CC BY
19© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Н.И.Габриэлян1, Л.И.Арефьева1, Е.М.Горская1, Т.С.Спирина1, Л.Ю.Ромашкина1, О.С.Дарбеева2
ИССЛЕДОВАНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К БАКТЕРИОФАГАМ МИКРОФЛОРЫ, ИЗОЛИРОВАННОЙ ИЗ БИОСУБСТРАТОВ ПАЦИЕНТОВ ХИРУРГИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ
1ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И.Шумакова, 2Научный центр экспертизы средств медицинского применения, Москва
Цель. Изучение чувствительность к бактериофагам нозокомиальных микробов — возбудителей послеоперационных инфекционных осложнений пациентов хирургического профиля. Материалы и методы. Материалом служили изоляты микробов из биосубстратов 223 хирургических пациентов. Микробы выделены из крови, мочи, ран, сосудистых катетеров, дренажей брюшной полости, отделяемого зева, трахеи (343 штамма). Фаголизабильность штаммов определяли по методу Отта. Результаты. При наличии 83% метициллинрезистентных штаммов стафилококков и 94% штаммов грамотрицательных бактерий, вырабатывающих бета-лактамазы расширенного спектра, найдена хорошая лизабельность синегнойных палочек, клебсиелл, кишечных палочек специфическими комплексными и моно-фагами и более низкая — стафилококков и энтерококков. Заключение. Учитывая множественную резистентность микробов к антибиотикам перспективно продолжение использования различных препаратов бактериофагов против грамотрицательных бактерий и принятия мер к адаптации фаговых препаратов против стафилококков и энтерококков.
Журн. микробиол., 2014, № 2, С. 30—35
Ключевые слова: возбудители послеоперационных инфекционных осложнений, бактериофаги, лизабильность бактерий фагами
N.I.Gabrielyan1, L.I.Arefieva1, E.M.Gorskaya1, T.S.Spirina1, L.Yu.Romashkina1, O.S.Darbeeva2
STUDY OF SENSITIVITY OF MICROFLORA ISOLATED FROM BIOSUBSTRATES OF SURGICAL PROFILE PATIENTS TO BACTERIOPHAGES
1Shumakov Federal Scientific Centre of Transplantology and Artificial Organs, 2Scientific Centre of Expertise of Means of Medical Application, Moscow, Russia
Aim. Study sensitivity of nosocomial microbes — causative agents of post-operative infectious complications in surgical profile patients to bacteriophages. Materials and methods. Microbe isolates from biosubstrates of 223 surgical patients served as material. Microbes were isolated from blood, urine, wounds, intravascular catheters, abdominal cavity drainage, discharge of pharynx, trachea (343 strains). Phagolysability of strains was determined by Ott method. Results. A good lysability of Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Escherichia coli by specific complex and mono-phages and lower — of staphylococci and enterococci was found in the presence of 83% methicil-lin-resistant staphylococci strains and 94% Gram-negative bacteria strains producing extended spectrum beta-lactamases. Conclusion. Continuation of use of various bacteriophage preparations against Gram-negative bacteria and implementation of measures to adopt phage preparations to staphylococci and enterococci are perspective considering multiple resistance of microbes to antibiotics.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 2, P. 30—35
Key words: post-operative infectious complication causative agents, bacteriophages, lysability of bacteria by phages
ВВЕДЕНИЕ
Проблемой мирового масштаба стало повсеместное распространение множественной устойчивости к антибиотикам возбудителей гнойно-септических заболеваний, связанных с госпитальными условиями. По данным отечественных и зарубежных авторов ежегодно возрастает частота выделения метициллинрези-стентных штаммов грамположительных микроорганизмов и грамотрицательных бактерий, вырабатывающих бета-лактамазы, в том числе расширенного спектра (БЛРС), особенно возбудителей послеоперационных инфекционных осложнений [15, 17].
