CC BY
43
УДК 616.12-008.1
ИССЛЕДОВАНИЕ АССОЦИАЦИЙ НОВЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ САХАРНОГО ДИАБЕТА 2 ТИПА НА ЗАПАДНО-СИБИРСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ЕВРОПЕОИДОВ
Павел Сергеевич ОРЛОВ12, Динара Евгеньевна ИВАНОЩУК12,
Светлана Владимировна МИХАЙЛОВА1, Владимир Николаевич МАКСИМОВ23,
Михаил Иванович ВОЕВОДА12
1 ФГБНУ НИИ терапии и профилактической медицины (НИИТПМ)
630089, г. Новосибирск, ул. Бориса Богаткова, 175/1
2 ФГБУН Институт цитологии и генетики СО РАН
630090, г. Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 10
3 ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России
630091, г. Новосибирск, Красный просп., 52
Цель исследования - в выборке пациентов с сахарным диабетом 2 типа и в контроле оценить частоты полиморфизмов ге9939609 гена ЕГО, ге7903146 гена TCF7L2, ге10811661 хр. 9, ге2237892 КСЫд1 для выяснения их вклада в вероятность развития заболевания у европеоидов Западной Сибири. Дизайн исследования построен по принципу случай-контроль: 175 человек (78 мужчин и 97 женщин) с подтвержденным диагнозом сахарного диабета 2 типа и/или с повышенным уровнем глюкозы крови более 11,1 ммоль/л, в качестве контроля отобрано 273 человека (113 мужчин и 160 женщин) с нормальным уровнем глюкозы. Установлено, что генотип ТТ ге7903146 гена ТСЕ7Ь2, генотип ТТ и аллель Т ге10811661 хр. 9 ассоциированы с предрасположенностью к сахарному диабету 2 типа, соответственно отношение шансов = 2,35 (р = 0,038), 2,10 (р = 0,004) и 1,92 (р = 0,004).
Ключевые слова: ЕГО, TСF7L2, 9 хромосома, КСЫд1, сахарный диабет 2 типа, ОНП.
Согласно данным Международной федерации диабета, в мире около 366 миллионов человек, или 8,3 % от взрослого населения, страдает сахарным диабетом 2 типа (СД2Т), а к 2030 г. ожидается увеличение числа больных до 552 миллионов [2]. Длительный период скрытого развития без выраженных симптомов препятствует ранней диагностике заболевания. Формирование СД2Т происходит через взаимодействие различных генетических и средовых факторов, из-за большого числа которых вопрос идентификации генов, вовлеченных в формирование патологического фенотипа, остается актуальным. Показано, что вклад полиморфизмов отдельных генов в предрасположенность к СД2Т, как правило, невысок [1], однако дальнейший поиск генов, ассоциированных с СД2Т, позволит выявить дополнитель-
ные генетические факторы, вовлеченные в регуляцию метаболизма глюкозы.
На сегодняшний день благодаря методу полногеномных ассоциативных исследований (GWAS) идентифицировано большое количество локусов, ассоциированных с СД2Т. Выявленные однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП) принадлежат генам, экспрессия которых определяет [13] синтез инсулина, снижение количества и дисфункцию Р-клеток, ожирение, инсулинорези-стентность, изменение концентрации глюкозы в крови и плазме в зависимости от времени.
