CC BY
1А.П. Никифорова, канд. техн. наук, доц., e-mail: anna.p.nikiforova@gmail.com С.Н. Хазагаева, канд. техн. наук, доц. б/а, e-mail: shazagaeva@mail.ru Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления, г. Улан-Удэ С.И. Артюхова, д-р техн. наук, проф., e-mail: asi08@yandex.ru Омский государственный технический университет, г. Омск
УДК 579.2
ИССЛЕДОВАНИЕ БИОХИМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ШТАММА LACTOBACILLUS SAKEILSK-104
Молочнокислые бактерии являются доминирующей группой микроорганизмов в ферментированных мясных и рыбных продуктах. Известно также, что молочнокислые бактерии имеют полезные для здоровья человека свойства, например при регулярном употреблении, они способствуют повышению иммунитета человека, способствуют лучшему усвоению продуктов питания, снижают уровень холестерина в крови.
Также известны их технологические свойства: они способны синтезировать молочную кислоту и бактериоцины, что позволяет улучшить показатели безопасности пищевых продуктов. Кроме того, в результате молочнокислого брожения содержание витаминов в продуктах питания увеличивается. В связи с этим интерес представляет направленный отбор микроорганизмов для создания бактериальных концентратов, предназначенных для применения в пищевой промышленности.
В работе представлены результаты исследований культивирования штамма молочнокислых бактерий с использованием биотехнологического способа активизации. Результаты проведенных экспериментальных исследований показали возможность культивирования штамма молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei LSK-104 на среде, основанной на молочной сыворотке.
Ключевые слова: молочнокислые бактерии, Lactobacillus sakei, биотехнология, активизация.
A.P. Nikiforova, Cand. Sc. Engineering, Assoc. Prof.
S.N. Khazagaeva, Cand. Sc. Engineering, Assoc. Prof.
S.I. Artyukhova, Dr. Sc. Engineering, Prof.
STUDY OF BIOCHEMICAL ACTIVITY OF THE LACTOBACILLUS SAKEI LSK-104 STRAIN
Lactic acid bacteria are the dominant group of microorganisms in fermented meat and fish products. It is also known that lactic acid bacteria have beneficial properties for human health, for example, with regular use, they contribute to improving human immunity, promote better absorption of food, reduce the level of cholesterol in the blood. Their technological properties are also well-known: they are able to synthesize lactic acid and bacteriocins, which can improve food safety performance. In addition, as a result of lactic acid fermentation, the content of vitamins in food increases. In this regard, directed selection of microorganisms to create bacterial concentrates intended for use in the food industry, is an object of great interest.
The paper presents the results of studies of the cultivation of a strain of lactic acid bacteria using a biotechnological activation method. The results of experimental studies showed the possibility of cultivation a strain of lactic acid bacteria Lactobacillus sakei LSK-104 on a medium based on whey.
Key words: lactic acid bacteria, lactobacilli, Lactobacillus sakei, biotechnology, activation.
Введение
Молочнокислые бактерии играют важную роль при производстве ферментированных продуктов питания, ассортимент которых постоянно расширяется. Очень перспективной является разработка новых технологий производства мясных и рыбных продуктов с применением бактериальных концентратов молочнокислых бактерий. Исследованиям в этой области посвящены работы зарубежных ученых [6, 7].
Одним из перспективных для применения в пищевой промышленности видов молочнокислых бактерий являются бактерии вида Lactobacillus sakei. Свое видовое название Lactobacillus sakei получили в связи с тем, что были обнаружены в составе микрофлоры саке, традиционного алкогольного напитка из риса [4, 6]. В настоящее время Lactobacillus sakei широко применяются в составе защитных и стартовых культур ферментированных колбас [5, 6, 7].
Известно, что бактерии вида Lactobacillus sakei относятся к молочнокислым бактериям. Их важность во многом обусловлена тем, что они активно применяются при производстве продуктов из мяса, в том числе ферментированных колбас, в связи с устойчивостью многих штаммов к поваренной соли и низким температурам [4, 7]. Lactobacillus sakei также обладают и другими полезными свойствами. Например, их применение способно повысить безопасность мясных продуктов в связи с синтезом бактериями молочной кислоты и бактериоцинов - белков, подавляющих жизнедеятельность других бактерий, в том числе патогенных [7].
Lactobacillus sakei обладают гем-зависимой каталазой. Это свойство редко встречается у молочнокислых бактерий. Анализ генома этих бактерий показал их способность поглощать железо и гем. Установлено также, что внесение добавок гемового железа в питательную среду увеличивало выживаемость Lactobacillus sakei во время стационарной фазы. В связи с тем, что красное мясо богато железом, которое является частью гема гемоглобина и миоглобина, это свойство является очень важным при производстве мясных продуктов [7].
