CC BY
89
Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2015, № 1
УДК 575.174.015.3:616.12-007-053.1
ИССЛЕДОВАНИЕ АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФИЗМА R554K ГЕНА АРИЛ-ГИДРОКАРБОНОВОГО РЕЦЕПТОРА (AHR) С РИСКОМ РАЗВИТИЯ ВРОЖДЕННЫХ ДЕФЕКТОВ МЕЖПРЕДСЕРДНОЙ И МЕЖЖЕЛУДОЧКОВОЙ ПЕРЕГОРОДОК СЕРДЦА
© Швецов Я.Д.* 1, Лазарев К.Ю.2, Брайко О.П.2, Бушуева О.Ю.1, Голубцов В.И.2, Полоников А.В.1
1 Курский государственный медицинский университет, Курск;
2 Кубанский государственный медицинский университет, Краснодар
E-mail: shvecov.miogu@rambler.ru
В рамках настоящего исследования была впервые изучена связь полиморфного варианта R554K гена AHR с развитием врожденных пороков межпредсердной и межжелудочковой перегородки сердца плода. Материалом для исследования послужили образцы ДНК 151 неродственных детей славянского происхождения (жители Краснодарского края) с врожденными пороками межпредсердной и межжелудочковой перегородки сердца, рожденных в родильных домах Краснодарского края и 219 здоровых детей. Генотипирование полиморфизма R554K гена AHR проводили методами полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием TaqMan-зондов. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфизма R554K гена AHR не выявил ассоциации с развитием врожденных пороков межпредсердной и межжелудочковой перегородки сердца плода. Тем не менее нельзя исключить возможность участия гена AHR в формировании наследственной предрасположенности к врожденным порокам сердца.
Ключевые слова: врожденные пороки межпредсердной и межжелудочковой перегородок сердца плода, ДНК-полиморфизм, арил-гидрокарбоновый рецептор.
RESEARCH OF ASSOCIATION OF ARYL-HYDROCARBON RECEPTOR GENE (AHR) R554K POLYMORPHISM WITH RISK OF DEVELOPING CONGENITAL ATRIAL AND VENTRICULAR SEPTAL DEFECTS Shvetsov Y.D.1, Lazarev K.Y.2, Brayko O.P.2, Bushueva O.Y.1, Golubtsov V.I.2, Polonikov A.V.1
1 Kursk State Medical University, Kursk; 2 Kuban State Medical University, Krasnodar
The present research for the first time investigates the connection of polymorphic variant R554K of AHR gene with the development of congenital atrial and ventricular septal defects of fetus. The material for study was DNA samples of 151 unrelated children of Slavic origin (residents of the Krasnodar region) with congenital atrial and ventricular septal defects, born in maternity hospitals of Krasnodar region and 219 healthy children. Genetic typing of AHR gene R554K polymorphisms was performed by polymerase chain reaction in real time using TaqMan-probes. A comparative analysis of allele frequencies and genotypes of AHR gene R554K polymorphism showed no association with the development of congenital atrial and ventricular septal defects in fetus. However, we cannot exclude the possibility of AHR gene involvement in the development of inherited predisposition to congenital heart defects.
Keywords: congenital atrial and ventricular septal defects in fetus, DNA polymorphism, aryl-hydrocarbon receptor.
Врожденный порок сердца (ВПС) является наиболее частым врожденным дефектом, обусловливающим большее число смертей детей в первый год жизни в сравнении с другими патологическими состояниями [11]. Дефекты межпредсердной и межжелудочковой перегородок являются наиболее распространенным пороком сердечно-сосудистой системы, обнаруживаемым более чем у 1 из 1000 новорожденных [11, 12]. Так дефект межжелудочковой перегородки сердца составляет 50% детей с ВПС [9] и выявляется в качестве изолированного поражения у 20% пораженных детей [20].
Несмотря на значительные достижения в диагностике и хирургическом лечении ВПС, этиология пороков по-прежнему остается малоизученной стороной данной патологии. Крупные исследования среди новорожденных, такие как исследование «Балтимор-Вашингтон», обнаружили, что ВПС представляет собой мультифакториаль-
ную патологию, возникающую в результате совместного влияния генетической предрасположенности и факторов окружающей среды [7]. Секве-нирование генома человека и достижения биотехнологий существенно расширили наши представления о роли генетических факторов в развитии ВПС. К настоящему времени установлено множество генов, ассоциированных с риском развития ВПС. В частности, предполагается, что транскрипционные факторы могут играть важную роль в процессе развития сердца и тем самых вносить вклад в формирование предрасположенности к ВПС [10]. Так, некоторые факторы транскрипции контролируют экспрессию различных классов генов и на молекулярном уровне, опосредуют ответную реакцию различных физиологических систем организма на воздействие вредных факторов окружающей среды.