Для данного исследования мы отобрали 4 ОНП в различных генах, которые связаны в популяции европеоидов с развитием СД2Т: ге9939609 гена ЕГО, ^7903146 гена TСF7L2, ге10811661 хр. 9, ге2237892 КСИд1, ^7903146 расположен в
Орлов П.С. - младший научный сотрудник, e-mail: [email protected] Иванощук Д.Е. - младший научный сотрудник, e-mail: [email protected] Михайлова С.В. - научный сотрудник
Максимов В.Н. - д.м.н., зав. лабораторией молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний, e-mail: [email protected]
Воевода М.И. - д.м.н., проф., член-кор. РАН, директор, e-mail: [email protected]
3-м интроне гена TCF7L2 (transcription factors-like 2) в локусе 10q25.3. Ассоциация TCF7L2 с по -вышенным риском развития СД2Т впервые установлена S.F. Grant et al. [6], дальнейшие репли-кационные исследования подтвердили участие полиморфизмов гена TCF7L2 в развитии заболевания [5, 7, 10]. Ген TCF7L2 является важным компонентом сигнального пути Wnt в период эмбрионального развития и регулирует экспрессию многих генов во взрослом организме, в том числе и про-глюкагонового гена, кодирующего глюка-гон-подобный пептид 1, в клетках кишечника, тем самым оказываясь вовлеченным в гомеостаз глюкозы. Последнее предположение было изначально выдвинуто, но позже выяснилось, что снижение инкретинового эффекта у носителей аллеля риска (имеется в виду аллель Т) наблюдалось не за счет снижения количества глюкозо-зависимого инсулинотропного полипептида, а за счет повышения резистентности Р-клеток к ин-кретиновым гормонам при пероральном приеме глюкозы, что и приводило к уменьшению уровня инсулина [18]. Показана необходимость нормального функционирования гена TCF7L2 для поддержания глюкозозависимой секреции инсулина, выживания Р-клеток [17], а также его возможное влияние на их пролиферацию [1, 12, 17]. В норме ген экспрессируется во многих человеческих тканях, в том числе в сердце, плаценте, мозге, Р-клетках поджелудочной железы [3].
Ожирение является одним из основных факторов риска развития СД2Т [9]. В ходе GWAS был идентифицирован ген FTO, он был связан с повышенным индексом массы тела и риском ожирения у европеоидов [4] и, независимо от индекса массы тела, с СД2Т [8, 9, 11]. Впервые T.M. Frayling et al. показали связь полиморфизма rs9939609 в 1-м интроне гена FTO и индекса массы тела [4]. Этот ген кодирует 2-оксоглутарат-зависимую демети-лазу нуклеиновой кислоты, экспрессирующуюся в тканях, связанных с регулированием энергетического баланса. Так, его экспрессия представлена в мозге, скелетных мышцах, жировой ткани, печени и поджелудочной железе [4, 9]. До настоящего момента механизмы участия гена FTO в регуляции метаболизма остаются не ясными.
ОНП rs10811661 находится в межгенном пространстве короткого плеча локуса 21 9-й хромосомы. Он расположен между генами CDKN2A и CDKN2B и связан с повышенным риском развития СД2Т и сердечно-сосудистыми заболеваниями [11, 16, 17, 19]. Гены CDKN2A и CDKN2B ко -дируют два ингибитора циклин-зависимых киназ, которые, вероятно, вовлечены в регуляцию глюкозы и секрецию и функционирование инсулина. Также показано, что сверхэкспрессия CDKN2A/
CDKN2B может снижать пролиферацию панкреатических островков, а в дальнейшем приводить к развитию диабета [2, 14].
Ген KCNQ1 (potassium voltage-gated channel KQT-like subfamily, member 1) расположен в локусе 11p15.5, кодирует белок, который играет ключевую роль в реполяризации сердечного потенциала действия, а также в транспортировке воды и соли в эпителиальных тканях. Продукт гена KCNQ1 экспрессируется в островках Лангер-ганса и участвует в регуляции секреции инсулина Р-клетками поджелудочной железы. Установлена связь полиморфизма rs2237892, расположенного в 15 интроне гена KCNQ1, с повышенным риском развития СД2Т [18].