Использование неэффективных схем антибиотикотерапии сопровождается не только отсутствием ожидаемого воздействия на возбудителей инфекции, но и сопряжено с развитием побочных явлений и нежелательных реакций. В числе наиболее известных и обсуждаемых — подавление нормальной микрофлоры, формирование синдрома кишечной недостаточности с закономерными последствиями в виде разнообразных метаболических нарушений, ведущих к угнетению иммунных реакций и снижению естественной сопротивляемости. Для повышения результативности терапии предлагаются такие варианты, как дробное введение препарата, использование комплексных схем в виде сочетания антибиотиков различных групп [15]. Одним из резервов антибактериальной терапии являются бактериофаги. В нашей стране в качестве лекарственных средств зарегистрированы лечебно-профилактические бактериофаги против основных возбудителей гнойно-воспалительных инфекций — стафилококковый, стрептококковый, протейный, клебсиелл пневмонии, клебсиелл озены и риносклеромы, синегнойный, а также фаги против возбудителей кишечных инфекций — коли, сальмонеллезный и др. Они содержат комплексы высоковирулентных (литических) бактериальных вирусов, активных в отношении гомологичных видов бактерий, независимо от их устойчивости к антибиотикам. Благодаря строгой специфичности действия бактериофаги не подавляют нормальную микрофлору и механизмы иммунной защиты, не обладают аллергизирующим действием. Лечебно-профилактические бактериофаги представляют собой стерильные очищенные фильтраты фаголиза-тов соответствующих видов бактерий, освобожденные от эндо- и экзотоксинов, продуктов фаголизиса бактериальных клеток. Разработаны комбинированные препараты из нескольких бактериофагов, например, коли-протейный, пиобакте-риофаг поливалентный и др. Бактериофаги не имеют противопоказаний к применению и могут использоваться в сочетании с другими лекарственными препаратами, в том числе с антибиотиками. В отечественном здравоохранении имеется опыт успешного применения бактериофагов в различных областях медицины [1 — 8, 12, 16, 17]. Согласно данным многих исследователей эффективность фаготерапии во многом определяется фагочувствительностью возбудителя [9, 12, 14, 16].
Цель работы — оценка чувствительности к лечебно-профилактическим бактериофагам микроорганизмов, выделенных в 2012 г. из клинических субстратов, полученных от пациентов кардиохирургического и трансплантологического профиля в различные сроки до и после проведения хирургических операций.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследованию подвергали микробы, выделенные из крови, мочи, ран, сосудистых катетеров, дренажей брюшной полости, отделяемого зева, трахеи от 223 пациентов после операций аортокоронарного шунтирования, реконструктивных операций на клапанах сердца, ортотопической трансплантации сердца и печени, трансплантации доли печени от родственного донора, трансплантации комплек-
са сердце-легкие. Возраст пациентов — от нескольких месяцев до 67 лет. Посев материала проводили на стандартизированные питательные среды фирмы «Pronadisa» (Испания). Для выявления бактериемий применяли способ культивирования гемокультур в автоматической системе BactAllert фирмы BioMerieux. Идентификацию выделенных микроорганизмов (343 штамма) осуществляли с помощью высокочувствительных компьютеризированных аналитических систем BBL BD Crystal (USA). Исследование биологических свойств изолированных микроорганизмов (гемолизин-продукции, плазмокоагуляции и др.) проводили общепринятыми методами. Метициллинрезистентность как маркер множественной резистентности грамположительных бактерий к антибиотикам исследовали диско-диффузионным методом по чувствительности выделенных штаммов к оксациллину и цефокситину. Бета-лактамазную активность — маркер множественной резистентности грамотрицательных бактерий к антибиотикам определяли по чувствительности изолятов к цефотаксиму и цефотаксим/клавуланату, а также к цефтазидиму.
Фаголизабильность изучали с помощью лечебно-профилактических бактериофагов НПО «Микроген». Использовались комбинированные препараты: коли-протейный (Нижегородский филиал); пиобактериофаг поливалентный очищенный (Уфимский филиал), содержащий фаги — стафилококковый, стрептококковый, протейный, клебсиелл пневмонии, синегнойный; коли и пиобакте-риофаг комплексный (Нижегородский. филиал) — те же компоненты пиобакте-риофага + фаги против Klebsiella oxytoca. Из монопрепаратов использовали бактериофаг клебсиелл пневмонии, стрептококковый, синегнойный. Определение фагочувствительности проводили методом фаговых бляшек [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Следует отметить, что в 2012 г., как и в предыдущие годы, преобладающими (58,6%) среди госпитальной микрофлоры стационара оказались штаммы грампо-зитивной флоры (гр+). Доминирующими среди них были стафилококки, причем коагулазонегативные стафилококки (CNS) составили 44% от всей микрофлоры и 25,8% от гр+ микробов; Staphylococcus aureus — 4,6% всех микробов. Частота встречаемости энтерококков — 20,5% от всего спектра и 12% — от гр+ микрофлоры. Штаммы K. pneumoniae доминировали среди представителей гр- бактерий, составляя 31% в этой группе и 13% от общего спектра. Неферментирующие гр-микроорганизмы (представители Acinetobacter spp. и Pseudomonas spp.) выделены в 28,2% случаев. Таким образом, именно CNS, как и в ведущих кардиохирургиче-ских стационарах, явились основными этиологическими агентами при развитии инфекционных осложнений и эпизодов инфекции.
