CC BY
60
ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА-4 НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА НЕЙТРОФИЛОВ
Е.Г. Моисеева
Кафедра патологической физиологии Российский университет дружбы народов Ул. Миклухо-Маклая, 8, 117198 Москва, Россия
В исследовании получены результаты, которые позволили установить ассоциацию измененных параметров функции полиморфонуклеаров с активностью Т-хелперов и Т-супрессоров, которые обусловливают измененную реактивность нейтрофилов и продукцию ими гистотоксических компонентов или медиаторов воспалительного процесса при пародонтитах. Обнаруженные иммунные нарушения при воспалении в тканях пародонта являются патогенетическим обоснованием для проведения иммунокорригирующей терапии данного заболевания, особенно в случаях его упорного, тяжелого, рецидивирующего течения. ИЛ-4 положительно влиял на функциональные характеристики нейтрофилов, модифицированные при развитии воспалительного процесса.
Патология пародонта непосредственно связана с персистирующим воспалительным процессом, в механизмах развития которого ведущее значение придается иммунным нарушениям. Иммунопатогенез данной патологии достаточно сложен. Он парадоксально сочетает в себе разноуровневые изменения клеточного иммунитета и активацию антитело-опосредованной реактивности. Многие авторы находят, что степень отклонений показателей иммунитета находится в зависимости от клинических особенностей течения заболевания [1; 5]. В последние годы показано существование функциональной дихотомии хелперной активности Т-лимфоцитов, что проявляется наличием двух рестриктированных клонов, продуцирующих различные интерлейкины, которые активно модифицируют течение патологического процесса. Каждый цитокин (или группа цитокинов) обладают перекрещивающейся, синергической или ингибирующей активностью по отношению к другим цитоки-нам. Это свойство цитокинов обеспечивает оптимальное развитие иммунного ответа, в рамках так называемой «цитокиновой сети» (cytokine network) с участием нейтрофилов, моноцитов и каскада регулирующих интерлейкинов (ИЛ-4, ИЛ-10), зависимых от Т-хелперов-1 (Thl) и Т-хел-перов-2 (Th2). Профиль синтеза цитокинов, соответствующий представленным характеристиками Thl- или Th2-клеток, но не обязательно опосредуемый именно СШ+Т-лимфоцитами, определяется соответственно как Thl- и ТЬ2-типы иммунного ответа. Предполагается, что Th2 цитокины обеспечивают в первую очередь хелперный сигнал в отношении синтеза антител и принимают участие в развитии аллергических реакций, а также выполняют имму-норегуляторную функцию; в то время как Thl цитокины вовлечены в реакции клеточного иммунитета, а именно гиперчувствительность замедленного типа, воспаление, клеточная цитотоксичность. Характерной особенностью цитокинов, синтезирующихся Thl- и ТЬ2-клетками, является ингибиция дифференцировки и эффек-торных функций реципроктных фенотипов Th клеток в рамках «цитокиновой» сети.
Липополисахарид (ЛПС) Escherichia coli, благодаря своим провоспалительным свойствам, рассматривается как один из перспективных компонентов индукции иммунологических и воспалительных нарушений при моделировании болезней па-родонта. Учитывая важную роль нейтрофилов в повреждении нормальных тканей пародонта [2; 4; 6], целью настоящего исследования явилась сравнительная оценка эффектов ИЛ-4 на функциональные характеристики нейтрофилов при моделировании пародонтита путем локального многократного введения ЛПС.
Методы исследования.
Парадонтит моделировали на кроликах путем локального введения ЛПС в ткани десны. Исследования проводили еженедельно в периоды 1-5 недель. Нейтрофилы выделяли из периферической крови кроликов и здоровых доноров на 2-слойном градиенте фиколла-верографина. После этого клетки дважды отмывали фосфатным буфером, pH 7,4 (PBS). Для регистрации апоптоза клетки культивировали в среде RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (“Sigma”), 1% L-глутамина, 1% пенициллина и стрептомицина (культуральная среда) при 370°С в атмосфере, содержащей 5% С02 (концентрация клеток 1x106/мл) в течение 9 часов. Процент апоптозных и живых клеток определяли методом проточной цитометрии (с использованием флуоресцентного зонда Hoechst-33258). Реакцию адгезии ставили в 24-луночных плоскодонных планшетах (Nunc). В опытную лунку вносили 1x106/мл нейтрофилов и растворы дек-саметазона и рокалтрола различной концентрации в физрастворе. Во всех экспериментах использовали планшеты, покрытые фибриногеном (нейтрофилы прилипают к фибриногену CD11 /CD 18 рецепторами). Клетки культивировали в культуральной среде 60 минут при 370°С в атмосфере, содержащей 5% С02. После окончания адгезии планшеты 3 раза тщательно ополаскивали теплым раствором Хенкса (370°С) с кальцием и магнием. Адгезию нейтрофилов определяли по количеству прилипших нейтрофилов с использованием метода Лоури (метод количественного определения белка; калибровочную зависимость получали используя в качестве источника белка выделенные нейтрофилы, предварительно лизированные детергентом - холатом натрия). Генерацию активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами определяли хемилюминесцентным методом. Нейтрофилы (в концентрации 0,2x106/мл) помещали в эппендорфы в среду Хенкса с ионами Са2+, Mg2+, люминолом (3,5x10-4 М), 10 MKMNaN3 в термостатируе-мую ячейку люминометра 1250 LKB (Швеция). В качестве активатора генерации активных форм кислорода нейтрофилами использовали Fmlp (1 мкМ). Перед добавлением Fmlp нейтрофилы инкубировали 20 минут в присутствии различных концентраций исследуемых веществ и регистрировали спонтанную хемилюминесценцию (ХЛ). Исследовали значения спонтанной хемилюминесценции перед добавлением Fmlp (20 минут инкубации). За 100% принимали максимальное значение Fmlp-активированной хемилюминесценции контрольных нейтрофилов. В качестве объекта фагоцитоза использовали пекарские дрожжи, конъюгированные с флуоресцентным зондом FITC (флуоресцеинизотиоцианат). Процент фагоцитоза подсчитывали на флуоресцентном микроскопе. В культуру клеток добавляли ИЛ-4. Данные представляли как M+SD для независимых экспериментов; достоверность различий оценивали с использованием t критерия Стьюдента.
