CC BY
2Т.Н. Занданова, канд. техн. наук, доц., e-mail: tuyana35@mail.ru П.А. Гоголева, канд. техн. наук, доц., e-mail: imka-go@mail.ru Якутская государственная сельхозакадемия, г. Якутск
УДК 602.3:579.8
ИССЛЕДОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА МИКРОБНОГО КОНСОРЦИУМА
В статье приведены результаты исследования биотехнологической активности микробного консорциума, полученного путем автоселекции микрофлоры кефирной закваски и термофильных лак-тобактерий. Показано, что микробный консорциум обладает высокой ферментирующей активностью и формирует характерные для курунги и кумыса качественные показатели.
Установлена высокая антагонистическая активность микробного консорциума, выявлена ее способность подавлять развитие E. coli I53, и S. sonnei 2848. На основании сравнительного анализа адгезии микрофлоры микробного консорциума, кефирной грибковой закваски и чистых культур L. bul-garicus и L. acidophilus установлено, что микробные сообщества обладают большей адгезивной активностью. Результаты исследований динамики синтеза экзополисахаридов (ЭПС) в процессе автоселекции показывают, что культивирование при экстремальных значениях активной кислотности среды повышает ЭПС потенциал микробного консорциума.
Ключевые слова: курунга, кумыс, кефирная закваска, адгезивная активность, биосинтез экзополисахаридов, микробный консорциум.
T.N. Zandanova, Cand. Sc. Engineering, Assoc.Prof., P.A. Gogoleva, Cand. Sc. Engineering, Assoc.Prof.
THE RECEARCH OF BIOTECHNOLOGICAL POTENTIAL OF MICROBIAL CONSORTIUM
The article presents the results of a study of the biotechnological activity of a microbial consortium obtained by autoselecting the microflora of a kefir fungus and thermophilic lactobacilli. It is shown that the microbial consortium possesses high fermenting activity and forms qualitative indicators specific to kurunga and koumiss.
Studies of the antagonistic activity of the microbial consortium revealed its ability to inhibit the development of E. coli I53 and S.sonnei 2848.and S.sonnei 2848. Based on a comparative analysis of the adhesion of the microflora of the microbial consortium, kefir fungus and pure cultures of L.bulgaricus and L. acidophilus, it was found that microbial consortium has more adhesive activity. The results of studying the synthesis dynamics of exopolysaccharides (EPS) in the autoselection process show that cultivating the active acidity under extreme values increases the EPS potential of the microbial consortium.
Key word: kurunga, koumiss, kefir fungus, pH, adhesive activity, biosynthesis of exopolysacharides, microbial consortium.
Введение
Курунга и кумыс - национальные кисломолочные продукты гетероферментативного брожения, издавна используемые в сочетании с антибиотиками для предупреждения и лечения различных форм туберкулеза, желудочно-кишечных и сердечно-сосудистых заболеваний, при авитаминозе и нарушениях обмена веществ, при заболеваниях нервной системы и общем упадке сил. Лечебные свойства этих продуктов обусловлены их микробиологическим составом. Микрофлора этих напитков содержит термофильные и мезофильные лактобактерии, аце-тобактерии, дрожжи, сбраживающие и не сбраживающие лактозу [9, 10, 11, 14].
Проблеме создания микробного консорциума курунги и кумыса посвящен ряд отечественных и зарубежных исследований. Обзор современных технологий гетероферментатив-ных кисломолочных продуктов показал, что для получения стартовых культур в основном используются чистые культуры лактобактерий и дрожжей [7, 12].
Известные современные технологии производства курунговых и кумысных заквасок на чистых культурах не нашли широкого промышленного внедрения. В таких заквасках при всей тщательности подбора штаммов дрожжей и лактобактерий не удается составить симбиоз, характерный для естественной популяции микроорганизмов этих продуктов. Поэтому применение заквасок на чистых культурах в промышленном производстве не гарантирует получение продукта со стабильными показателями.
Единственным кисломолочным продуктом гетероферментативного брожения, производимый в промышленном масштабе на естественной закваске, является кефир.