В данной работе мы оценили частоты генотипов и аллелей полиморфизмов rs9939609 гена FTO, rs7903146 гена TCF7L2, rs10811661 хр. 9, rs2237892 гена KCNQ1 в выборке пациентов с СД2Т и в контроле с целью выяснения их ассоциации с риском развития заболевания у европеоидов Западной Сибири.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Дизайн исследования построен по принципу случай-контроль: 175 человек (78 мужчин и 97 женщин) со средним возрастом 59,0 ± 6,7 года (для мужчин 58,7 ± 6,9 года, для женщин 59,3 ± 6,7 года) с подтвержденным диагнозом СД2Т и/или с повышенным уровнем глюкозы крови более 11,1 ммоль/л, что соответствует критериям Американской Диабетической ассоциации. В качестве контроля отобрано 273 человека (113 мужчин и 160 женщин) с нормальным уровнем глюкозы, в этой выборке средний возраст составил 57,1 ± 6,9 года (57,9 ± 6,6 года для мужчин и 56,5 ± 7,1 года для женщин). Кроме того, исключение диагноза сахарного диабета было сделано по результатам анализа медицинских карт пациентов. Обе группы были сформированы на основе популяционной выборки 45-69-летних европеоидов г. Новосибирска, созданной в ходе работы по программе HAPIEE (Health, Alcohol and Psychosocial factors In Eastern Europe). Программа исследования HAPIEE также включала измерение артериального давления, частоты сердечных сокращений, антропометрию (рост, вес, объем талии, бедер), оценку липидного профиля (содержание общего холестерина, триглицери-дов, холестерина липопротеинов низкой (ЛПНП) и высокой (ЛПВП) плотности). Геномную ДНК выделяли из 10 мл венозной крови методом фенол-хлороформной экстракции [15].
Генотипирование групп по исследуемым полиморфизмам (rs7903146 гена TCF7L2,
rs10811661 хр. 9, rs2237892 гена KCNQ1) выполнено методом ПЦР в реальном времени на приборе 7900НТ (Applied Biosystems, США) с использованием TaqMan-зондов (Applied Biosystems) по стандартному протоколу.
Определены частоты генотипов и аллелей изучаемых ОНП в группе с СД2Т и в контрольной группе, соответствие частот генотипов равновесию Харди - Вайнберга в контрольной группе (по критерию х2), также нами проведены сравнения распределения генотипов для мужчин и женщин. Сравнение групп по частотам генотипов и аллелей выполнялись с помощью таблиц сопряженности с использованием критерия х2 Пирсона. В случае четырехпольных таблиц применяли точный двусторонний критерий Фишера с поправкой Йетса на непрерывность. Относительный риск СД2Т по конкретному аллелю или генотипу вычисляли как отношение шансов с использованием точного двустороннего критерия Фишера и критерия х2 Пирсона. Сравнение уровня таких показателей, как рост, масса тела, индекс массы тела, артериальное давление (систолическое, диасто-лическое, пульсовое), частота сердечных сокращений, содержание общего холестерина, холестерина ЛПНП, холестерина ЛПВП, триглицеридов, индекс атерогенности, концентрация глюкозы в крови у носителей разных генотипов, проводили после проверки нормальности распределения этих признаков по тесту Колмогорова - Смирнова. Если признак отвечал критериям нормального распределения, то использовали однофакторный дисперсионный анализ. Достоверность различий между двумя генотипическими классами дополнительно проверяли с помощью /-теста для двух независимых выборок. В случае, если изучаемый признак не удовлетворял критериям нормального распределения, сравнение его уровня у носителей разных генотипов проводили с помощью теста Крускалла - Уоллиса, достоверность различий между двумя генотипическими классами дополнительно проверяли с помощью теста Манна - Уитни для двух независимых выборок. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате исследования полиморфизма rs9939609 гена FTO нами установлено, что по распределению генотипов мужчины и женщины статистически значимо различаются. Для rs9939609 гена FTO не получено статистически значимых данных о его ассоциации с развитием СД2Т (см. таблицу), факторами риска и антропо-
метрическими показателями в контрольной выборке. Показано, что по полиморфизму ге7903146 гена TСF7L2 частота встречаемости генотипа ТТ существенно выше в группе с СД2Т, чем в контрольной (см. таблицу). При анализе аллельных вариантов данного полиморфизма обнаружено, что аллель Т связан с развитием СД2Т и повышает риск развития заболевания в 1,43 раза (см. таблицу). С помощью теста Манна - Уитни в контрольной выборке установлена ассоциация генотипа СС с избыточным весом. Статистически достоверных данных об ассоциации ОНП KCNQ1 (ге2237892) с развитием СД2Т нами не получено (см. таблицу). Тест Крускалла - Уоллиса в контрольной выборке показал достоверную связь ге2237892 гена KCNQ1 с индексом массы тела р = 0,004.