Результаты исследования.
В динамике развития воспаления интенсивность фагоцитоза возрастает, особенно через три недели, то есть в фазу хронизации воспалительного процесса. Интенсивность хемотаксиса также увеличена во все периоды исследования. Подобная динамика отмечается и при исследовании образования активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами.
ИЛ-4 ингибировал адгезию нейтрофилов. Более сильным ингибирующим действием обладал этот цитокин при высоких концентрациях, что коррелирует с данными по влиянию этого соединений на генерацию АФК, так как в настоящее время известно, что процессы активации адгезии и активации образования активных форм кислорода нейтрофилами взаимосвязаны. ИЛ-4 не оказывал влияние на фагоцитоз нейтрофилов, что может быть связано с ингибированием адгезионных свойств нейтрофилов, так как стадия адгезии в процессе фагоцитоза конкурирует со стадией поглощения. Цитокин в различных концентрациях усиливал апоптоз нейтрофилов. Полученные данные по действию ИЛ-4 на апоптоз нейтрофилов кроликов хорошо соотносятся с данными, проведенными на лейкоцитах доноров.
Взятые в совокупности, эти данные позволяют предположить, что процесс хронизации воспалительного процесса ассоциирован с переключением фенотипа активированных Т-лимфоцитов с ТЬ2-клеток, контролирующих развитие ангитело-образования, на Thl-хелперы клеточно-опосредованных механизмов иммунной защиты [1; 3]. Склонность к модулированию клеточно-опосредованных и гуморальных механизмов иммунного ответа при более тяжелых формах пародонтита или прогрессировании хронических констатирована в многочисленных экспериментальных и клинических наблюдениях. Это объясняется сменой фенотипа Th при хронизации патологического процесса [7].
Данные, касающиеся роли нарушений в системе иммунитета в развитии пародонтитов, суммированы в недавно опубликованных работах, проведенных на нока-утных мышах, у которых отсутствует ген синтеза ИЛ-4. Продемострировано более быстрое развитие гингивита, хронизация воспалительного процесса и его «эволюция» в пародонтит и периодонтит [2].
Именно с особенностями фенотипа циркулирующих Т-лимфоцитов может быть связано снижение готовности нейтрофилов к апоптозу. Согласно ряду сообщений [2,4], CD4+ Thl и Th2 различаются по способности экспрессировать FasL и подвергаться индуцированному активацией апоптозу и влиять на апоптоз клеток-эффекторов (нейтрофилов).
ЛИТЕРАТУРА
1 .Boxer L.A., Stossel Т.P. Qualitative abnormalities of neutrophils, In W. J. Williams, E. Beutler, A. J. Erslev, Lichtman M.A. (ed.), Hematology, 3rd ed. McGraw-Hill Book Co., New York, N.Y., — 2004. — P. 802-814.
2. Colotta F., Re F., Polentarutti N, et al. Modulation of granulocyte survival and programmed cell death by cytokines and bacterial products // Blood. — 2005. — Vol. 80. — P. 2012-2020.
3. Cousin J.M., Haslett C., Rossi A.G. Regulation of granulocyte apoptosis by PKC inhibition and elevation of [Ca2+]i // Biochem. Soc. Trans. — 1997. — S. 25. — P. 243.
4. Cox G., Crossley J., Xing Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. — 1995, —№12, —P. 232-237.
5. Descamps-Latscha B., Witko-Sarsat V. Relations polynucleaires neutrophiles et monocytes-macrophages 11 Rev. Fr. Allergol. — 1999. — №39, — P. 241-247.
6. Gordon M.Y. Origin and development of neutrophils / In Immunopharmacology of neutrophils. P.G.Hellewell, T.J.Williams (ed.), Academic Press, Ltd., London, United Kingdom. — 2004. — P. 5-26.
7. Hall S.E., Savill J.S., Henson P.M., et al. Apoptotic neutrophils are phagocytosed by fibroblasts with participation of the fibroblast vitronectin receptor and involvement of a mannose/fucose-specific lectin // J. Immunol. — 1999. — №153. ■— P. 3218-3227.
RESEARCH OF INTERLEUKIN-4 ACTION ON FUNCTIONAL PROPERTIES OF NEUTROPHILS
E.G. Moiseeva
Department of Pathological Physiology Peoples’ Friendship University of Russia
Miklukho-Maklaya st. 8, 117198 Moscow, Russia
For understanding pathogenesis of periodontitis the question of starting mechanisms of inflammatory process is important. Many authors attach crucial importance in it to inflammatory IL, induced various interleukin-dependent answers. Thus the essential role belongs to Th cell-derived cytokine production to mechanisms of regulation of inflammatory process. It proves to be true and the results received by us which have allowed to establish association of the changed parameters of function of polymorphonuclear cells (PMN) with activity Th and Ts which causes the changed reactivitof PMN and production of them hystotoxic components or components of inflammatory process at periodontitis. The found out immune disorders at inflammation of periodontium are the pathogenetic ground for carrying out immunoregulatory therapy of this disease, especial in cases of its persistent, heavy, recurrent course. IL-4 positively influenced functional characteristics of PMN, modified at development of inflammatory process in periodontium.