Известно, что микрофлора кефира представляет естественный симбиоз различных видов дрожжей, сбраживающих и не сбраживающих лактозу, термофильных и мезофильных лакто-бактерий, ацетобактерий, молочнокислых стрептококков, ароматобразующих бактерий, обладающих исключительной способностью к саморегулированию своего состава [13, 14].
Нами разработан способ получения микробного консорциума путем длительной автоселекции микрофлоры кефирной грибковой закваски в присутствии термофильных лактобакте-рий Lactobacillus bulgaricus и Lactobacillus acidophilus, идентичных по составу микрофлоре курунги и кумыса [4].
Целью данного исследования было изучение биотехнологического потенциала полученного микробного консорциума.
Объекты и методы исследования
В качестве объекта исследования использовали симбиотический микробный консорциум, полученный путем длительной автоселекции комбинированной закваски, состоящей из кефирной грибковой закваски и термофильных лактобактерии Lactobacillus acidophilus и Lac-tobacillus bulgaricus в соотношении 1:0,5:0,5 соответственно. Автоселекцию комбинированной закваски проводили при 30 °С при рН 4 -3,5.
Для исследований использовали:
- обезжиренное пастеризованное при 95 °С с выдержкой 15 мин коровье молоко, охлажденное до 30 °С;
- кобылье молоко, пастеризованное при 60 °С с выдержкой 10 мин, охлажденное до 30 °С.
Кислотность определяли по ГОСТ 54669-2011
Массовую долю спирта - пикнометрическим методом по ГОСТ 3629-47.
Количество молочной кислоты определяли методом Пиккеринга и Клега [5].
Количественный учет микроорганизмов проводили методом предельных разведений по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) при высевах на агаризованных лактозно-картофель-ном и глюкозно-картофельном средах для дрожжей, сбраживающих/несбраживающих лактозу соответственно, молочнокислых бактерий на среде ГМК по ТУ10-02-02-789-192-95.
Адгезивные свойства изучали на формалинизированных эритроцитах по развернутому методу В.И. Брилиса [1].
Антибиотическую активность определяли методом последовательных разведений по М.С. Полонскому. В исследованиях антибиотической активности использовали тест-культуры E. coli I53 and S. sonnei 2848 .
Результаты и их обсуждение
Развитие биохимических процессов и показатели качества кисломолочных продуктов зависят от состава и свойств микроорганизмов, а также от состава сквашиваемого молока. Ис-
следовано влияние вида молока на биохимическую активность микробным консорциумом, полученного автоселекцией микрофлоры кефирной грибковой закваски в сочетании термофильных лактобактерий.
В подготовленное коровье и кобылье молоко вносили по 10% закваски на основе микробного консорциума. Сквашивание проводили при 30 °С.
Результаты исследований представлены в таблице 1.
Таблица 1
Биохимическая активность микробного консорциума
Исследуемые свойства Характеристика показателей
на коровьем молоке на кобыльем молоке
Продолжительность сквашивания, ч 14-15 8-10
Титруемая кислотность,0Т 210-220 140-160
Активная кислотность, ед. 3,6+ 0, 1 3,9+ 0, 1
Массовая доля спирта, % об. 0,9 + 0,1 1,2+ 0,1
Массовая доля молочной кислоты, % 1,4+ 0,2 1,2+ 0,2
ЭПС, мкг/мл 15+2
Количество жизнеспособных
клеток, КОЕ/мл:
термофильные лактобактерии 10 6 10 5
мезофильные лактобактерии 109 108
дрожжи, сбраживающие лактозу 107 108
дрожжи, не сбраживающие лактозу 105 107
уксуснокислые бактерии 104 104
Органолептические свойства Вкус кисломолочный, с дрожже- Вкус кисломолочный, с выра-
вым привкусом, консистенция женным дрожжевым привку-
жидкая, хлопьевидная, слегка га- сом, консистенция жидкая, мел-
зированная кодисперсная, хлопьевидная,
газированная
Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют о способности полученного микробного консорциума к саморегуляции состава микрофлоры в зависимости от состава питательного субстрата. При ферментации кобыльего молока наблюдается увеличение количества дрожжей и повышение спиртообразующей активности, связанное, вероятно, с повышенным содержанием лактозы в кобыльем молоке. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования полученного микробного консорциума для производства курунги и кумыса.