В лабораторных условиях штаммы Lactobacillus sakei в основном ферментируют глюкозу, N-ацетил-О-глюкозамин, сахарозу, фруктозу и маннозу. Но эти вещества обычно не содержатся в мясе. Было установлено, что эти бактерии могут также ферментировать рибозу, которая присутствует в сыром мясе, через АТФ-зависимую систему. Также имеются сведения о том, что Lactobacillus sakei могут использовать альтернативные источники углерода, такие как нуклеозиды или N-ацетил-нейраминовую кислоту, которые присутствуют в мясе. Утилизация веществ этим видом бактерий зависит от фазы роста. Например, сначала Lactobacil-lussakei утилизировали глюкозу, фруктозу, карнитин, триптофан и яблочную кислоту, затем трегалозу, лимонную кислоту, лизин [7].
Ранее было установлено, что некоторые бактерии этого вида способны продуцировать бактериоцины, такие как сакацин А и сакацин Р, а также лактоцин S. В связи с этим бактерии данного вида широко применяются как защитные культуры при производстве ферментированных колбас [5].
Известно также, что бактерии этого вида играют важную роль при производстве рыбных продуктов. Например, они входят в состав микрофлоры и участвуют в формировании характеристик традиционного ферментированного рыбного продукта - ракфиска, производимого в Норвегии [5]. Также Lactobacillus sakei были обнаружены в ферментированных продуктах из овощей, таких как кимчи и квашеная капуста [7], заквасках из гречихи, пшеницы и тефа [5].
Цель исследования
Целью исследования является изучение биохимической активности штамма молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei LSK-104.
Материалы и методы исследований
Экспериментальные исследования проводились на кафедре «Технология молочных продуктов. Товароведение и экспертиза товаров» ФГБОУ ВО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления».
Объектом изучения является штамм молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei LSK-104. Применяемые для изготовления бактериальных культур штаммы были получены из фонда Национального биоресурсного центра - Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» Национального исследовательского центра
«Курчатовский институт» (ГосНИИгенетика). Активизация штамма была проведена биотехнологическим способом, разработанным в Восточно-Сибирском государственном технологическом университете (ныне ВСГУТУ) [2].
При проведении эксперимента в качестве основы для культивирования использовали гидролизованное молоко и гидролизованную молочную сыворотку. Бактерии реактивировали на готовой полужидкой среде MRS (ООО «НПЦ «Биокомпас-С»).
Количественный учет молочнокислых микроорганизмов проводили методом предельных разведений на агаризованной среде MRS (ООО «НПЦ «Биокомпас-С»).
Для определения способности бактерий ферментировать лактозу применяли лактозо-пептонную среду (ООО «Биотехновация»).
Результаты исследования и их обсуждение
На первом этапе исследований проводили анализ свойств молочнокислых бактерий вида Lactobacillussakei. Данные о штамме Lactobacillus sakei LSK-104 были получены из паспорта штамма, выданного ГосНИИгенетика, а также из литературных источников.
Оптимальная температура развития этого штамма составляет 37 °С. Также известно, что штамм является продуцентом молочной кислоты, бактериоцинов, является антагонистом Esherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, имеет ароматообразующие свойства [1].
Культурально-морфологические особенности штамма Lactobacillus sakei LSK-104: короткие одиночные палочки со слегка закругленными концами. В зависимости от условий культивирования могут образовывать короткие цепочки.
На жидкой элективной среде MRS в благоприятных условиях через 24 ч штамм образует сильное помутнение. При посеве на твердые питательные среды, разлитые высоким столбиком, формирует круглые непрозрачные колонии с выраженной зоной стерильности. Поверхность колоний гладкая, блестящая.
Имеются сведения о том, что штамм способен расти на MRS-агаре с содержанием NaCl 2-4%, наблюдается слабый рост на MRS-arape с 6-10% NaCl. Штамм устойчив к 0,8%-ному раствору фенола, 40% желчи. Ферментирует эскулин, галактозу, фруктозу, целлобиозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, мелибиозу, салицин. Оптимальная температура роста 37°С. Кислотность на 2-е сут - 75°Т, на 7-е сут - 110°Т. Проявляет аминоксидазную активность по отношению к тирамину [1].
Реактивация культуры Lactobacillus sakei LSK-104 проводилась на среде MRS, которая рекомендована для культивирования этого штамма, при температуре 37 °C в течение 72 ч. Количество жизнеспособных клеток к концу стационарной фазы составило 5*109 к.о.е./ мл.
В связи со слабой активностью исследуемого штамма к сбраживанию лактозы исследовали возможность активизации биотехнологическим способом, разработанным в ВСГУТУ.
