ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТАМИЗОЛА В МОЧЕ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 615.012-0.7

Химико-токсикологическое исследование метамизола в моче

Саркисян М.С.*, Лазарян Д.С.

ГБОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацефтическая академия» Минздравсоцразвития России, г Пятигорск

Разработаны методики изолирования метамизола из мочи, его идентификации и количественного определения с помощью химических (хромогенные и микрокристаллоскопические реакции) и физико-химических методов (методы ТСХ, ВЭЖХ). Комплексное использование указан-

ных методов позволяет достоверно диагностировать отравления метамизолом как индивидуально, так и в сочетании с другими анальгетиками.

Ключевые слова: метамизол натрия, анальгетики, отравления, анализ.

Введение. Анальгетики одни из наиболее часто применяемых лекарственных препаратов. Прием анальгетических средств довольно часто становится первым и наиболее легким способом управления стрессом и болью. Одним из наиболее известных и доступных болеутоляющих лекарственных средств - метамизол (метамизол натрия), широко используемое для купирования боли как индивидуально, так и в лекарственных формах сложного состава («Андипал», «Темпал-гин», Пенталгин Н», «Пальгин», «Седальгин-Нео» , «Баралгин», «Спазмалгон» и др. ) [2].

Наряду с достаточно сильным анальгетическим действием, метамизол оказывает токсическое действие на организм и может вызвать аграну-лоцитоз, лейкопению и др. При бесконтрольном применении метамизола, часто в сочетании с другими анальгетиками (парацетамол, ибупрофен и др.) велика возможность возникновения патологических изменений в организме человека, в том числе со смертельным исходом [1,3,4]. В связи с этим метмаизол запрещен к применению во многих странах не только развитых, но и развивающихся [3]. Несмотря на это метамизол в России является одним из наиболее часто применяемых анальгетиков. Вместе с тем данные по химико-токсикологическому исследованию метамизола в литературе весьма ограничены. В связи с этим целью нашего исследования явилась разработка схемы химико-токсикологического анализа мета-мизола в моче как индивидуально, так и при комбинированных отравлениях.

Для реализации поставленной цели нами были разработаны методики изолирования, идентификации и количественного определения метами-зола с помощью хроматографических методов -ТСХ и ВЭЖХ.

Методики исследования, результаты и обсуждения. Предварительно нами были разработаны методики идентификации и количественного определения метамизола в водных растворах [6]. Найденные оптимальные условия использованы для разработки схемы химико-токси-

кологического анализа метамизола в моче. На начальном этапе была разработана методика количественного определения метамизола, позволяющая контролировать степень его экстракции из биологической жидкости.

Количественное определение метамизола проводили в разработанных ранее условиях методом ВЭЖХ, с использованием параметра площади пика - хроматографическая колонка размером 2х75 мм, заполненная обращено - фазовым сорбентом ProntoSil 120-5С-18 AQ. Подвижная фаза: элюент А - 0,1% раствор кислоты трифторуксус-ной, элюент Б - ацетонитрил, скорость потока -100 мкл/мин; аналитические длины волн - 230, 244, 262, 272, 284 и 326 нм; время измерения -0,18 сек; температура термостата колонки - комнатная; градиент от 10% до 20% за 10 мин, от 20% до 80% за 10 мин далее изократично 80% ацето-нитрила - 5 минут; общее время хроматографиро-вания 25 минут; объем пробы - 10 мкл [6].

Количественное содержание рассчитывали по площади пика стандартного образца метамизола. Линейная зависимость соблюдается в пределах концентраций 0,002 - 10 мкг/мкл, коэффициент корреляции равен 0,999.

Для определения воспроизводимости методики готовили растворы стандартных образцов ме-тамизола в шести повторностях. Полученные результаты анализа при ведены в табл. 1.

Данные таблицы свидетельствуют о том, что разработанная методика позволяет определять количественное содержание исследуемых лекарственных веществ в водных растворах с относительным стандартным отклонением не превышающим 0,73%, что является удовлетворительным для методик количественного определения с использованием метода ВЭЖХ.

Для определения правильности методики готовили 9 растворов стандартных образцов метамизола на трёх уровнях концентраций в трёх повторностях. Полученные результаты анализа приведены в табл. 2.