Полученный микробный консорциум формирует характерные для курунги и кумыса ор-ганолептические свойства, обладает необходимой энергией кислотообразования и спиртооб-разования.
Антагонистическая активность в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры является важнейшей характеристикой микрофлоры курунги и кумыса. Поэтому была исследована антагонистическая активность созданного микробного консорциума в сравнении с кефирной закваской по отношению к тест-культурам E. coli I53 и S. sonnei 2848. Результаты исследований представлены в таблице 2.
Таблица 2
Антибиотическая активность заквасок к E.coli I53 и S. sonnei 2848
Вид закваски Рост бактерий в разведениях
E. coli I53 S. sonnei 2848
Отсутствие роста Торможение роста Отсутствие роста Торможение роста
Кефирная закваска 1:4 1:32 1:4 1:64
Микробный консорциум 1:8 1:64 1:16 1:128
Как видно из данных таблицы 2, микрофлора микробного консорциума обладает наиболее выраженным по сравнению с кефирной закваской бактерицидным и бактериостатическим действием по отношению к E. coli I53 и S. sonnei 2848.
Бактерицидное действие микробного консорциума по отношению к E. coli проявлялось в разведении 1:8, а к S. sonnei - 1:16, бактериостатическое действие в разведении 1:64 и 1:128 соответственно.
Адаптация к факторам внешней среды обеспечивается механизмами, гарантирующими стабильность микробного консорциума. К таким механизмам относятся межклеточная когезия и адгезия бактерий.
Адгезивные свойства микробного консорциума оценивали по среднему показателю адгезии (СПА), коэффициенту участия эритроцитов (КУЭ), об адгезивности культур и микробного консорциума судили по индексу адгезивности микроорганизмов (ИАМ) [1].
Ранее нами были проведены исследования адгезиной активности микробного консорциума и динамика прироста экзополисахараидов (ЭПС) в процессе автоселекции микрофлоры кефирной закваски и термофильных лактобактерий [6]. Результаты сравнительной оценки адгезивной активности полученного микробного консорциума, кефирной грибковой закваски и чистых культур L. acidophilus и L. bulgricus представлены в таблице 3.
Таблица 3
Адгезивность микробного консорциума и чистых культур лактобактерий
Наименование опыта СПА КУЭ ИАМ Адгезивные свойства
L. acidophilus 3,3 78 2,9 среднеадгезивные
L. bulgaricus 1,73 72 2,4 низкоадгезивным
Кефирная грибковая закваска 3,3 74 4,4 высокоадгезивные
Микробный консорциум 3,8 78 4,8 высокоадгезивные
Из данных таблицы 3 следует, что лактобациллы по разному адгезируются к эритроцитам человека in vitro: индекс адгезивности был наиболее высоким у микробного консорциума - (4,8), кефирной закваски (4,4), средним у L. acidophilus (2,9), умеренным у L. bulgаricus (2,4).
Исследования биосинтеза ЭПС в процессе автоселекции микрофлоры кефирной грибковой закваски и термофильных лактобактерий для получения микробного консорциума представлены на рисунке.
0 24 48 72
-х-ЭПС —А—рН Время, ч
Рисунок - Динамика ЭПС и рН в процессе автоселекции микрофлоры кефирной закваски и термофильных лактобактерий
Из данных, представленных на рисунке, видно, что синтез ЭПС начинается с первых часов автоселекции и максимально концентрируется в стационарной фазе. Установленная динамика зеркально отражает динамику рН: прирост ЭПС по времени совпадает с резким снижением рН до 3,5, дальнейшее ведение автоселекционного процесса полунепрерывным культивированием стабилизирует рН среды и синтез ЭПС.
