CC BY
32
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 616.728.2:616-002.4
ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ В ГОЛОВКЕ БЕДРЕННОЙ КОСТИ КРЫС НА ФОНЕ ДЛИТЕЛЬНОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
Алексей Геннадьевич ШУШАРИН1, Марина Сергеевна БИРЮКОВА2, Марина Павловна ПОЛОВИНКА1, Наталья Анатольевна ЖУКОВА2, Татьяна Генриховна ТОЛСТИКОВА2
1 ФГБУНИнститут химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН 630090, г. Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 8
2 ФГБУН Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова» СО РАН 630090, г. Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 9
Цель работы - изучение влияния хронической алкогольной интоксикации на развитие дегенеративных процессов в головке бедренной кости крыс. Материал и методы. Хроническую алкогольную интоксикацию моделировали на самцах крыс массой 200-220 г. Для проведения исследований крыс рандомизировали по группам: I и II группы получали ежедневно внутрижелудочно 40%-й раствор этилового спирта (50 мкл/кг массы тела) в сочетании соответственно с 5%-м и 10%-м раствором этилового спирта в качестве питья ad libitum на протяжении 9 недель; III группа - интактные животные. Влияние хронической алкоголизации на поведение животных оценивали в тесте «открытое поле» каждые 10 дней. Результаты и их обсуждение. На основании биохимического и гистологического анализа у крыс на фоне алкогольной интоксикации выявлено развитие токсического гепатита. При гистологическом исследовании в периферической зоне хряща дегенеративных изменений хондроцитов не выявлено, тогда как в зоне зрелого хряща основная масса хондроцитов находилась в состоянии выраженной деструкции. Таким образом, делается заключение, что на фоне хронической (9-недельной) алкогольной интоксикации у животных развивается алкогольный гепатит с деструкцией зрелого хряща головки бедренной кости.
Ключевые слова: алкогольный гепатит, головка бедренной кости, дегенеративные изменения, крысы.
Остеонекроз (асептический некроз) является достаточно распространенным заболеванием пациентов в практике как ревматологов, так и ортопедов. Несмотря на то, что факторы риска развития асептического некроза головки бедренной кости (АНГБК) выявлены, этиология и патогенез остеонекроза остаются неясными. Можно предположить, что гибель костных клеток - конечный результат одного или более патогенетических механизмов, действующих по отдельности или си-нергически [5]. Терапия глюкокортикостероида-ми и злоупотребление алкоголем являются двумя основными причинами развития нетравматического остеонекроза [12]. Однако кто чрезмерно употребляет алкоголь, а также от 5
до 10 % лиц, получающих высокие дозы стероидов, страдают АНГБК [7]. Что отличает пациентов, у которых развивается остеонекроз, от тех, у кого данная патология не возникает, пока не ясно, поэтому и результаты исследований о влиянии алкоголя на развитие дегенеративных процессов в тазобедренном суставе на моделях in vivo и в клинике весьма не однозначны.
Разными авторами проводились и проводятся исследования с целью выяснения механизма изменения метаболизма костной ткани при потреблении алкоголя [3]. Рико и др. [8] изучали уровень свободного кортизола в сыворотке крови и моче у пациентов с АНГБК, ассоциированным с потреблением алкоголя. Авторы обнаружили
Шушарин А.Г. - к.м.н., зав. лабораторией восстановительной медицины, доцент по специальности, e-mail: [email protected]
Бирюкова М.С. - инженер лаборатории фармакологических исследований, e-mail: [email protected]
Половинка М.П. - к.х.н., старший научный сотрудник лаборатории восстановительной медицины, доцент по специальности, е-mail: [email protected]
Жукова Н.А. - д.м.н., старший научный сотрудник лаборатории фармакологических исследований, e-mail: [email protected]
Толстикова Т.Г. - д.б.н., проф., зав. лабораторией фармакологических исследований, e-mail: [email protected]
более высокий уровень этих показателей у пациентов «алкогольной» группы по сравнению с пациентами с идиопатическим АНГБК. Авторы другого исследования предположили сходные механизмы развития АНГБК у пациентов с алкогольной зависимостью и принимающих стероиды, так как алкоголь стимулирует секрецию надпочечниками стероидного гормона кор-тизола [4].