Оценка распределения генотипов по полиморфизму ге10811661 хр. 9 в исследованных группах выявила достоверное снижение частоты встречаемости генотипа СТ и достоверное увеличение частоты встречаемости генотипа ТТ в выборке пациентов с СД2Т (см. таблицу). При рассмотрении аллельных вариантов обнаружено, что носительство аллеля Т достоверно увеличивает риск развития СД2Т (см. таблицу). Ассоциация ге10811661 с СД2Т сохранялась и при разделении исследуемых групп по полу. ге10811661 показал связь в контрольной выборке с содержанием общего холестерина (р = 0,01), холестерина ЛПВП (р = 0,019) и глюкозы в плазме крови (р = 0,025). Кроме того, установлено, что генотип СС ассоциирован с уровнем диастолическо-го артериального давления (р = 0,041). А в тесте Манна - Уитни в контрольной выборке для гетерозиготного генотипа СТ получены ассоциации с общим и а-холестерином плазмы крови (р = 0,011 и р = 0,006 соответственно), в то же время он коррелирует со сниженным уровнем глюкозы в крови (р = 0,014). Генотип ТТ имеет обратное действие и ассоциирован с а-холестерином плазмы крови (р = 0,005) и уровнем глюкозы (р = 0,007).
На сегодняшний день среди всех генов, обнаруженных в результате GWAS, достоверным маркером развития СД2Т является ген TСF7L2 [2]. Наше исследование показало, что генотип ТТ чаще встречается у лиц с СД2Т по сравнению с контролем. Наличие Т-аллеля обусловливает повышение риска развития СД2Т. Полученные нами данные соответствуют ранее описанным в мире [6]. Мы не обнаружили взаимосвязи между носительством генотипа ТТ и аллеля Т с такими показателями, как уровень глюкозы, триглицери-дов, липопротеинов высокой и низкой плотности. Для генотипа СС полиморфизма ге7903146 гена TСF7L2 показана связь с избыточной массой
Таблица
Частоты генотипов и аллелей rs9939609 гена FTO, rs7903146 гена TF7L2, rs10811661 хр. 9,
rs2237892 KCNQ1
ОНП Генотип/ аллель Контрольная группа СД2Т Отношение шансов Р
n % n %
FTO, rs9939609, мужчины AA 24 20,9 14 17,9 0,83 0,713
AT 68 59,1 45 57,7 0,94 0,882
TT 23 20 19 24,4 1,27 0,594
A 116 52 73 50,7 0,95 0,831
Т 107 48 71 49,3 1,055 0,831
FTO, rs9939609, женщины AA 21 13 18 19,8 1,64 0,204
AT 81 50,4 40 44 0,78 0,36
ТТ 59 36,6 33 36,2 0,984 1
A 123 38,2 79 40,9 1,12 0,572
Т 199 61,8 110 58,2 0,89 0,572
TCF7L2, rs7903146 СС 160 58,2 83 49,4 0,7 0,077
СТ 104 37,8 70 41,7 1,17 0,24
ТТ 11 4 15 8,9 2,35 0,038
С 424 77,1 236 70,2 0,7 0,026
Т 126 22,9 100 29,8 1,43 0,026
KCNQ1, rs2237892 СС 230 83,9 152 90,5 1,82 0,063
СТ 44 16,1 16 9,5 0,55 0,063
ТТ 0 0 0 0
С 504 92 320 95,2 1,746 0,073
Т 44 8 16 4,8 0,57 0,073
rs10811661 (хр. 9) СС 8 2,9 3 1,8 0,61 0,545
СТ 68 24,8 23 13,7 0,48 0,005
ТТ 198 72,3 142 84,5 2,1 0,004
С 84 15,3 29 7,7 0,52 0,004
Т 464 84,7 307 92,3 1,92 0,004
тела. Это несколько противоречит данным работы S.F. Grant с соавт. [6], показавшим отсутствие связи данного локуса с ожирением (индекс массы тела больше 30 кг/м2). Указанное разногласие, вероятно, является следствием того, что выборки пациентов с СД2Т и контроля составляют преимущественно люди с избыточной массой тела и первой степенью ожирения.