На основании этих данных можно считать, что изменения в динамике ЭПС связаны с процессами саморегуляции микрофлоры.
В начале автоселекционного процесса наблюдается уменьшение количества неустойчивых к низкой кислотности среды мезофильных молочнокислых палочек и стрептококков. Несмотря на неблагоприятные условия окружающей среды, популяции этих микроорганизмов сохраняются в небольших количествах в создаваемом микробном консорциуме [4].
Прирост ЭПС в исследуемых образцах в течение автоселекции можно рассматривать как стрессовый ответ формируемого микробного консорциума на изменения рН и температуры среды.
Одна из точек зрения на причину формирования симбиотических микробных сообществ исходит из предположения, что эти сообщества являются способом защиты микроорганизмов от неблагоприятных условий. Действительно, микроорганизмы в сообществах более устойчивы к различным воздействиям: изменениям рН, температуры, лимитированию субстратами и др. В таких сообществах между видами конкуренции не существует [2, 3, 8, 13].
Значительную роль в приобретаемой устойчивости играют ЭПС. Микроорганизмы в зависимости от конкретных условий существования синтезируют ЭПС различного состава и свойств. Экзогенные углеводы выполняют функцию саморегулятора процессов роста и развития, осуществляют важную трофическую функцию в экосистемах [3].
Адаптация микроорганизмов в микробных сообществах к экстремальным условиям культивирования приводит к формированию устойчивых симбиозов. Наличие симбиотиче-ских взаимоотношений в полученном микробном консорциуме подтверждаются высокой плотностью микрофлоры и биохимической активностью, способностью синтезировать антибиотические субстанции, ЭПС и др.
Выводы
1. Полученный микробный консорциум формирует характерные для курунги и кумыса органолептические свойства, обладает необходимой энергией кислотообразования и спирто-образования.
2. Результаты исследований свидетельствуют о возможности получения микробного консорциума, идентичного по своему составу естественной популяции микроорганизмов ку-рунги и кумыса, обладающего высокой антибиотической активностью к патогенной микрофлоре.
3. Установлены высокая адгезивная активность микробного консорциума и экзополиса-харидный потенциал, способствующий стабильности его состава.
Полученные результаты открывают широкие перспективы для применения микробного консорциума в производстве биологически активных добавок и кисломолочных продуктов.
Библиография
1. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П. и др. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов // Лабораторное дело. - 1986. - № 4. - С. 210-214.
2. Голод Н.А., Лойко Н.Г., Мулюкин А.Л. и др. Адаптация молочнокислых бактерий к неблагоприятным для роста условиям // Микробиология. - 2009. - Т. 78, № 3. - С. 317-335.
3. Еникеев Р.Р. Влияние условий накопления бактериальных полисахаридов при производстве кефира // Известия вузов. Пищевая технология (Химия пищевых продуктов и материалов). - 2010. -№ 5/6. - С. 15-19.
4. Занданова Т.Н. Симбиотическая закваска для производства курунги // Пищевая промышленность. - 2009.- № 7.- С. 48-49.
5. Инихов Г.С., Брио Н.П. Методы анализа молока и молочных продуктов. - М.: Пищевая промышленность, 2001. - 318 с.
6. ХамагаеваИ.С., Занданова Т.Н., ЗамбаловаН.А. Влияние условий автоселекции на синтез эк-зополисахаридов и адгезивную активность микробного консорциума // Вестник ВСГУТУ. - 2013. -№ 2.- C. 57-63.
7. Патент SU 651776 Способ производства кисломолочного напитка «Курунга» / Лев Г.Б., Пат-куль Г.М. - Заявл. 12.05.1977; опубл. 15.03.1979.
8. Николаев Ю.А. Внеклеточные факторы адаптации бактерий к неблагоприятным условиям среды // Прикладная биохимия и микробиология. - 1997. - Т. 40, № 4. - С. 387-397.
9. Решетник Л.А. Микробиологическая и клиническая характеристика // Сибирский медицинский журнал. - 2007. - Т. 69 (2). - С. 88-91.