В алкогольной модели на кроликах наблюдался значительно более высокий уровень холестерина в сыворотке крови и большее давление костного мозга в головке бедренной кости (ГБК) по сравнению с контрольной группой [10]. Эксперимент проводили в течение года, кролики получали ежедневно рисовое вино (в пересчете на этанол по 2 г/кг массы тела в сутки). Влияние алкоголя на трабекулы ГБК не было статистически значимым, но средний объем жировых клеток костного мозга ГБК был значительно больше в алкогольной группе, чем в контрольной. Изменения печени (жировая инфильтрация) произошли только у 20 % животных, получавших алкоголь. По мнению авторов, алкоголь, по-видимому, нарушает кровоток в костной ткани из-за жировой эмболизации сосудов или жировой интоксикации, а также может вызвать гибель клеток костной ткани путем токсического действия на остео-циты и другие элементы костной ткани.
Модели дегенеративных процессов в тазобедренном суставе, в том числе АНГБК, in vivo в последнее время, как правило, создаются путем введения 100%-го этанола непосредственно в сустав [6, 11, 13]. Такой подход вряд ли может пролить свет на механизм развития АНГБК при избыточном потреблении алкоголя.
Цель работы - изучение влияния хронической алкогольной интоксикации на развитие дегенеративных процессов в головке бедренной кости крыс.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Эксперимент выполнен на 20 лабораторных белых крысах-самцах одного помета массой 180-200 г, полученных из лаборатории разведения экспериментальных животных Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск), содержавшихся в стандартных условиях на обычном пищевом и водном рационе. Манипуляции с животными проводились согласно Женевской конвенции 1986 г. Крысы были рандомизированы по массе и разделены на три группы. Хроническую алкогольную интоксикацию моделировали на животных I (10 особей) и II группы (5 особей) путем ежедневного внутрижелудочного введения
40%-го этанола (50 мкл/кг массы тела) в сочетании с 5%-м и 10%-м раствором этанола соответственно в качестве питья ad libitum на протяжении 9 недель. III группа - интактные животные (5 крыс). Двигательную активность животных исследовали в тесте «открытое поле» каждые 10 дней. Кровь на биохимическое исследование забирали на 4 и 9 неделе, в эти же сроки забирали материал для гистологического исследования (печень и ГБК). Животных выводили из эксперимента путем декапитации.
Влияние хронической алкоголизации на поведение животных каждые 10 дней оценивали в тесте «открытое поле», который проводили с использованием оборудования и программного обеспечения «TruScan» (Coulborn Instruments, L.L.C., США). Двигательную активность оценивали по параметрам: количество актов движения, время движения и покоя, пройденная дистанция, средняя скорость движения и количество стоек в течение 120 с.
Объектами для светооптического исследования служили печень и ГБК крыс. Органы фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина в течение 5 суток. Кости декальцинировали в растворе Рихмана - Гельфанда - Хилла в течение 5 дней при комнатной температуре. Вырезали из органов образцы толщиной 5-7 мм и подвергали стандартной обработке на гистологическом комплексе MICROM (MICROM, Германия): обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации с последующей заливкой в парафиновые блоки. Срезы толщиной 4 мкм изготавливали на ротационном микротоме НМ 335Е (MICROM), окрашивали гематоксилином Лилли - Майера и 1%-м эозином на автомате HMS 70 (MICROM), время окраски - 1 ч 15 мин.
Биохимические показатели крови: активность АлАТ, АсАТ, щелочной фосфатазы, лактатдеги-дрогеназы (ЛДГ) и содержание общего билирубина - определяли с использованием стандартных диагностических наборов («Ольвекс диагности-кум») на фотометре 5010 «Boehringer Mannheim» (Германия).
