 5 часов, а факт наличия кеторолака в моче можно установить с помощью разработанной схемы анализа в течение 27 часов.

Ключевые слова: кеторолак, анальгетики, моча, динамика выведения, анализ.

Введение. Кеторолак - один из наиболее широко применяемых препаратов обладающий анальгетическим, противовоспалительным и жаропонижающим действием. В качестве аналь-гетического препарата кеторолак применяется для снятия абстинентного синдрома, а также для уменьшения дозировки наркотических средств. Кроме того, он наряду с другими анальгетиками в сочетании с наркотическими средствами используется наркозависимыми субъектами. Однако при повышенной чувствительности организма, передозировке и злоупотреблении как индивидуальное, так и сочетанное применение кеторолака может приводить к тяжелым отравлениям, в том числе и со смертельным исходом [1, 2, 3]. В изучаемой нами литературе имеются сведения о разработке методик идентификации и количественного определения ке-торолака в биологических жидкостях в присутствии ряда лекарственных веществ, различных фармакологических групп [4, 5]. Представляет интерес разработка схемы химико-токсикологического анализа при комбинированных отравлениях кеторолака с некоторыми анальгетиками. При этом важное значение имеет для экспертов судебно-химических и химико-токсикологических лабораторий информация о динамике выведения лекарственного вещества из организма человека.

Целью настоящего исследования явилось изучение динамики изменения концентрации кеторолака в моче в течение продолжительного времени после приёма. В связи с чем нами поставлена задача на первом этапе исследования изучить динамику выведения кеторолака

38

из организма.

Материалы и методы исследования, результаты и обсуждения. Определение динамики изменения концентрации кеторолака в моче в течение 27 часов проводили на практически здоровых, не принимавших никаких лекарственных препаратов добровольцах (6 человек). Добровольцы утром, после еды, принимали по 1 таблетке (разовая доза - 10 мг) кеторолака (производства «Д-р Редди'с Лабораторис Лтд») и запивали водой из расчета 1мг/10мл, т.е. 100 мл. Затем отбирались пробы мочи через определенные промежутки времени: 2, 5, 6, 14, 19 и 27 часов. Отбор пробы мочи проводился согласно приказу №40 МЗ РФ от 27.01.2006 г. «Об организации проведения химико-токсикологических исследований при аналитической диагностике наличия в организме человека алкоголя, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ». Для исследования собирали всю порцию мочи. Проба мочи собиралась в прозрачный стеклянный широкогорлый градуированный сосуд. До начала исследования пробы хранили в холодильнике при температуре 0-20С. В течение первых пяти минут проводили предварительное исследование мочи: температура исследуемой мочи находилась в пределах 32,5-37,7°С; значение рН среды в интервале 5,0-7,0 (по универсальному индикатору); относительная плотность - 1,009-1,013. Далее проводили изолирование кеторо-лака из мочи по разработанной ранее методике [6, 7, 8].

методика ^о^ивряш ^й&мл <мтви (е=ляетёя5ффраяйинЕ(Ш1дис сеертрацитшдррадной.

Токсикологический вестник м.2 (119)

кислоты, концентрированный до рН 2-3. Полученные смеси нагревали на кипящей водяной Полученные результаты позволяют сделать вывод, что прием большей дозировки кеторолака бане в течение 10 минут с воздушным холодильником. Затем смеси охлаждали до комнатной одновременно или в течение длительного времени повышает вероятность его идентификации температуры и экстрагировали двукратно хлороформом, объёмом, равным объёму водной и количественного определения, что очень важно при проведении химико-токсикологическо-фазы в течение 5 минут. Слой органического растворителя отделяли от водной фазы, объеди- го или судебно-химического анализа. няли и выпаривали в токе теплого воздуха до сухого остатка. Сухие остатки растворяли в 10 мл спирта этилового, делили на 4 аликвоты и исследовали.

Идентификацию кеторолака при этом проводили по ранее разработанным методикам: в качестве предварительного способа использовали метод ТСХ [7], а в качестве подтверждающих способов - хромогенные, микрокристаллоскопические реакции и метод ВЭЖХ [6, 8]. Кроме того, дополнительно для идентификации кеторолака был использован хромато-масс-спектрометрический метод (ГХ/МС). Предварительное исследование проводили методом ТСХ в оптимальных условиях [7]. Детектирование зоны адсорбции кеторолака можно проводить с помощью облучения УФ светом, парами йода, реактива Драгендорфа, 5%-ного раствора железа (III) хлорида, 5%-ного раствора ртути (II) сульфата в сочетании с 0,01%-ным раствором дифенилкарбозона в хлороформе. Результаты исследования представлены в таблице 1.

