CC BY
131
УДК 579.64
А.Г. Буланов*, Д.Г. Титова, Е.Н. Дмитриева, О.Б. Горюнова, Н.С. Марквичев
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20 , корп. 1 * e-mail: aleksandr.vencedor@gmail.com
ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙТСВИЯ ФУНГИЦИДНОГО ПРЕПАРАТА «МАКСИМ» НА ФИТОПАТОГЕННЫЙ МИКРООРГАНИЗМ FUSARIUM OXYSPORUM
В работе показано влияние препарата Максим на морфолого-физиологические и кинетические характеристики развития Б. oxysporum при поверхностном культивировании. Показано, что Б. oxysporum приобретает физиологическую резистентность при поверхностном культивировании на агаризованных средах с разной концентрации препарата Максим.
Ключевые слова: F.oxysporum, фитопатоген, фунгицид, резистентность.
Овощеводство закрытого грунта - одна из ведущих подотраслей агропромышленного комплекса России и стран СНГ, которая обеспечивает население овощной продукцией круглый год и позволяет получать наибольший урожай с единицы площади[1].
На сегодняшний день главными выращиваемыми культурами в теплицах являются огурец и томат. Огурец лидирует в России в закрытом грунте по площадям и выращивается в зимне-весенней культуре, занимая 70-80% теплиц, а в весенне-летней - до 90%. Томат составляет площади до 25% территории теплиц[2]. Для того чтобы сохранить и достичь максимальной урожайности, необходимо применять
комплексные меры интегрированной защиты растений. К ним относятся: карантинные мероприятия, разработка планов посадки растений, предобработка посевного материала и дезинфекция посадочных площадей. Однако не всегда такие меры предосторожности помогают полностью ликвидировать патогенные источники заболеваний. Их наличие, как правило, приводит к пагубным последствиям. Так, при благоприятном развитии ситуации ущерб для урожая может составлять порядка 10-15%. При неблагоприятном - показатель потерь повышается до 85%. Очевидно, что такая динамика оказывает негативное влияние на экономическую составляющую всего хозяйства.
В этой связи принципиальное значение приобретают эффективные меры реагирования. При первых симптомах заболевания растений необходимо использовать в сочетании химические и биологические методы защиты. Следует отметить, что при всех положительных аспектах биологических препаратов, на сегодняшний день предпочтение отдается химическим. Об этом
свидетельствуют данные Российского рынка закупок. Так, в период с 2007 по 2012 год они выросли в 2,4 раза с 39,9 до 94 тыс. тонн. Из них 22% приходится на фунгицидные препараты, а это более 21 тыс. тонн[3]. Еще одним аргументом в пользу данной теории является существующий спектр пестицидных препаратов. В последнем издании справочника по пестицидам (Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, 2013г.) насчитывается более чем 2000 препаратов, зарегистрированных на территории Российской Федерации. Этот список постоянно расширяется и обновляется[4].
Вместе с тем при выборе самих препаратов хозяйствами существуют определенные трудности. По государственному образцу регистрации все препараты имеют одну общую характеристику - это норма применения. В основу определения данной характеристики препарата положены методы анализа воздействия пестицидов на фитопатогенные микроорганизмы. Существуют два основных метода: метод предельных разведений и метод дисков. Суть первого заключается в грубом подсчете числа жизнеспособных клеток. В данном случае алгоритм представляет собой несколько последовательных разведений культуры в ростовой среде. По окончании инкубационного периода подсчитывается количество пробирок, в которых отсутствует рост. Предполагается, что в такие пробирки при посеве не было внесено ни одной жизнеспособной клетки[5]. Второй метод заключается в определении зоны просветления. Бумажные фильтры смачиваются определенным количеством исследуемого препарата и помещаются в чашку Петри, предварительно засеянную сплошным слоем микроорганизмов.
Спустя 5 суток оценивается зона, в который препарат подавил рост патогенов.