У 134 штаммов грамположительных и 209 грамотрицательных бактерий определяли фагочувствительность к фаговым препаратам.
Из 108 штаммов стафилококков более 70% составили коагулазонегативные стафилококки. Основными субстратами выделения были образцы крови, раневого отделяемого, внутриполостные жидкости. Коагулазонегативные стафилококки лизировались обоими видами пиобактериофагов лишь в 17,9% случаев. Выявление фагочувствительных S.aureus было более частым — пиобактериофагом комплексным лизировались 12 из 30 штаммов S.aureus, что составило 40%, тогда как пиобактериофагом поливалентным — всего 8 штаммов (26,7%). При этом стафилококки, выделенные из ран, лизировались в 43% случаев. Следует отметить, что частота выявления среди стафилококков метициллинрезистентных штаммов составила 83%.
Было протестировано 26 штаммов различных видов энтерококков (Enterococcus faecalis, E.durans, E.faecium), выделенных от 22 больных из мочи, крови, дренажей
и ран. У некоторых пациентов еще до оперативного вмешательства энтерококки изолированы из крови, мочи, зева. Частота лизиса энтерококков пиобактериофа-гом комплексным и стрептококковым фагом составила 23,1%, пиобактериофагом поливалентным — 30,8%. При этом в половине случаев энтерококки, выделенные из крови, были чувствительны к пиобактериофагу комплексному и стрептококковому бактериофагу, а среди изолятов из дренажей также 50% штаммов лизиро-вались, но уже пиобактериофагом поливалентным.
Среди гр- бактерий чаще всего (13,3%) из клинического материала высевали клебсиеллы, которые в 94% случаев продуцировали БЛРС. Из них 144 штамма от 110 больных, выделенных из мочи, фекалий, дренажей, брюшной полости, ран, были тестированы двумя препаратами: пиобактериофагов и бактериофага клеб-сиелл пневмонии. В 49,3% случаев штаммы лизировались монофагом — бактериофагом клебсиелл пневмонии, в 45,1% случаев клебсиеллы были чувствительны к пиобактериофагу комплексному и лишь 33,3% случаев — к пиобактериофагу поливалентному.
36 штаммов синегнойной палочки выделено от 30 пациентов. Микробы изолированы из крови, раны, дренажей (18 штаммов); из мочи, зева, сосудистых катетеров, абсцессов (12 штаммов), из остальных субстратов — трахеи, мокроты и др. — по 1 — 2 штамма. В целом, близкие показатели фагочувствительности отмечены в отношении пиобактериофага комплексного — 52,8%, пиобактериофага поливалентного — 50,0% и синегнойного бактериофага — 47,2% штаммов. При этом наибольшая чувствительность к комплексному пиобактериофагу отмечена среди изолятов из ран, мочи и дренажей (60 — 66,7% штаммов).
Определена фагочувствительность 20 штаммов Escherichia coli от 15 больных (из мочи — 13 штаммов, из фекалий, сосудистых катетеров — 7 штаммов). В 50% случаев штаммы лизировались коли-протейным бактериофагом, в 40% — пио-бактериофагом комплексным и в 20% — пиобактериофагом поливалентным.
При исследовании фаголизабельности штаммов Proteus spp. (9 штаммов от 7 пациентов) из фекалий, дренажа брюшной полости мочи установлено, что лишь в 33,3% случаев штаммы были чувствительны к коли-протейному фагу и в 22,2% — к пиобактериофагам комплексному и поливалентному.