Арил-гидрокарбоновый рецептор человека (AHR) является представителем семейства тран-
99
Медико-биологические науки
скрипционных факторов [24]. Ген AHR преимущественно экспрессируется в плаценте, легких, сердце, поджелудочной железы и печени [6]. Ген AhR является достаточно полиморфным: обнаружен 931 полиморфизм гена AHR. Наиболее распространенным и широко исследуемым однонуклеотидным полиморфизмом (SNP) является аминокислотная замена R554K [13]. AHR активируется под действием полициклических ароматических углеводородов внешней среды, таких как 2,3,7,8-тетрахлордибензо-p-диоксин (TCDD), 3-метилхлорантрен (3MC), и в - нафтофлавон (BNF) [14, 5]. Активация арил-гидрокарбонового рецептора в ответ на TCDD и других агонистов ксенобиотиков непосредственно затрагивает несколько метаболических путей, участвующих в регуляции сигнальных факторов роста, клеточного цикла пролиферации, дифференциации и апоптоза. В цитозоле AHR образует комплекс с белком теплового шока, ко-шапероном p23 и иммунофилин-подобным белком XAP2. После связывания с лигандами (примером которого может служить 2,3,7,8 -тетрахлородибензо-п-диоксин (2,3,7,8-
TCDD)) и ассоциации со своим ядерным транслокатором - Amt, AHR перемещается в ядро и связывается с ксенобиотик-чувствительными элементами (XRE), обнаруженными в регуляторных областях различных генов. AHR-лиганды способны активировать транскрипцию генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, UGT1A1 и UGT1A6 посредством XRE-элементов, расположенных в участках энхансеров этих генов [22, 21, 27, 25, 26, 23].
Сигнальный путь арил-гидрокарбонового рецептора (AHR) играет важную роль в контроле над процессами пролиферации клеток во время внутриутробного развития плода, в связи с чем изменения молекулярной передачи сигналов могут нарушать регуляцию экспрессии генов и способствовать формированию морфогенетических отклонений [5].
В рамках настоящего исследования впервые проведен анализ ассоциации полиморфизма R554K гена AHR с развитием врожденных пороков межпредсердной и межжелудочковой перегородки сердца плода.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом для исследования послужили образцы ДНК неродственных детей (151 ребенок) славянского происхождения (преимущественно русской национальности) с врожденными пороками межпредсердной и межжелудочковой перегородки сердца, рожденных в родильных домах Краснодарского края, и 219 здоровых детей, со-
ставивших группу контроля и не имеющих врожденных пороков развития. Сбор материала производился из 44 административных образований Краснодарского края за период 1998-2012 гг. Группа больных ВПС детей включала 55 мальчиков и 96 девочек (36% и 64%); в контрольной -104 мальчика и 115 девочек (47,5% и 52,5%). Верификация диагноза ДМЖП и ДМПП проводилась квалифицированными врачами-педиатрами с использованием комплексного обследования, включающего клинические методы: объективное обследование; анкетирование и специальные (ЭКГ, УЗИ, рентгенография сердца и др.), а также клинико-генеалогическое и цитогенетическое исследования [1]. У всех обследуемых выделение ДНК проводилось из размороженной крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции [3]. Генотипирование полиморфизма R554K гена AHR проводили методами полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием TaqMan-зондов для дискриминации аллелей (рисунок 1). ПЦР осуществляли на амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad (США). Для амплификации интересующих участков гена AHR использовались праймеры и зонды, синтезированные в компании «Синтол» (Россия). Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Хар-ди-Вайнберга (РХВ) и для сравнения распределений частот генотипов и аллелей в выборках больных ВПС и здоровых детей использовали критерий % с поправкой Йетса на непрерывность [2]. Уровень статистической значимости различий между группами принимали р< 0,05. Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с использованием программных пакетов Statistica 7.0 («StatSoft») и MS Excel 2010.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Распределение частот генотипов изучаемого полиморфизма и его соответствие популяционному равновесию Харди-Вайнберга проводилось раздельно в группе детей с ДМПП и ДМЖП и в контрольной группе. Установлено, что статистически значимого отклонения в распределении частот генотипов AHR от равновесия Харди-Вайнберга ни в группе больных ВПС, ни в группе контроля не обнаружено (р> 0,05). Результаты межгруппового сравнительного анализа частот аллелей и генотипов AHR представлены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, аллели и генотипы полиморфизма R554K гена AHR не были ассоциированы с риском развития ДМПП и ДМЖП.