Способность сбраживать лактозу является важным свойством микроорганизмов. В связи с этим второй этап исследований был посвящен изучению способности штамма Lactobacillus sakei LSK-104 ферментировать лактозу. Сначала бактерии вносили в гидролизованное молоко, которое затем выдерживали при температуре (37±1) °С в течение 46-48 ч. Рост бактерий на гидролизованном молоке отмечен не был. На следующем этапе бактерии вносили в лактозо-пептонную среду, которую выдерживали в термостате при 37°С в течение 72 ч. После 72 ч термостатирования количество жизнеспособных клеток бактерий составило 1х107 к.о.е./мл, при этом было отмечено незначительное изменение цвета среды.
Учитывая низкую активность в исследуемых питательных средах, использовали метод активизации, разработанный в ВСГУТУ.
Гидролиз творожной сыворотки проводили ферментным препаратом ß-галактозидазы в течение 2 ч при температуре (37±1) °С с дальнейшей инактивацией фермента путем стерилизации при (121±1) °С с выдержкой 20 мин.
Результаты представлены на рисунке 1.
8 7 6 5
К А
3 2 1 0
0
12
48
60
24 36 Время, ч ■ Активная кислотность
Рисунок 1 - Динамика роста бактерий Lactobacillus sakei LSK-104 на гидролизованной сыворотке
Из данных на рисунке 1 видно, что гидролизованная сыворотка является хорошей питательной средой для культивирования L. sakei LSK-104. Плотность популяции через 48 ч составляет 3*109 к.о.е./мл. Экспоненциальная фаза роста приходится на период между 24 и 48 ч культивирования с последующим переходом в стационарную фазу.
Известно, что бактериальные культуры после реактивации нуждаются в нескольких генерациях для полного восстановления метаболизма. В связи с этим была изучена биохимическая активность L. sakei LSK-104 во II и III генерациях. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Биохимическая активность Lactobacillus sakei LSK-104
Генерации Продолжительность культивирования, ч Активная кислотность Количество жизнеспособных клеток, к.о.е./мл
II 0 6,82±0,03 7*103
4 6,79±0,01 1*104
8 6,56±0,03 5*104
12 6,34±0,02 1*105
16 5,93±0,04 8*105
20 5,89±0,01 1*106
24 5,75±0,05 4*107
28 5,56±0,02 1*108
32 5,34±0,02 9*108
36 5,28±0,01 5*109
III 0 6,82±0,05 6*104
4 6,79±0,03 1*105
8 6,12±0,02 1*107
12 6,02±0,01 1*109
16 5,87±0,01 4*109
Культуры II генерации обладают более высокой активностью, титр жизнеспособных клеток составляет 5*109 к.о.е./мл через 36 ч. Наибольшая скорость роста и накопление клеток Lactobacillus sakei LSK-104 наблюдается в III генерации. Количество жизнеспособных клеток в гидролизованной сыворотке порядка 109 к.о.е./мл достигается через 12 ч культивирования.
Установлено, что в отличие от известного способа активизации бифидобактерий которые культивируют на молоке обработанном Р-галактазидазой, благоприятной средой для Lactobacillus sakei LSK-104 является гидролизованная сыворотка.
Активизированная культура обладает высокой биохимической активностью, поэтому может быть использована в качестве инокулята для производства бактериального концентрата.
На следующем этапе были уточнены оптимальные условия для наращивания биомассы Lactobacillus sakei LSK-104 на питательной среде, состоящей из осветленной творожной сыворотки с добавлением ростовых факторов.
Оптимальную дозу инокулята определяли по кинетике роста бактерий, отражающей эффективность накопления биомассы и жизнеспособных клеток бактерий.
Время, ч Доза инокулята, %
-е-1% ^3%
Рисунок 2 - Подбор условий культивирования Lactobacillus sakei LSK-104
При повышении дозы инокулята от 1 до 5 % отмечается увеличение скорости роста. При увеличении дозы внесения до 10% на начальном этапе происходит увеличение скорости роста, в дальнейшем прирост биомассы замедляется. Возможно, это объясняется механизмами саморегуляции при первоначально высокой плотности популяции. Продолжительность культивирования составляет 20-22 ч при температуре (37±1) °С.
Характеристика полученного бакконцентрата представлена в таблице 2.
Таблица 2
Показатели качества бактериального концентрата Lactobacillus sakei LSK-104
Наименование показателя Значение показателя
Консистенция и внешний вид Однородная, жидкая, допускается отделение сыворотки
Цвет От белого до светло-желтого с белыми вкраплениями
Предельные значения рН (5,6-6,82)
Количество бактерий, к.о.е./cH3, не менее Lactobacillus sakei 1010
Объем продукта (см3), в котором не допускаются: БГКП (колиформы) S. aureus 10 100
Патогенные микроорганизмы (в том числе сальмонеллы) Дрожжи и плесени, к.о.е./ см3, не более в сумме 100 5
Токсичные элементы, не более мкг/кг:
Свинец 0,1
Мышьяк 0,05
Кадмий 0,03
Ртуть 0,005
Высокая биохимическая активность - один из главных критериев пригодности бактериальных культур для применения в пищевой промышленности. Разработанный концентрат содержит высокое количество живых клеток (1010 к.о.е./мл) Lactobacillus sakei LSK-104 и может быть рекомендован для ферментации пищевых субстратов различного состава.