Ожирение - фактор риска, но это не необходимое условие развития СД2Т в нашей популяции. Возможно, что склонность к набору массы и развитию ожирения этноспецифична. Мы также не исключаем, что полиморфизм rs7903146 гена TCF7L2 может находиться в группе сцепления генов, влияющих на набор массы тела. В то же время полиморфизм rs9939609 гена FTO ни в одном из тестов не показал статистически значимых различий, но его роль в развитии ожирения неоднократно была показана [4, 8, 11]. Это лишний раз косвенно подтверждает полигенность разви-
тия ожирения и существование более значимых генетических факторов, влияющих на развитие СД2Т.
По исследованному полиморфизму ге2237892 гена KCNQ1 различия были хотя и не статистически значимыми, но близкими к пороговым. Литературные данные о связи исследуемого полиморфизма с развитием СД2Т противоречивы. В недавно опубликованном метаанализе показано, что полиморфизм гена KCNQ1 связан с повышенным риском развития СД2Т [12]. Таким образом, для точного заключения, принимает ли ге2237892 KCNQ1 участие в развитие СД2Т в нашей популяции, нужны дополнительные исследования.
В настоящем исследовании установлена достоверная связь аллеля Т и генотипа ТТ полиморфизма ге10811661 хр. 9 с развитием СД2Т. Ранее в мировой литературе неоднократно был показан аналогичный эффект [12, 18].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведения исследования ассоциации полиморфизмов rs9939609 гена FTO, rs7903146 гена TCF7L2, rs10811661 хр. 9, rs2237892 KCNQ1 с сахарным диабетом второго типа установлена связь rs7903146 гена TCF7L2 и rs10811661 хр. 9 с развитием данного заболевания.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа поддержана грантом мэрии г. Новосибирска № 12-47.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Adeghate E., Schattner P., Dunn E. An update on the etiology and epidemiology of diabetes mellitus // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2006. 1084. 1-29.
2. Ali O. Genetics of type 2 diabetes // World J. Diabetes. 2013. 4. (4). 114-123.
3. Cauchi S., Meyre D., Dina C. et al. Transcription factor TCF7L2 genetic study in the French population: expression in human P-cells and adipose tissue and strong association with type 2 diabetes // Diabetes.
2006. 55. 2903-2908.
4. Frayling T.M., Timpson N.J., Weedon M.N. et al. A common variant in the FTO gene is associated with body mass index and predisposes to childhood and adult obesity // Science. 2007. 316. 889-894.
5. Goodarzi M.O., Rotter J.I. Testing the gene or testing a variant? The case of TCF7L2 // Diabetes.
2007. 56. 2417-2419.
6. Grant S.F., Thorleifsson G., Reynisdottir I. et al. Variant of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes // Nat. Genet. 2006. 38. 320-323.
7. Hayashi T., Iwamoto Y., Kaku K. et al. Replication study for the association of TCF7L2 with susceptibility to type 2 diabetes in a Japanese population // Diabetologia. 2007. 50. 980-984.
8. Hertel J.K., Johansson S., SonestedtE. et al. FTO, type 2 diabetes, and weight gain throughout adult life: a meta-analysis of 41,504 subjects from the Scandi-
navian HUNT, MDC, and MPP studies // Diabetes. 2011. 60. 1637-1644.
9. James W.P. WHO recognition of the global obesity epidemic // Int. J. Obes. (Lond.). 2008. 32. S120-S126.
10. Jin T., Liu L. The Wnt signaling pathway effector TCF7L2 and type 2 diabetes mellitus // Mol. Endocrinol. 2008. 22. (11). 2383-2392.