100
Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2015, № 1
Рис. 1. Генотипирование полиморфизма R554K гена AHR методом ПЦР и аллельной дискриминации с помощью TaqMan-зондов.
Таблица 1
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма R554K гена AHR у больных с ДМПП и ДМЖП и здоровых детей
Аллели Частоты аллелей Критерий различий (р)
ДМПП (n=48) ДМЖП (n=103) Контроль (n=219)
554R 0,896 0,927 0,922 0,18
554K 0,104 0,073 0,078 0,72
Г енотипы Частоты генотипов
n % n % n %
554RR 38 79,2 88 85,4 189 86,3 0,45
554RK 10 20,8 15 14,6 26 11,9 0,20
554KK 0 0 0 0 4 1,8 0,25
Таблица 2
Распределение частот генотипов полиморфизма гена AHR R554K в группах больных с врожденными пороками сердца и здоровых детей в зависимости от пола
Мальчики/Девочки
Исследуемая A HR R554K Исследуемая A HR R554K
группа 554RR 554RK 554KK группа 554RR 554RK 554KK
Больные мальчики 12 3 0 Больные мальчики 36 4 0
с ДМПП (n=15) (80,0%) (20,0%) (0%) с ДМЖП (n=40) (90,0%) (10,0%) (0%)
Здоровые мальчики 89 14 1 Здоровые мальчики 89 14 1
(n=104) (85,6%) (13,5%) (1,0%) (n=104) (85,6%) (13,5%) (1%)
р 0,57 0,78 0,26 р 0,48 0,78 0,62
Больные девочки 26 7 0 Больные девочки 52 11 0
с ДМПП (n=33) (78,8%) (21,2%) (0%) с ДМЖП (n=63) (82,5%) (17,5%) (0%)
Здоровые девочки 100 12 3 Здоровые девочки 100 12 3
(n=115) (87,0%) (10,4%) (2,6%) (n=115) (87,0%) (10,4%) (2,6%)
р 0,24 0,18 0,81 р 0,40 0,18 0,49
101
Медико-биологические науки
Учитывая возможность полового диморфизма, представлялось важным провести стратифицированный анализ ассоциаций полиморфизма R554K гена AHR раздельно у девочек и мальчиков. Результаты сравнительного анализа частот аллелей и генотипов в зависимости от пола представлены в таблице 2.
Стратифицированный анализ по полу частот исследуемого полиморфизма R554K гена AHR не позволил выявить ассоциацию с риском развития ДМПП и ДМЖП в зависимости от пола.
Известно, что AHR играет важную роль в развитии сердечно-сосудистой системы и в токсичности TCDD. Кроме того, дефект гена AHR у животных моделей способствует нарушению сердечно-сосудистого гомеостаза, развитию гипертрофии сердца и формированию сердечного фиброза, повышению уровней экспрессии генов, регулирующих сосудистый гомеостаз и влияет на уровень артериального давления [17, 18, 19]. У млекопитающих AHR также участвует в морфогенезе челюстно-лицевой, мочевыделительной и сердечно-сосудистой систем [4, 8, 16].
В рамках настоящего исследования была впервые изучена связь полиморфного варианта R554K гена AHR с развитием врожденных пороков межпредсердной и межжелудочковой перегородки сердца плода.
Хотя нами не была выявлена взаимосвязь полиморфизма, тем не менее нельзя исключить возможность участия гена AHR в формировании наследственной предрасположенности к врожденным порокам сердца. Во-первых, ассоциация полиморфизма R554K гена AHR с ВПС может маскироваться эффектами других генов - как AHR-каскада, так и биотрансформации ксенобиотиков, вследствие эпистатических взаимодействий между этими генами. Во-вторых, нельзя исключить сочетанное влияние гена и токсиген-ных средовых факторов на риск формирования патологии - так называемых генно-средовых взаимодействий. Учитывая вышеизложенное, а также преимущественно мультифакториальную природу несиндромальных форм ВПС, дальнейшие исследования должны быть нацелены на поиск вовлеченности других генов сигнального каскада арилгидрокарбонового рецептора совместно с оценкой химических факторов окружающей среды (в частности, полициклических ароматических углеводородов), которые могут иметь этиологическое значение на риск развития пороков развития.
ЛИТЕРАТУРА
1. Брайко О.П., Лазарев К.Ю., Щвецов Я.Д., Голубцов В.И., Полоников А.В. Анализ ассоциаций полиморфизмов g590a гена NAT2 и с3435т гена
ABCB1 у детей с изолированным дефектом межжелудочковой перегородки в Краснодарском крае // Курск. научн.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2013. - № 4. - C. 15-20.
2. Вейр Б. Анализ генетических данных. Дискретные генетические признаки. - М. : Мир, 1995. -С. 85-104.