ОБСУЖДЕНИЕ
Снижение эффективности антибиотикотерапии из-за лекарственной устойчивости бактериальных возбудителей, быстрое формирование резистентных форм даже к новым антибиотикам, отсутствие резервов в создании новых препаратов этого класса — все это обусловливает растущий интерес специалистов к бактериофагам в качестве антибактериальных средств [1].
Терапия фагами стала применяться не только в инфекционных клиниках, но и при лечении инфекционных осложнений в хирургической практике. Так, описан положительный опыт применения лечебных бактериофагов у больных с гнойным перитонитом при многократных санациях брюшной полости [4]. Препараты бактериофагов назначают как в виде монотерапии, так и в сочетании с антибиотиками. Успешно использован поливалентный пиобактериофаг у пациентов с инфекцией места хирургического вмешательства [16]. Фаги применялись при инфицированных ожоговых ранах и других видах хирургических инфекций [6 — 8, 10]. Впервые бактериофаг был успешно применен для лечения гнойно-септических осложнений у больной с почечным аллотрансплантатом [13]
Возможность использования фаговых препаратов во многом определяется фагочувствительностью возбудителей, особенно для стационаров, где причиной развития послеоперационных инфекционных осложнений, как правило, являются госпитальные штаммы со множественной устойчивостью к антибиотикам.
3. ЖМЭИ 2 № 30
33
Полученные в нашем исследовании результаты свидетельствуют о сравнительно невысоком уровне распространения штаммов, чувствительных к препаратам бактериофагов. Однако при сопоставлении с антибиотикорезистентностью клинически значимых штаммов они указывают на перспективность этого направления в клинике трансплантологии.
Патогенный потенциал клебсиелл связан с формированием «островков пато-генности», опасных не только в плане проявления факторов вирулентности, но и в плане генетической передачи другим представителям микрофлоры [2]. Клебсиеллы пневмонии в нашей клинике составили 13,3% от общего числа всех выделенных микроорганизмов и почти треть изолированных грамотрицательных микробов (31%). По нашим данным, клебсиеллы чаще лизировались двумя препаратами — пиобактериофагом комплексным и бактериофагом клебсиелл пневмонии очищенным (в 45 — 49% случаев). Учитывая, что 94% выделенных штаммов клебсиелл продуцировали БРЛС, почти в половине случаев показана возможность применения бактериофагов.
Кишечные палочки — нередкие возбудители послеоперационных инфекционных осложнений мочевыводящих путей. Коли-протейный бактериофаг лизи-ровал 50% Escherichia coli, большая часть которых выделена из мочи.
Синегнойная инфекция вызывает тяжелые поражения у пациентов при трансплантации органов. При этом терапия, как правило, не эффективна из-за множественной резистентности микроорганизмов. Активны бывают только от 1 до 4 антибиотиков, чаще — колистин, цефепим, азтреонам, амикацин, реже — другие. В наших исследованиях почти половина выделенных штаммов синегнойной палочки были чувствительны к синегнойному бактериофагу (47,2%), пиобактерио-фагу поливалентному — в 50% и пиобактериофагу комплексному — в 52,8% случаев. Это подтверждает возможность использования специфических бактериофагов в комплексной терапии этой инфекции, независимо от антибиотико-резистентности возбудителя.
Фагочувствительность золотистых стафилококков, в большинстве своем ме-тициллинрезистентных и выделенных преимущественно из ран, дренажей и крови, составляла от 26,7 до 40%. Среди коагулазонегативных стафилококков, наиболее актуальных патогенов в кардиохирургии, отмечена наименьшая частота выявления фаголизабельных штаммов — 17,9% обоими пиобактериофагами. Эти данные значительно отличаются от результатов определения лизабельности штаммов S.aureus, изолированных от больных с различными проявлениями гнойно-воспалительных инфекций, имеющихся в литературе — 80 — 92%. Стафилококковый бактериофаг имеет наибольший диапазон действия в отношении штаммов S.aureus по сравнению с другими фаговыми препаратами [11]. Однако в связи с возрастанием клинической значимости коагулазонегативных стафилококков, производители начали вводить их в производственные штаммы и адаптировать к ним стафилококковый бактериофаг.