Заключение
Способность к сбраживанию различных углеводов для молочнокислых бактерий широко варьируется внутри таксономической группы и индивидуальна для каждого штамма.
На основании проведенных исследований разработан бактериальный концентрат, обладающий высокой биохимической активностью.
Установлено, что гидролизованная сыворотка в сравнении с гидролизованным молоком является более благоприятной средой для активизации Lactobacillus sakei LSK-104.
Исследования проведены на средства гранта «Михаил Ломоносов» Германской службы академических обменов (DAAD) и Министерства науки и высшего образования РФ (4.13476.2019/13.2).
The study was funded by the joint scholarship program "Michail Lomonosov" of German Academic Exchange Service (DAAD) and Ministry of Science and Higher Education of Russian Federation (4.13476.2019/13.2).
Библиография
1. Патент РФ № 2367685, 20.09.2009. Препарат бактериальный для производства ферментированных мясных изделий и биотрансформации мясного сырья / Хорольский В.В., Машенцева Н.Г., Баранова Е.А., Семенышева А.И., Васильченко А.А. // Патент России № 2367685. 2009. - Бюл. № 26.
2. Хамагаева И.С. Научные основы биотехнологии кисломолочных продуктов для детского и диетического питания: монография. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2005. - 279 с.
3. Bjerke G.A., Rudi K., Avershina E. et al. Exploring the Brine Microbiota of a Traditional Norwegian Fermented Fish Product (Rakfisk) from Six Different Producers during // Two Consecutive Seasonal Productions. - 2019. - N 8 (2). - P. 72.
4. Katagiri H., Kitahara K., Fukami K. The characteristics of the lactic acid bacteria isolated from moto, yeast mashes for sake manufacture. P. IV. Classification of the lactic acid bacteria // Bull Agric Chem Soc Jpn. - 1934. - N I.10. - P. 156-157.
5. Tsuda H., Matsumoto T., Ishimi Y. Selection of Lactic Acid Bacteria as Starter Cultures for Fermented Meat Products // Food Sci. Technol. Res. - 2012. - N 18, I. 5. - P. 713-721.
6. Vogel R.F., LohmannM., NguyenM. et al. Molecular characterization of Lactobacillus curvatus and L. sake isolated from sauerkraut and their application in sausage fermentations // J Appl Bacteriol. - 1993. -I. 74. - P. 295-300.
7. Zagorec M., Champomier-Verges M.C. Lactobacillus sakei: A Starter for Sausage Fermentation, a Protective Culture for Meat Products // Microorganisms. - 2017. - N 5, I. 3. doi: 10.3390 / microorganisms 5030056.
Bibliography
1. Patent of Russian Federation, No. 2367685, September 20, 2009. Bacterial preparation for the production of fermented meat products and biotransformation of raw meat / Khorolsky V.V., Mashentseva N.G., Baranova E.A., Semenysheva A.I., Vasilchenko A.A. // Patent of Russia, N 2367685. 2009. - Bull. N 26.
2. Khamagaeva I.S. Scientific basis of biotechnology of fermented milk products for children and dietetic nutrition: Monograph. - Ulan-Ude: Publishing House of ESSTU, 2005. - 279 p.
3. Bjerke G.A., Rudi K., Avershina E. et al. Exploring the Brine Microbiota of a Traditional Norwegian Fermented Fish Product (Rakfisk) from Six Different Producers during // Two Consecutive Seasonal Productions. - 2019. - N 8 (2). - P. 72.
4. Katagiri H., Kitahara K., Fukami K. The characteristics of the lactic acid bacteria isolated from moto, yeast mashes for sake manufacture. P. IV. Classification of the lactic acid bacteria // Bull Agric Chem Soc Jpn. - 1934. - N I.10. - P. 156-157.
5. Tsuda H., Matsumoto T., Ishimi Y. Selection of Lactic Acid Bacteria as Starter Cultures for Fermented Meat Products // Food Sci. Technol. Res. - 2012. - N 18, I. 5. - P. 713-721.
6. Vogel R.F., LohmannM., NguyenM. et al. Molecular characterization of Lactobacillus curvatus and L. sake isolated from sauerkraut and their application in sausage fermentations // J Appl Bacteriol. - 1993. -I. 74. - P. 295-300.
7. ZagorecM., Champomier-VergesM.C. Lactobacillus sakei: A Starter for Sausage Fermentation, a Protective Culture for Meat Products // Microorganisms. - 2017. - N 5, I. 3. doi: 10.3390 / microorganisms 5030056.