После предварительного исследования для идентификации кеторолака использовали несколько подтверждающих методов.

Идентификацию кеторолака в извлечениях из мочи проводили с помощью хромогенных и микрокристаллоскопических реакций. Хромогенные реакции проводили в фарфоровых чашках, а микрокристаллоскопические на предметных стеклах в присутствии 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты и без неё. К сухому остатку прибавляли 1 каплю реактива, предметные стёкла при этом помещали во влажные камеры. Результаты реакций наблюдали в течение 30 минут. Кроме того, в качестве подтверждающих методов идентификации кеторо-лака в извлечениях из мочи использовали методы ВЭЖХ и ГХ/МС.

Обнаружение кеторолака методом ВЭЖХ [6] проводили на приборе «Милихром А-02»

- хроматографическая колонка размером 2х75 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом ProntoSil 120-5C-18 AQ. Подвижная фаза: элюент А - 0,1% раствор трифторуксусной кислоты, элюент Б - ацетонитрил, скорость потока - 100 мкл/мин; аналитические длины волн

- 326 нм; время измерения - 0,18 сек; температура термостата колонки - комнатная; градиент от 10 до 20% за 10 мин, от 20 до 80% за 10 мин далее изократично, 80% ацетонитрила - 5 минут; общее время хроматографирования - 25 минут; объем пробы - 10 мкл. Результаты исследования представлены на рисунке 1.

Хромато-масс-спектральный анализ выполняли на газовом хроматографе Agilent 6850 c кварцевой капиллярной колонкой HP-5MS (30 м х 0,25 мм), неподвижной фазой служил 5%о-ный фенил-метил силоксан (толщина плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм). Газ носитель: гелий, расход через колонку постоянный - 1 мл/мин. Использовали три температурных режима колонки: от 80 до 1800С в течение 20 мин; от 180 до 2650С в течение 10 минут; от 265 до 2900С в течение 20 минут. Испаритель: режим без деления потока, продувка 50 мл/мин 0,5мин, температура 2500С, объем вводимой пробы 1 мкл. Температура интерфейса детектора 2900С. Детектор: масс-спектрометрический квадрупольный MSD 5975, тип ионизации: электронный удар (70эв), температура ионного источника - 2300С, масс-фильтра - 1500С. Наблюдали диапазон m/z 30-500. Идентификацию кеторолака проводили с помощью библиотеки масс-спектров NIST 2.0, применяя систему обработки хромато-масс-спектральной информации AMDIS, а также по времени удерживания. Результаты исследования представлены на рисунке 2.

Далее нами была изучена динамика выведения кеторолака из организма человека, используя для количественного его определения метод ВЭЖХ [6]. Полученные результаты подведены в таблице 2.

Полученные результаты после изолирования пересчитывали на 100 мл мочи и строили график зависимости концентрации кеторолака (мг/100мл) в моче от времени его распределения (рис. 3).

Таким образом, предложен способ предварительного исследования кеторолака в извлечениях из мочи методом ТСХ в оптимальных системах растворителей. Наиболее универсальными и чувствительными реагентами для кеторолака является УФ свет с последующей обработкой хроматографической пластины реактивом Драгендорфа. Предел обнаружения при этом составляет 0,5 и 1,0 мкг в пробе соответственно. При проведении химических реакций положительные результаты (характерное окрашивание) на кеторолак в извлечениях из мочи получены с реактивами Марки, Фреде, азотной кислотой, концентрированной с пределом обнаружения 2-10 мкг в пробе; характерные кристаллы получены с реактивом Драгендорфа по Тищенко, раствором йодидного комплекса свинца, с раствором ализаринового красного в уксусной кислоте, с раствором метилового оранжевого, с раствором индигокармина в уксусной кислоте. Предел обнаружения указанных реакций составляет 1-2 мкг в пробе. Используя метод ВЭЖХ, идентификацию кеторолака проводили по времени удерживания пика кеторо-лака в исследуемых пробах, которое соответствовало времени удерживания его стандартного образца (19,13±0,04 мин). Дополнительно используя метод ГХ/МС для идентификации кето-ролака в извлечениях из мочи, было достоверно подтверждено его наличие в исследуемых пробах по времени удерживания (tR =11,51±0,03 мин) и совпадению его масс-спектров (m/z 210; 134; 77,1; 105) с данными библиотеки спектров. С помощью вышеописанных методов нами идентифицирован и количественно определён кеторолак в моче добровольцев в течение 27 часов от времени приёма разовой терапевтической дозы (10 мг).