Выявленные различия в активности моно- и комбинированных бактериофагов в отношении одних и тех же штаммов связаны со спецификой фагового производства, где каждое предприятие имеет свою уникальную коллекцию производственных бактериальных и фаговых штаммов, ориентированную на регионы реализации препарата. Поэтому при определении фагочувствительности возбудителей нозокомиальных штаммов желательно использовать набор из моно- и комбинированных препаратов, произведенных на разных предприятиях, объединенных в филиалы НПО «Микроген». Обязательное ежегодное пополнение производственных штаммов за счет свежевыделенных изолятов от больных обеспечивает адаптацию фаговых препаратов к циркулирующим бактериальным возбудителям. Производители заинтересованы в получении штаммов от больных,
в том числе фагоустойчивых вариантов. Тем самым, возможна адаптация фаговых препаратов к госпитальным штаммам стационаров и создание целевых производственных серий.
Проведенные нами исследования показывают на основании данных in vitro перспективность использования бактериофагов против клебсиелл, кишечных и синегнойных палочек в лечении послеоперационных инфекционных осложнений, вызванных указанными микроорганизмами. Важной является селекция новых, более активных бактериофагов, лизирующих коагулазоотрицательные стафилококки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бондаренко В.М. Клинический эффект и пути рационального использования лечебных бактериофагов в медицинской практике. Фарматека. 2011, 1: 29-34.
2. Бондаренко В.М., Фиалкина С.В., Агапова О.В. Клебсиеллы и клебсиеллезы. М., 2008.
3. Габриэлян Н.И, Горская Е.М Современный взгляд на бактериофаги и механизмы их действия. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2012, 1: 106-113.
4. Гостищев В.К., Станоевич У.С., Алешкин В.А. и др. Третичный перитонит: возможности его профилактики. Хирургия. 2011, 9: 15-18.
5. Дроздова О.М., Брусина Е.Б. Применение бактериофагов в эпидемиологической практике: взгляд через столетие.Эпидемиол. инф. болезни. 2010, 5: 20-24.
6. Катер Э., Сулаквелидзе А. Бактериофаги: биология и практическое применение. М., Научный мир, 2012.
7. Лазарева Е.Б. Бактериофаги и пектины в коррекции нарушений микробиоценозов при гнойно-воспалительных процессах. Автореф. дисс. д-ра мед. наук. М., 2007.
8. Лахно В.М., Бордуновский В.Н. Применение фаготерапии в хирургической практике. Вестник хирургии им. И.И. Грекова. 2001, 160 (1): 122-125.
9. Майская Л.М., Дарбеева О.С., Парфенюк Р.Л. и др. Методика определения фагочув-ствительности бактериальных штаммов, выделенных от больных, к препаратам бактериофагов. Биопрепараты. 2003, 2: 22-23.
10. Матвеев А.С. Антибактериальная терапия у хирургических больных с нозокомиальной абдоминальной инфекцией. Автореф.дисс. канд. мед. наук. М., 2010.
11. Медицинские иммунобиологические препараты. Н.В.Медуницин (ред.). М., Гелла-Принт, 2011.
12. Парфенюк Р.Л. Микробиологические основы пероральной фаготерапии гнойно-воспалительных заболеваний. Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 2004.
13. Прокопенко Е.И., Щербакова Е.О., Ватазин А.В. и др. Применение бактериофага для лечения гнойно-септических осложнений у больной с почечным аллотрансплантатом. Урология. 2005, 6: 43-46.
14. Суворова М.А., Рябчук Ф.Н. Чувствительность микробиоты кишечника к бактериофагам и пробиотикам у детей с заболеваниями органов пищеварения. Лечащий врач. 2011, 6: 21-23.
15. Стратегия и тактика применения антимикробных средств в лечебных учреждениях России. М., 2012.
16. Хайруллин И.Н., Поздеев О.К., Шаймарданов Р.Ш. Эффективность применения специфических бактериофагов в лечении и профилактике хирургических послеоперационных инфекций. Казанский мед.журнал. 2002, 4: 258-261.
17. Wilcox M.H. The tide of antimicrobial resistance and selection. Int. J. Antimicrob. Agents. 2009, 34: 6-10.
Поступила 18.06.13
Контактная информация: Горская Елена Михайловна, д. м. н., 123182, Москва, ул. Щукинская, 1