10. Сорвачева О.А. Новый кисломолочный продукт - курунга // Переработка молока: технология, оборудование, продукция // Технология. - 2009. - № 5- С. 36-37.
11. Цэнд-Аюуш Ч., Ганина В.И. Пробиотические свойства молочнокислых бактерий, выделенных из национальных молочных продуктов Монголии // Техника и технология пищевых производств. -2013. - № 1. - С. 58-63.
12. Чужова З.П. Курунга - лечебный и диетический напиток из коровьего молока // Вопросы питания. - 1964. - Т. XXII, № 5.
13. Фильчакова С.А., Королева Н.С. Влияние условий культивирования на состав и микрофлору кефирных грибков // Молочная промышленность. - М., 1997. - № 5. - С. 37.
14. Фильчакова С.А. Национальный кисломолочный напиток - кефир // Переработка молока. -2010. - № 1. - С. 34-35.
15. Burentegusi, Streptococcus microflora in traditional starter cultures for fermented milk, hurunge, from Inner Mongolia, China / Streptococcus Burentegusi, B. Yu, T. Miyamoto // Animal Science Journal. -
2006. - Vol. 77 (2). - P. 235-241.
Bibliography
1. Brilis V.I., Brilene T.A., Lentsner Kh.P. et al. The methodology of studying the adhesion process of microorganisms // Laboratory case. - 1986. - N 4. - P. 210-214.
2. Golod N.A., Loyko N.G., Mulyukin A.L. Adaptation of lactic acid bacteria to unfavorable growth conditions // Microbiology. - 2009. - Т. 78, N 3. - P. 317-335.
3. Enikeev R.R. The influence of conditions for the accumulation of bacterial polysaccharides in the production of kefir // Izvestiya Vuzov. Food technology (Chemistry of food and materials). -2010. - N 5/6. -- P. 15-19.
4. Zandanova T.N. Symbiotic starter culture for the production of kurunga // Food Industry - 2009. -N 7. - P. 48-49.
5. Inikhov G.S, Brio N.P. Methods of analysis of milk and dairy products - M.: Food industry, 2001. -
318 p.
6. Khamagaeva I.S., Zandanova T.N., Zambalaeva N.A. The influence of autoselection conditions on the synthesis of exopolysaccharides and the adhesive activity of a microbial consortium // Bulletin of VSGUTU. - 2013. - N 2. - P. 57-63.
7. RF Patent № SU 651776, А23С 9/12. The method of production of fermented milk drink "Kurunga"; appl. 12.05.1977. publ. 15.03.1979.
8. Nikolaev Yu.A. Extracellular factors adaptation of bacteria to adverse environmental conditions // Applied biochemistry and microbiology. - 1997. - Vol. 40, N 4. - P. 387-397.
9. Reshetnik L.A. Microbiological and clinical characteristics of kurunga // Siberian Medical Journal.
2007. - Vol. 69 (2). - P. 88-91.
10. Sorvacheva O.A. A new fermented milk product - kurunga // Milk processing: technology, equipment, products (Technology). - 2009. - N 5. - P. 36-37.
11. Tsend-Ayuush C., Ganina V.I. Microflora of Mongolian traditional fermented milk products // Dairy industry. - 2010. - N 2. - P. 81.
12. Chuzhova Z.P. «Kurunga» is a therapeutic and dietary drink made from cow's milk // Nutrition Issues. - 1964. - T. XXII, N 5.
13. Filchakova S.A., Koroleva N.S. The influence of the conditions of cultivation on the composition and microflora of kefiran fungi. SA Filchakova // The Dairy Industry. - 1997. - N 5. - P. 37.
14. FilchakovaS.A. A national fermented milk drink - kefir // Processing of milk. - 2010. - N 1. - P. 34-35.
15.Burentegusi, Streptococcus microflora in traditional starter cultures for fermented milk, hurunge, from Inner Mongolia, China / Streptococcus Burentegusi, B. Yu, T. Miyamoto // Animal Science Journal. -2006. - Vol. 77 (2). - P. 235-241.