Однако следует признать, что оба метода имеют ряд недостатков, которые не позволяют качественно определить эффективность препаратов. Это, прежде всего, обусловлено тем, что принятая норма применения препарата не дает четкого ответа на отдельные возникающие вопросы. В частности: изменяется ли норма дозировки при разных концентрациях патогенов в почве; достаточно ли этой дозы препарата для патогена, которым заражено растение; какой промежуток времени должен пройти до повторного проведения обработки?
Задачей данного исследования является изучение воздействия фунгицидных препаратов контактного действия на патогенные микроорганизмы в тепличных комбинатах, а также разработка нового метода контроля эффективности химических препаратов.
Материалы и методы
Образцом для исследования был выбран гриб рода Fusarium Oxysporum, относящийся к царству Fungi, отделу Ascomycota, классу Ascomycetes, подклассу Sordariomycetidae, порядку Hypocreales, взятый из коллекции РХТУ им. Д.И. Менделеева, кафедры Биотехнологии. До этого культура была выделена из почвы тепличного комбината ООО «Тепличный», расположенного в Ставропольском крае. Заболевание, вызываемое данным фитопатогенном, широко распространено не только в открытом, но и в закрытом грунте. Фузариозное увядание относится к корневым заболеваниям. К культурам, подверженным его наибольшему воздействию, относятся томат и огурец. При этом существует два пути заражения растения. Первый - посредством семян. В данном случае возбудитель прорастает внутри тканей молодого растения и развивается вместе с ним. Второй - заражение растений через механические травмы на корнях. Здесь источником инфекции является, как правило, почва[6]. Штамм хранится в пробирке на скошенном агаре при температуре 4°С на среде Чапека. Культура обновляется каждые полтора месяца. Микроорганизм пересевается на скошенный агар методом штриха, культивирование продолжается в течение 7 суток при температуре 25°С в термостате.
В качестве фунгицида был выбран препарат «Максим». Это контактный фунгицид защитного действия, ингибирующий рост мицелия. Он имеет слабое системное и длительное защитное действие. Относится к классу финилпирролов, группе производных нестабильного в УФ спектре пирролнитрила. Действующее вещество, используемое в препарате, обнаружено у бактерии Pseudomonas pyrrocinia, на основе которого
получен устойчивый синтетический
функциональный аналог - флудиоксонил, используемый в фунгициде для обработки клубней растений, семян зерновых культур в концентрации 2г/л. В России указанный препарат выпускается под маркой компании ООО «Сингента».
Фитопатогенный микроорганизм выращивался на чашках Петри методом поверхностного культивирования на среде Чапека: глюкоза - 30; пептон - 5; дрожжевой экстракт - 5; NaQ - 10; MgSo4 - 0,5; K2HPO4 - 3; - 1; агар-агар -
17гр/л. В проавтоклавированную среду, охлажденную до комнатной температуры, предварительно разлитую в пробирки по 25мл, добавлялся фунгицидный препарат. Расчет концентрации фунгицида производился по данным, указанным в инструкции: 2мл/1л воды (2мкл/мл). Содержание действующего вещества составляет 25мг/мл. Для исследования воздействия различных концентраций на фитопатоген был выбран ряд концентраций, пониженных и повышенных соответственно в 2 и 4. Стандартный объем чашек Петри приравнивается к 25 мл. Произведенный перерасчет концентраций на данный объем составил 0,4; 0,8; 2; 4; 8 мкл/мл заданной концентрации. Затем среда размешивалась и разливалась в чашки Петри. Посев культуры производился с пробирки со скошенным агаром бактериальной иглой в центр чашки - уколом. Культивирование происходило в термостате при постоянной температуре 25°С в течение 5 суток. Ежедневно, в одно и то же время чашки фотографировались, и изучалась физиология микроорганизма. Проба для микроскопии бралась с поверхности воздушного мицелия из центра и края колонии. Препарат готовился по методике раздавленной капли и микроскопировался при увеличении в 400 раз.