Границы открываемости с учётом доверитель-

* - материал данной статьи является фрагментом диссертационной работы

Токсикологический вестник № 1 (112)

Таблица 1

Результаты установления правильности методики количественного определения

метамизола методом ВЭЖХ

№ п/п Содержание, мкг/мкл Найдено, % Метрологические характеристики

взято найдено

1.1 0,9859 98,59

1.2 0,9988 99,88

1.3 0,9981 99,81 Хср= 99,84% SD=0,92 RSD=0,73%

1.4 1,0114 101,14

1.5 1,0052 100,52

1.6 0,9912 99,12

Таблица 2

Результаты количественного определения метамизола методом ВЭЖХ

№ п/п Содержание, мкг/мкл Метрологические характеристики

^ %

внесено | найдено

1.1 0,01 0,00998 99,8 К = 99,89% SD=0,37 RSD=0,37%

1.2 0,01 0,01004 100,4

1.3 0,01 0,00996 99,6

2.1 0,1 0,10005 100,05

2.2 0,1 0,0998 99,8

2.3 0,1 0,1003 100,3

3.1 1 1,0008 100,08

3.2 1 0,992 99,2

3.3 1 0,998 99,8

Таблица 3

Степень экстракции метамизола при двукратном экстрагировании хлороформом

из водных растворов

Вещество Степень экстракции, % Метрологические характеристики

метамизол 80,3; 82,4; 81,33; 82,31; 81,45; 81,07 Х=81,48; Sx=0,32; ДХ =±0,83; 6=1,02%

ного интервала не выходят за пределы 98-102%, что позволяет использовать данную методику для количественного определения метамизола в биологических жидкостях.

Для разработки оптимальной методики изолирования метамизола из биологического объекта нами были использованы ранее найденные оп-

тимальные условия его изолирования из водных растворов (экстрагент - хлороформ, значение рН среды-10, насыщенный раствор натрия хлорида, время экстракции 5 минут), позволяющие получить его максимальный выход-84,75±1,49%.

В поисках максимальной степени изолирования исследуемого лекарственного вещества дополни-

тельно изучена кратность экстракции. Для этого теоретически рассчитали процент экстракции ме-тамизола при двукратной и трёхкратной экстракции. При этом степень экстракции метамизола при двукратном экстрагировании хлороформом составила в сумме около R=97%, а при трёхкратном около R= 100%. Поскольку увеличение степени экстракции метамизола при трёхкратном экстрагировании незначительно, посчитали возможным проводить двукратную экстракцию. Полученные результаты приведены в табл. 3.

Полученные экспериментальные данные по определению степени экстракции метамизола при двукратном экстрагировании в оптимальных условиях из водных растворов не согласуются с результатами теоретического расчёта определяемой величины, что по-видимому связано с его нестабильностью.

Поскольку в процессе изолирования лекарственных веществ из мочи, как правило, проводится гидролиз коньюгатов, нами было изучено влияние используемых реагентов (кислота, щелочь), а также температурного фактора на стабильность нативного соединения.

Известно, что с мочой выводится до 70 % метамизола в виде метаболитов [4]. Поэтому с целью повышения степени экстракции метамизола из мочи при экспертном исследовании, необходимо проводить гидролиз коньюгатов в биологической жидкости. В связи с этим нами было изучено влияние кислотного и щелочного гидролиза, на степень экстракции метамизола в модельной пробе мочи.

Методика без гидролиза: к 25 мл мочи (п=6) добавляли водный раствор метамизола, содержащий 5 мг субстанции и оставляли на 24 часа при комнатной температуре (180С). Через сутки к модельным смесям добавляли 30% раствор натрия гидроксида до значения рН среды 9-10. Затем экстрагировали двукратно хлороформом, объёмом равным объёму водной фазы в течение 5 минут. После каждой экстракции тщательно отделяли слой органического растворителя от водной фазы. Полученные органические извлечения объ-

единяли и выпаривали в токе теплого воздуха до сухого остатка.

Методика кислотного гидролизa: к 25 мл мочи (п=6) добавляли водный раствор метамизола, содержащий 5 мг субстанции и оставляли на 24 часа при комнатной температуре (180С). Через сутки к модельным смесям добавляли раствор кислоты хлористоводородной концентрированный до рН 2-3, полученные смеси нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 минут с воздушным холодильником. После проведенного гидролиза смеси охлаждали до комнатной температуры, добавляли 30% раствор натрия гидроксида до рН 9-10 и экстрагировали двукратно хлороформом, объёмом равным объёму водной фазы в течение 5 минут. После каждой экстракции тщательно отделяли слой органического растворителя от водной фазы. Полученные органические извлечения объединяли и выпаривали в токе теплого воздуха до сухого остатка.