Выводы. Установлено, что максимальная концентрация кеторолака (0,26±0,02 мг/100 мл) в моче после перорального приёма разовой дозы (10 мг) наблюдается через 5 часов. Через 27 часов после приема содержание кеторолака в моче значительно снизилось. Но, несмотря на это, кеторолак в моче может быть достоверно обнаружен и количественно определён в течение вышеуказанного времени после перорального приема его разовой терапевтической дозы.

Таблица 1

Результаты хроматографирования кеторолака в тонком слое сорбента (n=6)

Подвижная фаза Соотношение растворителей Значение hRf кеторолака

Спирт этиловый - хлороформ -25%-ный раствор аммиака 50:46:4 55,0

Спирт этиловый - хлороформ 9:1 55,0

Толуол - спирт этиловый -уксусная кислота 75:20:5 61,0

39

Рис. 1 Хроматограмма извлечения из модельной пробы мочи, содержащей кеторолак

Рис. 2 Масс-спектр пика со значением времени удерживания (^=11,51 мин±0,03), идентифицированного как кеторолак

Рис. 3 Динамика изменения концентрации кеторолака в моче

40

Токсикологический вестник м.2 (119)

Таблица 2

Результаты количественного определения кеторолака в моче методом ВЭЖХ (n=3)

Биологическая жидкость Время распределения кеторолака, мг/100мл

2 часа 5 часов 6 часов 14 часов 19 часов 27 часов

Метрологические характеристики

Моча Xcp=0,067 Sx =0,0022 ÄX =0,006 сР 8 =±8,356% сР Xcp =0,262 Sx =0,007 ÄX =0,018 сР 8 =±7,071% сР Xcp =0,056 Sx<: =0,0013 ÄX =0,003 ср 8 =±6,076% ср Xcp =0,027 Sx<; =0,0007 ÄX =0,002 ср 8 =±7,073% ср Xcp =0,015 Sx =0,0003 äX =0,001 ср 8 =±5,976% ср Xcp =0,008 Sx<; =0,0002 дХ =0,001 ср 8 =±6,298% ср

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики на современном этапе / Под ред. В.А. Клевно // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященные 75-летию Российского центра судебно-медицинской экспертизы, 18-20 октября 2006 г. М.: РИО ФГУ «РЦСМЭ Росздрава», 2006. - С. 132-135.

2. Лебедева Р.Н. Фармакотерапия острой боли/ Лебедева Р.Н., Никода В.В. М.: Изд-во «Аир-Арт», 1998. - 184с.

3. Клиническая токсикология детей и подростков / Под ред. И.В. Марковой, B.B. Афанасьевой, Э.К. Цыбулькиной, M.B. Неженцевой. - СПб.: Интермедика. 1998. - Т.1. - 302 с.

4. Киреева А.В. Химико-токсикологическое исследование лекарственных веществ, применяемых в практике купирования абстинентного синдрома: Автореф. дис. ... канд. фармац. наук /А.В. Киреева. СПб., 2008 - 27с.

5. Петухова Н.Н. Идентификация нестероидного противовоспалительного средства кеторолака трометамина с применени-

ем метода тонкослойной хроматографии при химико-токсикологических исследованиях / Н.Н. Петухова, Т.Л. Малкова // Современные проблемы медико-криминалистических, су-дебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований: Сб. материалов научно.-практической конференции, посвященной памяти профессора Ю.М. Кубицкого, 31 октября - 1 ноября 2007 г. - С. 265-267. 6. Саркисян М.С. Дифференциальная диагностика отравлений некоторыми анальгетиками методами ТСХ и ВЭЖХ / М.С.

41

Саркисян // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Сб. научных трудов. Пятигорск, 2010. - Вып. 65. - С. 385-390. 7. Саркисян М.С. Идентификация некоторых анальгетиков методом тонкослойной хроматографии / М.С. Саркисян // Профессия и здоровье: Материалы VI Всероссийского кон-

гресса, 30 октября - 1 ноября. М.: Дельта, 2007 - С. 615-617. 8. Саркисян М.С. Применение хромогенных и микрокри-сталлоскопических реакций для идентификации некоторых анальгетиков / М.С. Саркисян, Д.С. Лазарян // О проблемных вопросах организации производства судебно-медицинских экспертиз: Сб. материалов Всероссийской научно.-прак-

тической конференции 5-6 ноября 2009 г. М.: РИО ФГУ РЦМСМЭ Минздравсоцразвития России, 2009. - С. 344-349.