Результаты и обсуждения
Целью эксперимента было создание реальных условий, в которых развиваются фитопатогенные микроорганизмы. Для фузариозных заболеваний -это чаще всего теплицы и открытый грунт, на органах растений и в почве. Поэтому в лаборатории был выбран наиболее приближенный к реальному метод поверхностного культивирования на чашках Петри.
На первом этапе исследований F.oxysporшm выращивался без добавления фунгицидного препарата для фиксации естественного роста микроорганизма на агаризованной среде. Описание физико-морфологических признаков колонии происходило на 5-е сутки культивирования при помощи «Определителя
патогенных и условно патогенных грибов» под редакцией Д. Саттона.
Макроморфологическими признаками,
присущими данной культуре, являются хлопьевидная (ватообразная) структура с белым воздушным мицелием, обратная сторона колонии ярко-желтого цвета с темно-коричневыми зонами начала роста гриба, форма колонии округлая. В таблице №1 показана зависимость диаметра колонии от времени культивирования.
На основе полученных данных стоился график (Рис.2.) зависимости диаметра колонии от времени культивирования по методике, описанной в
С. Дж. Перт «Основы культивирования микроорганизмов и клеток». По тангенсу угла наклона для каждого дня была рассчитана скорость роста. Максимальная скорость роста колонии составила ц = 1,5 см/сут.
Таблица №1
Зависимость диаметра колонии Ж. охуэрогиш во
времени
Сут 1 2 3 4 5
ки
0 0,6 2,1 2,8 4
см
Рис. 1. График зависимости диаметра колонии Ж. охуэрогиш во времени
Рис. 2. Кинетика роста Ж.
Прежде чем приступить к описанию микроморфологических признаков колонии, важно понимание колониального роста ее на агаризованных средах при поверхностном культивировании. С. Дж. Перт в своих исследованиях предлагает модель, с помощью которой возможно количественно
охарактеризовать скорость роста колонии. Из этой модели видно, что в начале роста, когда в агар внесено небольшое количество клеток микроорганизмов, все они одинаково участвуют в образовании популяции. Рост происходит радиально, и увеличение числа клеток равномерно по всей поверхности агара. Этот процесс протекает до момента, пока концентрация субстрата в среде превышает константу насыщения. Рост колонии вертикально после
оху8рогиш во времени
достижения ее определенной высоты лимитируется теорией диффузионных субстратов, вследствие противодействия диффузии субстратов [7]. Радиальный рост колонии показан на рис. 2.
Микроморфологические признаки
оценивались, начиная с третьего дня культивирования микроорганизма. Гифы септированные, бесцветные, толщиной около 3 мкм. Начинают образовываться микро и макроконидии. На 5 сутки макроконидии имеют слегка выгнутую форму с тремя и чаще с двумя или одной перегородками. На рис. 3. отчетливо видно большее количество макроконидии по отношению к микроконидиям. Хломидоспоры отсутствуют.
Рис. 3. Морфологические особенности Ж. охуэрогиш под микроскопом (РК - х400)
Следующим шагом исследований стало с добавлением препарата «Максим» в разных выращивание F.oxysporum на агаризованной среде концентрациях.
Таблица №2
Зависимость диаметра колонии Ж. охуэрогиш во времени от концентрация
Сутки| С, мкл/мл 1 2 3 4 5
0,4 0 0,6 1,7 2,5 3
0,8 0 0,4 1,5 2,5 2,8
2 0 0,5 1,4 1,4 2
4 0 0,5 1,3 1,8 2
8 0 0 0,5 0,5 0,7
По полученным данным строился график прямо пропорциональная зависимость диаметра зависимости диаметра колонии от времени колонии от времени. культивирования при различных концентрациях препарата. На рис.4 изображена
Рис. 4. График зависимости диаметра колонии Ж. охуэрогиш во времени от концентрации
При росте микроорганизма на среде с добавлением фунгицида концентрацией 2 мкл/мл и выше происходили изменения в макроморфологических признаках, но форма колонии оставалась той же. В первые двое суток наблюдалась тенденция не к горизонтальному, а к вертикальному росту колонии, об этом свидетельствовало наличие бугорков на поверхности колонии рис. 5. Из модели роста С. Дж. Перт, можно предположить, что вначале микроорганизм достигает максимального вертикально возможного роста. При этом в нем
протекают процессы, вследствие которых изменяется метаболизм, и уже новые клетки, как видно из графика на третьи сутки, приспосабливаются к неблагоприятным условиям и увеличивают скорость радиального роста. Учитывая изложенное, можно сделать вывод о появлении резистентных признаков у фитопатогена, что объясняется одной из теорий появления резистентности: формирование метаболического «шунта» - изменение в обмене веществ, минующее реакцию (процесс), на которую влияет действующее вещество [8].