При проведении статистической обработки количественных данных определяли средние значения показателей, стандартную ошибку среднего, достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе эксперимента гибели животных зарегистрировано не было. Масса тела всех крыс, потреблявших этанол, стабильно увеличивалась в ходе эксперимента, ее потерь не наблюдалось.
Таблица
Биохимические показатели крови животных при длительном введении этанола
Активность фермента, Ед/л I группа, 40 % + 5 % II группа, 40 % + 10 % III группа (контроль)
4 нед. 9 нед. 4 нед. 9 нед. 9 нед.
АлАТ 101,64 ± 8,98 68,16 ± 6,81* 93,10 ± 11,70 54,80 ± 4,40* 111,43 ± 11,73
АсАТ 253,40 ± 21,39* 195,04 ± 22,45 269,30 ± 26,90 181,30 ± 18,70 165,90 ± 27,18
Щелочная фосфатаза 407,48 ± 89,36 598,96 ± 138,29 720,95 ± 123,25 513,90 ± 111,50 393,23 ± 82,98
ЛДГ 2057,80 ± 182,67** 2014,00 ± 187,47** 2809,50 ± 310,50** 1638,50 ± 324,50 623,53 ± 230,95
Содержание общего билирубина, мкмоль/л 21,12 ± 1,47** 22,56 ± 1,92** 22,30 ± 3,50* 21,90 ± 2,70* 11,00 ± 1,98
Примечание. Обозначены статистически значимые отличия от величин соответствующих показателей группы контроля (* - прир < 0,05, ** - прир < 0,01).
Архитектоника печени крыс на протяжении всего эксперимента находилась без грубых патологических изменений. После 3 и 4 недель опыта у всех животных наблюдалось выраженное полнокровие вен и синусоидов. Балочное строение печеночных долек не нарушено. В перипорталь-ной зоне выявлялась мелко- и крупноочаговая гидропическая дистрофия гепатоцитов. Отмечалась незначительно выраженная гетерогенность ядер гепатоцитов, что свидетельствует об их функциональной напряженности. Через 9 недель эксперимента отмечалось усугубление дегенеративно-некротических процессов. В ткани печени наблюдались моноцеллюлярные и очаговые некрозы гепатоцитов. Перифокально выявлялись клетки в состоянии компрессии с признаками ацидофильной дегенерации. Отмечалась коллаге-низация портальных трактов. Выявлялись мелко-и крупноочаговые перипортальные лимфогистио-цитарные инфильтрации.
Наличие патологического процесса в печени подтверждается результатами биохимического исследования сыворотки крови (см. таблицу). Так, в крови животных, получавших этанол, отмечено двукратное повышение уровня билирубина по сравнению с контролем, а также недостоверное повышение активности щелочной фосфата-зы, что, по-видимому, обусловлено холестати-ческими явлениями в печени. Активность АлАТ в крови животных опытных групп снижена, а АсАТ - незначительно повышена по сравнению с контрольной группой, что можно связать с умеренно выраженными некротическими явлениями в печени, функциональной напряженностью и истощением гепатоцитов. Также в крови животных, которым вводили этанол, существенно повышена активность ЛДГ относительно контроля, что сви-
детельствует о гипоксии тканей, которая, вероятно, связана с нарушением гемодинамики, вызванным токсическим действием на них этанола.
ГБК имела шаровидную форму без признаков деформации. Ее поверхность покрыта гиалиновым хрящом. В периферической зоне хряща дегенеративных и деструктивных изменений хондроцитов не выявлено. В зоне зрелого хряща основная масса хондроцитов находилась в состоянии выраженной деструкции. Наблюдалось большое количество клеточных форм с признаками кариолизиса и пустых клеточных лакун. В глубокой зоне хряща отмечалось развитие очагового некроза хрящевой ткани с образованием кистообразных полостей, заполненных клеточным детритом и рыхлой соединительной тканью. Строение субхондральной кости без выраженных изменений (см. рисунок).