Методика щелочного гидролиза: к 25 мл мочи (п=6) добавляли водный раствор метамизола, содержащий 5 мг субстанции и оставляли на 24 часа при комнатной температуре (180С). Через сутки к модельным смесям добавляли 30% раствор натрия гидроксида до значения рН среды 9-10, полученные смеси нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 минут с воздушным холодильником. После проведенного гидролиза смеси охлаждали до комнатной температуры и экстрагировали двукратно хлороформом, объёмом равным объёму водной фазы в течение 5 минут. После каждой экстракции тщательно отделяли слой органического растворителя от водной фазы. Полученные органические извлечения объединяли и выпаривали в токе теплого воздуха до сухого остатка.

Полученные сухие остатки растворяли в 10 мл спирта 96% и анализировали методом ВЭЖХ в вышеуказанных условиях. Результаты приведены в табл. 4.

Данные таблицы показывают, что наибольший выход метамизола из мочи происходит при изолировании его без гидролиза и после щелочного

Таблица 4

Результаты количественного определения метамизола в моче без гидролиза, после кислотного и щелочного гидролиза

Степень экстракции, %

Вещество

кислотный гидролиз метрологические характеристики щелочной гидролиз метрологические характеристики без гидролиза метрологические характеристики

метамизол 24,24 26,62 26,8 23,41 Х=25,55 Sx=0,71 ДХ=± 1,81 53,57 55,36 50,48 54,27 Х_=54,21 Sx=1,22 ДХ-=± 3,13 52,81 48,54 52,43 56,47 Х=61,71 Sx=1,28 ДХ=± 3,3

27,75 24,5 2=7,1% 52,34 59,25 £=5,78% 47,86 52,15 6=5,35%

Токсикологический вестник № i (i 12)

Таблица 6

Результаты количественного определения метамизола в моче на трёх уровнях концентраций

Таблица 5

Результаты хроматографирования метамизола в тонком слое сорбента

Подвижная фаза Соотношение растворителей Значение Rf изучаемых веществ

парацетамол ибупрофен метамизол

Толуол - этанол - уксусная кислота 25%аммиак($!) 64:30:4:2 0,61 0,81 0,17

Этанол - хлороформ - 25%аммиак - ($2) 50:46:4 0,82 0,52 0,45

Толуол - этанол - уксусная кислота - ($3) 75:20:5 0,16 0,59 0,11

s

Лекарственное вещество s m Найдено мкг/мкл Кэ Найдено с учетом Кэ, мг/мл R% Метрологические характеристики

4,2 2,52; 2,46; 2,75 3,33; 3,36; 3,25 79,29; 77,38; 80,00

RcP=81,43 SD=4,43

Метамизол 50 29,49; 34,18; 31,23 1,32 38,28; 45,12; 41,22 76,56; 90,20; 82,44 RSD=5,44%

Д R =±3,49 1расч=°,03

83 50,17; 54,56; 50,56 66,22; 72,02; 66,74 79,78; 86,77; 80,41

гидролиза, что очевидно связано с его деструкцией в условиях кислотного гидролиза. Поэтому в дальнейших исследованиях для изолирования метамизола из экспертной мочи необходимо использовать щелочной гидролиз.

Следующим этапом наших исследований явилось идентификация метамизола в извлечениях из модельной пробы мочи методом ТСХ.

В качестве предварительного способа обнаружения метамизола в моче использовали метод хроматографии в тонком слое сорбента [6]. С целью определения специфичности методики нами была изучена возможность обнаружения метами-зола в присутствии парацетамола и ибупрофена. Детекцию пятен проводили путем просмотра хро-матографических пластин (Сорбфил) в УФ свете при длине волны 254 нм (0,5 мкг в пробе), с последующей обработкой 5% раствором железа (III) хлорида (1,5 мкг в пробе) и реактивом Дра-гендофа (0,5 мкг в пробе). Полученные результаты приведены в табл. 5.

Данные таблицы свидетельствуют о том, что в найденных оптимальных условиях метод ТСХ позволяет обнаружить метамизол при проведении дифференциальной диагностики отравлений.

Далее идентификацию метамизола проводили с помощью хромогенных и микрокристаллоско-пических реакций. Положительные результаты были получены с реактивами окрашивания: реактив Эрдмана (10 мкг в пробе) - розовое преходящее в желтое окрашивание; 5% раствором железа (III) хлорида (5мкг в пробе) - розовое окрашивание; 10% раствором натрия нитрита в кислоте серной концентрированной (реактив Либермана) (3 мкг в пробе) - синее окрашивание. Характерные кристаллы были получены со следующими реактивами: 0,2% водный раствор метилового оранжевого - (6 мкг в пробе); 0,2% раствор метилового оранжевого в 0,01М растворе натрия ги-дроксида - (3 мкг в пробе) [7].

Для идентификации метамизола также был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, в условиях описанных выше. Время удерживания метамизола соответствовало времени удерживания его стандартного образца и равно t^=7,26±0,17 мин.