Рис. 5. А - Кинетика роста при концентрации 2мкл/мл; Б - Кинетика роста при концентрации 8мкл/мл
б
При исследовании микро-морфологических признаков в течение 5 суток никаких изменений выявлено не было. Можно предположить, что использованное оборудование не позволяет обнаружить их, или изменения происходят на молекулярном уровне.
После анализа полученных данных рассчитывалась скорость роста для всего ряда
концентрации препарата, и строился график зависимости удельной скорости роста от концентрации (Рис.6.). Для определения эффективности действия фунгицидного препарата был введен термин половинной скорости роста (СР50), при которой скорость роста колонии падает в 2 раза и, соответственно, составляет 0,5 см/сут.
Рис.6. Зависимость скорости роста от концентрации
Заключение
Полученные результаты исследований свидетельствуют о том, что рекомендуемая доза фунгицидного препарата «Максим» не оказывает воздействия на Fusarium oxypsorum при росте на агаризованной среде. Исследуя рост колонии
гриба можно сделать предварительное заключение о появлении резистентных свойств у исследуемого микроорганизма к препарату. Возникновение такой устойчивости говорит о приобретенной метаболической резистентности микроорганизма.
Буланов Александр Геннадьевич студент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Титова Дарья Германовна студент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Дмитриева Евгения Николаевна ведущий инженер кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Горюнова Ольга Борисовна к.т.н., ведущий инженер кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И.
Менделеева, Россия, Москва
Марквичев Николай Семенович к.т.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева,
Россия, Москва
Литература
1. Федоренко В.С. Защита овощных культур в закрытом грунте // Пропозиция. - 2010 №33. С 52-56.
2. Ахатов А.К. Огурцы и томаты в теплицах // Защита и карантин растений. - 2011. №2. С 70-102.
3. Обзор рынка пестицидов // Журнал предприятий АПК, Современный фермер. - 2013. №5
4. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, 2013.
5. Метод определения наиболее вероятного числа бактерий (метод предельных разведений) [Электронный ресурс]: Электрон. журн. - Основы биологии. - 2014. - режим доступа к журн.: http://listbiology.ru
6. Фузариозное увядание [Электронный ресурс]: Сайт компании Syngenta. - 2014. - режим доступа к журн.: http://syngenta.com
7. С. Дж. Перт. Основы культивирования микроорганизмов и клеток // изд. Мир. -1978. С 276-285
8. Усенко А.С. Конспект лекций по дисциплине «Защита растений» // Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, кафедра микологии и фитоиммунологии. - 2012. С. 65
Aleksandr Gennadievich Bulanov * Daria Germanovna Titov, Eugenia Nikolavna Dmitrieva, Olga
Borisovna Goryunova, Nikolay Semenovich Markvichev
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia.
* email: aleksandr.vencedor@gmail.com
RESEARCH OF ACTION OF FUNGICIDES "MAXIM" ON PHYTOPATHOGENS FUSARIUM
OXYSPORUM
Abstract
Research shows the influence of the drug on the "Maxim" morphological - physiological and kinetic characterization of F. oxysporum development in surface cultivation. F. oxysporum is to shown acquires physiological resistance with surface cultivation on agar media with different concentrations of the drug "Maxim".
Keywords: F.oxysporum, phytopathogenic, fungicide resistance.