Результаты теста «открытое поле» показали, что на фоне длительной алкогольной интоксикации двигательная активность всех животных незначительно уменьшилась. У самцов крыс, получавших 5%-й этанол в качестве питья дополнительно к 40%-му, было отмечено достоверное уменьшение времени движения и, соответственно, увеличение времени покоя по сравнению с интактным контролем (р < 0,05), тогда как количество актов движения и средняя скорость существенно не отличались от контрольных показателей. Пройденная этими животными дистанция также была значительно меньше, чем в контроле (р < 0,05). У крыс, получавших 40%-й этанол в сочетании с 10%-м, достоверных отличий по этим параметрам от контрольной группы не наблюдалось. У всех животных, получавших этанол, также было незначительно уменьшено количество стоек.
Рис. а - головка бедренной кости интактного животного (III группа). Хрящевая ткань без признаков деструкции. Окраска гематоксилином и эозином, ув. х 200; б - головка бедренной кости крысы после 9-недельного внутрижелудочного введения 40%-го этанола (II группа). В зоне зрелого хряща - кистообразные полости с клеточным детритом. Костная ткань без изменений. Окраска гематоксилином и эозином, ув. х 200
Основным результатом представленной статьи является тот факт, что постоянное избыточное потребление алкоголя в течение 9 недель, на фоне развившегося алкогольного гепатита, приводит к развитию очагового некроза хрящевой ткани в глубокой зоне хряща с образованием ки-стообразных полостей.
В литературе деструкция суставного хряща прежде всего связывается с развитием остеоар-троза, обусловленного воспалительными процессами в синовиальной жидкости [1, 9]. Однако и в случае остеоартроза высказывается мнение о том, что на начальном этапе повреждается суб-хондральная кость, а далее развиваются деструктивные процессы в хрящевой ткани [2]. Повреждение хрящевой ткани именно в глубокой зоне хряща в последующем может привести к поражению трабекул субхондральной кости. Вполне возможно, что некротический процесс в ГБК за период эксперимента мог развиться глубже, но вследствие иной биомеханики и нагрузки на тазобедренный сустав у крыс дегенеративные процессы развиваются медленнее, чем у человека.
Избыточное потребление алкоголя, как правило, сопровождается нарушениями гемодинамики, в частности, застойными явлениями в области малого таза. Нарушение локального кровотока приводит к развитию хронической гипоксии тканей, вследствие чего хрящевая ткань становится в большей степени подверженной деструктивным изменениям. Следует отметить, что отсутствие собственных кровеносных сосудов является дополнительным фактором уязвимости гиалиновой хрящевой ткани по сравнению с костной. Нельзя исключить и прямое токсическое действие
алкоголя на хондроциты, поскольку наличие у молекул этанола одновременно гидрофильных и липофильных свойств способствует его распространению по всем тканям организма.
Таким образом, на фоне хронической интоксикации у животных развился алкогольный гепатит с деструкцией зоны зрелого хряща ГБК.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ревматология: национальное руководство / ред. Е.Л. Насонов, В.А. Насонова. М.: ГЭОТАР-Ме-диа, 2008. 573-588.
2. Хитров Н.А. Остеоартроз и остеоартрит - от новых взглядов в патогенезе к новому названию // Трудный пациент. 2014. (3). 30-34.
3. Assouline-Dayan Y., Chang C., Greenspan A. et al. Pathogenesis and natural history of osteonecrosis // Semin. Arthr. Rheum. 2002. 32. (2). 94-124.
4. Chernetsky S.G., MontM.A., LaPorte D.M. et al. Pathologic features in steroid and nonsteroid associated osteonecrosis // Clin. Orthop. 1999. 368. 149-161.
5. Levasseur R. Mechanisms of osteonecrosis // Joint Bone Spine. 2008. 75. (6). 639-642.
6. Meng F., Wen-Xue J., Ai-Yuan W. et al. Study of animal model of osteonecrosis induced by local ethanol injection in emu // Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 2014. 36. (4). 357-362.