11. Landman G.W., van Vliet-Ostaptchouk J.V., Kleefstra N. et al. Association between 9p21 genetic variants and mortality risk in a prospective cohort of patients with type 2 diabetes (ZODIAC-15) // Cardiovasc. Diabetol. 2012. 11. 138. doi: 10.1186/14752840-11-138.
12. Liu J., Wang F., Wu Y., Huang X. et al. Metaanalysis of the effect of KCNQ1 gene polymorphism on the risk of type 2 diabetes // Mol. Biol. Rep. 2013. 40. (5). 3557-3567.
13. McCarthy M.I. Genomics, type 2 diabetes, and obesity // N. Engl. J. Med. 2010. 363. 2339-2350.
14. Peng F., Hu D., Gu C. et al. The relationship between five widely-evaluated variants in CDKN2A/B and CDKAL1 genes and the risk of type 2 diabetes: A meta-analysis // Gene. 2013. pii: S0378-1119/(13) 01135-9.
15. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor; NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
16. Saxena R., Voight B.F., Lyssenko V. et al. Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels // Science. 2007. 316. 1331-1336.
17. Scott L.J., Mohlke K.L., Bonnycastle L.L. et al. A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants // Science. 2007. 316. 1341-1345.
18. Sun Q., Song K., Shen X., Cai Y. The association between KCNQ1 gene polymorphism and type 2 diabetes risk: a meta-analysis // PLoS One. 2012. 7. (11). e48578. doi: 10.1371/journal.pone.0048578.
19. Zeggini E. Weedon M.N., Lindgren C.M. et al. Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes // Science. 2007. 316. 1336-1341.
ASSOCIATION STUDY OF NEW GENETIC MARKERS OF TYPE 2 DIABETES MELLITUS IN WEST SIBERIAN CAUCASIAN POPULATION
Pavel Sergeevich ORLOV12, Dinara Yevgenyevna IVANOSHCHUK12, Svetlana Vladimirovna MIKHAYLOVA1, Vladimir Nikolaevich MAKSIMOV23, Mikhail Ivanovich VOEVODA12
1 Institute of Internal and Preventive Medicine (IIPM)
630089, Novosibirsk, Boris Bogatkov str., 175/1
2 Institute of Cytology and Genetics of SB RAS
630090, Novosibirsk, Academik Lavrentev av., 10
3 Novosibirsk State Medical University of Minzdrav of Russia
630091, Novosibirsk, Krasny av., 52
The aim of the study was to estimate frequencies of the following polymorphisms, including the FTO gene rs9939609, TCF7L2 gene rs7903146, chromosome 9 rs10811661, and KCNQ1 gene rs2237892, in the sample of patients with type 2 diabetes mellitus and in the control group in order to clarify their contribution to the probability of type 2 diabetes mellitus in West Siberian Caucasians. Materials and Methods: the case-control study design was used; 175 individuals (78 men and 97 women) with the confirmed type 2 diabetes mellitus diagnosis and/or with an increased blood glucose level (more than 11.1 mmol/l). 273 individuals (113 men and 160 women) with normal glucose level were selected as a control. Results: the TCF7L2 gene rs7903146 TT genotype is associated with predisposition to type 2 diabetes mellitus (p = 0.038; OR = 2.35). The rs10811661 TT genotype and T allele are associated with predisposition to T2DM (OR = 2.1, p = 0.004; and OR = 1.92, p = 0.004, respectively).
Key words: FTO, TCF7L2, 9 chromosome, KCNQ1, diabetes mellitus, of 2 type, SNP.
Orlov P.S. - junior researcher, e-mail: [email protected] Ivanoshchuk D.Ye. - junior researcher, e-mail: [email protected] Mikhaylova S.V. - researcher
Maksimov V.N. - doctor of medical sciences, head of laboratory for molecular genetic studies of therapeutic diseases, e-mail: [email protected]
Voevoda M.I. - doctor of medical sciences, professor, corresponding member of the RAS, e-mail: [email protected]