M.S Sarkisyan1, D.S. Lazarjan1, L.S.Zarbezhan2, N.N. Samarskova2 Study on the dynamics of changes in ketorolak concentrations in urine

1Pyatigorsk State Pharmaceutical Academy 2Rostov-on-Don Narcological Clinic

Ketorolac is one of the most widely applied analgesics. Under certain conditions it can cause sharp poisonings including those with lethal outcome. In this connection methods of its isolation, identification (methods TLC, HPLC, GH/MS) and quantitative definition (method HPLC) in urine are developed. Along with it, the problem of investigation into the dynamics of concentrations changes in urine was solved. As a result of the research, it is established that the greatest concentration of ketorolac in urine is reached after 5 hours, and the presence of ketorolac in urine can be established by means of a developed analysis scheme within 27 hours.

Материал поступил в редакцию 02.08.2012 г

ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ

токсикология

УДК 574.5:615.9 (262.5)

Эколого-токсикологическое состояние северо-восточной части Черного моря (обзор)

Н.В. Морщинина,

М.В. Медянкина, Г.С. Зеленихина, СА. Соколова

ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии», г Москва

Приведен обзор эколого-токсикологического состояния северо-восточной части Черного моря по результатам исследований 1979-2010 гг. Показано, что резких изменений в содержании загрязняющих веществ в многолетнем аспекте в морской воде и донных отложениях не наблюдается. В настоящее время содержание нефтяных углеводов, ПАУ, пестицидов, тяжелых металлов остается на уровне прошлых лет.

Ключевые слова: северо-восточная часть Черного моря, токсиканты, антропогенное загрязнение.

Введение. В 1960 г. в рамках ЮНЕСКО была создана Межправительственная океанографическая комиссия с целью развития научных исследований океанов и морей, изучения их ресурсов, определения проблем, решение которых требует международного сотрудничества, организации международных экспедиций, содействия обмену океанографическими данными. Она дает следующее определение загрязнению моря: «Загрязнение моря - это непосредственное или косвенное внесение человеком веществ или энергии в морскую среду (в том числе в эстуарии), влекущее за собой такие неблагоприятные последствия, как нанесение ущерба биологическим ресурсам; опасность для здоровья людей; помехи для морских отраслей хозяйственной деятельности, включая рыболовство; уменьшение пригодности морской воды для использования и ухудшения эстетических достоинств морских ландшафтов». Также загрязнение - один из главных факторов, ограничивающих размещение марихозяйств и развитие промышленной марикультуры.

По данным «Единой государственной системы информации об обстановке в Мировом океане» (ЕСИМО) в период 1995-2001 гг. в прибрежных водах Черного моря сохранялась появившаяся в 1994 г. тенденция стабилизации уровня загрязненности вод, причем отмечается высокая степень однородности распределения как концентраций загрязняющих веществ, так и гидрохимических показателей среды [12].

Экологические проблемы окружающей среды, в том числе и загрязнение акватории

северо-восточной части Черного моря, освещаются на сайте http://www.eco-mir.net «Экология окружающей среды, экологические проблемы окружающей среды, пути и методы их решения» и находятся в рубрике «Проблемы Черного моря».

Систематические наблюдения за химическим загрязнением морей России (включая Черное море) с 1966 г. осуществляет Государственный океанографический институт (ГОИН), составляя ежегодные обзоры состояния морских вод.

С 1993 г. в системе Росрыболовства ежегодный эколого-токсикологический мониторинг северо-восточной части Черного моря проводит региональный институт Росры-боловства - «Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства» (ФГУП «АзНИИРХ») [5]. Проводимый мониторинг предусматривает изучение уровней загрязнения массовыми антропогенными токсикантами (хлорорганические пестициды, полихло-рированные бифенилы, тяжелые металлы, нефтепродукты, полициклические ароматические углеводороды) промысловых рыб и среды их обитания.

В восьмидесятые годы прошлого столетия на научные аспекты проблем загрязнения Черного моря обратил внимание Ю.П. Зайцев, занимаясь исследованием северо-западной части морской акватории [2]. В северо-восточной акватории Чёрного моря концентрации загрязняющих веществ отмечались значительно более низкие вследствие отсутствия рек со значительным стоком в этом регионе, а также крупных промышленных (кроме Но-

42