7. Parsons S.J., Steele N. Osteonecrosis of the femoral head: Part 1 - Aetiology, pathogenesis, investigation, classification // Curr. Orthop. 2007. 21. (6). 457-463.
8. Rico H., Gomez-Castresana F., Cabranes J.A. et al. Increased blood cortisol in alcoholic patients with aseptic necrosis of the femoral head // Calcif. Tissue Int. 1985. 37. (6). 585-587.
9. Scanzello C.R., Goldring S.R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis // Bone. 2012. 51. (2). 249-257.
10. Shih C.H., Yang W.E., Lee Z.L. et al. Effect of long-term alcohol ingestion on the femoral head of rabbit // J. Formos Med. Assoc. 1991. 90. (5). 443447.
11. Wang C., Wang J., Zhang Y. et al. A canine model of femoral head osteonecrosis induced by an
ethanol injection navigated by a novel template // Int. J. Med. Sci. 2013. 10. (11). 1451-1458.
12. Zalavras C.G., Lieberman G.R. Osteonecrosis of the femoral head: Evaluation and treatment // J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2014. 22. (7). 455-64.
13. Zhu Z.H., Gao Y.S., Luo S.H. et al. An animal model of femoral head osteonecrosis induced by a single injection of absolute alcohol: an experimental study // Med. Sci. Monit. 2011. 17. (4). BR97-BR102.
INVESTIGATION OF DEGENERATIVE PROCESSES IN THE FEMORAL HEAD OF RATS WITH PROLONGED ALCOHOL INTOXICATION
Aleksei Gennadevich SHUSHARIN1, Marina Sergeevna BIRYUKOVA2, Marina Pavlovna POLOVINKA1, Natalia Anatolevna ZHUKOVA2, Tatyana Genrikhovna TOLSTIKOVA2
1 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of SB RAS 630090, Novosibirsk, Academik Lavrentev av., 8
2 N.N. Vorozhtsov Novosibirsk Institute of Organic Chemistry of SB RAS 630090, Novosibirsk, Academik Lavrentev av., 9
The research objective. The study of the effect of chronic alcohol intoxication on the development of degenerative processes in the femoral head of rats. Material and Methods. Chronic alcohol intoxication was modeled on male rats weighing 200-220g. For studies the rats were randomly assigned to groups: I and II groups received daily intragastrically 40% ethanol (0.5 ml per 100 g body weight) in combination with 5 % and 10 % solution of ethyl alcohol, respectively, as drinking ad libitum for 9 weeks; group III - intact animals. Effect of chronic alcohol abuse on animal behavior was evaluated in the test «open field» every 10 days. Results and discussion. The toxic hepatitis development has been revealed on the basis of biochemical and histological analysis on the background of alcohol intoxication in rats. Degenerative changes of chondrocytes in the peripheral zone of cartilage were not found histologically, while the majority of chondrocytes in the area of mature cartilage were in the state of severe degradation. Therefore, it is concluded that alcoholic hepatitis with the destruction of mature cartilage of the femoral head develops in animals on the background of chronic (9 week) alcohol intoxication.
Key words: alcoholic hepatitis, the femoral head, degenerative changes, rat.
Shusharin A.G. - candidate of medical sciences, head of the laboratory of regenerative medicine, assistant professor, e-mail: [email protected]
Biruykova M.S. - engineer of laboratory ofpharmacological investigation, e-mail: [email protected] Polovinka M.P. - candidate of chemical sciences, senior researcher of the laboratory of regenerative medicine, assistant professor, e-mail: [email protected]
Zhukova N.A. - doctor of medical sciences, senior researcher of the laboratory ofpharmacological investigation, e-mail: [email protected]
Tolstikova T.G. - doctor of biological sciences, head of the laboratory ofpharmacological investigation, professor, e-mail: [email protected]