В найденных оптимальных условиях были анализированы модельные пробы мочи (25мл), содержащие по 4,2 мг; 50 мг и 83 мг субстанции метамизола, соответствующие его минимальной

терапевтической, максимальной суточной и рассчитанной токсической дозам, найденных исходя из среднесуточного объёма мочи (1500мл). Экстракцию и количественное определение проводили по вышеописанным методикам ( щелочной гидролиз, электролит - насыщенный раствор натрия хлорида, двукратная экстракция хлороформом). Для определения правильности методики количественного определения метамизола в моче, нами рассчитан коэффициент экстракции, коррелирующий степень выхода искомого вещества из биологической жидкости по отношению к его выходу из водных растворов. Данные количественного определения метамизола методом ВЭЖХ представлены в табл. 6.

Данные таблицы свидетельствуют о том, что на всех трех уровнях концентраций анализируемых модельных проб мочи получены сопоставимые результаты, а относительное стандартное отклонение не превышает 6%

Для установления наличия систематической погрешности методики рассчитывали критерий Стьюдента, найденные значения не превышают t .=0,03.

расч '

Поскольку рассчитанное значение критерия Стьюдента меньше табличного ^табл.=2,36), методика количественного определения изучаемых лекарственных веществ не отягощена систематической ошибкой.

В результате исследования установлено, что степень экстракции метамизола из мочи в найденных оптимальных условиях изолирования составляет около 80%, а относительная погрешность не превышает ± 6%.

Выводы. Таким образом, изучены условия изолирования метамизола из модельной пробы мочи. Установлено, что наибольшая степень экстракции метамизола достигается при двукратном экстрагировании его хлороформом в оптимальных условиях, после проведения щелочного гидролиза. Разработаны методики идентификации ме-тамизола в извлечениях из мочи методами ТСХ, ВЭЖХ, а также хромогенными и микрокристал-лоскопическими реакциями. Предложена методика количественного определения метамизола в извлечениях из мочи методом ВЭЖХ. Полученные результаты исследования могут быть включены в схему дифференциальной диагностики отравлений метамизолом.

СПИС0К ЛИТЕРАТУРЫ

1. Судебно-медицинская токсикология / В.А. Клевно, Е.М.Саломатин, Д.В. Богомолов и др.Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики на современном этапе / под ред. В.А. Клевно // Материалы Всерос. науч.-практ. конф. с межд. участием, посвящ. 75 - летию Рос. центра суд.-мед. экспертизы 18-20 окт. 2006.-М.: РИО ФГУ «РЦСМЭ Росздрава», 2006.-С. 132-135.

2. Машковский, М.Д. Лекарственные средства: в 2 т. / М.Д. Машковский - 14-е изд., перераб. и доп. - М.: Новая волна, 2004. - Т. 1. - 540 с.

3. Эндрю Челти. Проблемные лекарства: Челти Эндрю - Health Action International 1998. - 360 с.

4. Clarkegs Isolation and identification of drugs.- London: the Pharmaceutical Press, 1986. - 1293 p.

5. Егорова, Э.И. Микрокристаллоскопические реакции идентификации лекарственных препаратов с красителями / Э.И. Егорова, Е.А. Краснов, С.В. Терентьева // Фармация. - 1985.-№3. - С. 76-78.

6. Саркисян, М.С. Дифферинциальная диагностика отравлений некоторыми анальгетиками методами ТСХ и ВЭЖХ / М.С. Саркисян, Д.С. Лазарян, М.Г. Цыбулина// Разработка, исследование и маркетинг но-

вой фармацевтической продукции: Сб. науч. тр.- Пятигорск, 2009. - Вып. 64. - С. 335-337. 7. Саркисян, М.С. Применение хромогенных и микрокристаллоскопических реакций для идентификации некоторых анальгетиков/ М.С. Сакисян, Д.С. Лазарян // О проблемных вопросах организации производства судебно-медицинских экспертиз: сб. материалов Всерос. науч.-практ. конф. 5-6 ноябр. 2009г. -М.: РИО ФГУ РЦМСМЭ Минздравсоцразвития России, 2009. - С. 344-349.

Sarkisyan M.S., Lazaryan D.S. Chemical and toxicological investigation on Metamizole in urine

Pyatigorsk State Pharmaceutical Academy

Methodology of isolating Metamizole in urine, its identification and quantitative evaluation was developed using chemical (chromogenic and microcrystalloscopic reactions) and physico-chemical methods (thin layer chromatography and high effective liquid chromatography methods. A complex use of the said methodology allows to authentically diagnose a poisoning by Metamizole used separately or jointly with other analgecics.

Материал поступил в редакцию 13.12.2011 г