3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии // В кн. Молекулярное клонирование. - М. : Мир, 1984. - 480 с.
4. Birnbaum L.S., Harris M.W., Stocking L.M., Clark A.M., Morrissey R.E. Retinoic acid and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin selectively enhance tera-togenesis in C57BL/6N mice // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 1989. - Vol. 98. - P. 487-500.
5. Denison M.S., Nagy S.R. Activation of the aryl hydrocarbon receptor by structurally diverse exogenous and endogenous chemicals // Pharmacol. Toxicol. -2003. - Vol. 43. - P. 309-334.
6. Dolwick K.M., Swanson H.I., Bradfield C.A. In vitro analysis of Ah receptor domains involved in ligand-activated DNA recognition // Proc. Natl. Acad. Sci. -1993. - Vol. 90. - P. 8566-8570.
7. Ferencz C., Rubin J.D., Loffredo C.A., Magee C.M. The epidemiology of congenital heart disease, The Baltimore-Washington Infant Study (1981-1989). Perspectives in Pediatric Cardiology. - Mount Kisco, NY, 1993. - Vol. 4.
8. Fernandez-Salguero P., Pineau T., Hilbert D.M., McPhail T., Lee S.S., Kimura S., Nebert D.W., Rudikoff S., Ward J.M., and Gonzalez F.J. Immune system impairment and hepatic fibrosis in mice lacking the dioxin-binding Ah receptor // Science. -1995. - Vol. 268. - P. 722-726.
9. Fyler D.C. Ventricular septal defect // Nadas’ Pediatric Cardiology. - Philadelphia, Pa: Hanley & Delfus, Inc., 1992. - P. 435-457.
10. Hinton R.B. Jr., Yutzey K.E., Benson D.W. Congenital heart disease: Genetic causes and developmental insights // Progress in Pediatric Cardiology. - 2005. -Vol. 20. - P. 101-111.
11. Hoffman J., Kaplan S. The incidence of congenital heart disease // J. Am.Coll. Cardiol. - 2002. -Vol. 39. - P. 1890-1900.
12. Hoffman J.I. Incidence of congenital heart disease: I. Postnatal incidence // Pediatr. Cardiol. - 1995. -Vol. 16. - P. 103-113.
13. Kaname K., Junko W., Hidetaka E., Kei N., Chikako K., Shin-ichi H. Polymorphisms of human Ah receptor gene are not involved in lung cancer // Phar-macogen. and genom. - 1995 - Vol. 5 - P. 151-158.
14. Kern P.A., Fishman R.B., Song W., Brown A.D., Fonseca V. The effect of 2,3,7,8-tetachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) on oxidative enzymes in adipocytes and liver // Toxicology. - 2002. - Vol. 171. -P. 117-125.
15. Koyano S., Saito Y., Fukushima-Uesaka H., Ishida S., Ozawa S., Kamatani N., Minami H., Ohtsu A., Hama-guchi T. Functional analysis of six human aryl hydrocarbon receptor variantsIn a japanese population // Am. Soc. for Pharm. and Exp. Therap. - 2005. -Vol. 33. - P. 1254-1260.
102
Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2015, № 1
16. Lahvis G.P., Pyzalski R.W., Glover E., Pitot H.C., McElwee M.K., and Bradfield C. The aryl hydrocarbon receptor is required for developmental closure of the ductus venosus in the neonatal mouse // Mol. Pharmacol. - 2005. - Vol. 67. - P. 714-720.
17. Lund A.K., Peterson S.L., Timmins G.S., and
Walker M.K. Endothelin-1-mediated increase in reactive oxygen species and NADPH Oxidase activity in hearts of aryl hydrocarbon receptor (AhR) null mice // Toxicol. Sci. - 2005. - Vol. 88. - P. 265-273.
18. Lund A.K., Goens M.B., Kanagy N.L., and
Walker M.K. Cardiac hypertrophy in aryl hydrocarbon receptor null mice is correlated with elevated angiotensin II, endothelin-1, and mean arterial blood pressure // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 2003. -Vol. 193. - P. 177-187.
19. Lund A.K., Goens M.B., Nunez B.A., and Walker M.K. Characterizing the role of endothelin-1 in the progression of cardiac hypertrophy in aryl hydrocarbon receptor (AhR) null mice // Toxicol. Appl. Pharmacol. -2006. - Vol. 212. - P. 127-135.
20. Moller J.H., Moodie D.S., Blees M., Norton J.B., Nouri S. Symptomatic heart disease in infants: comparison of three studies performed during 1969-1987 // Pediatr. Cardiol. - 1995. - Vol. 16. - P. 216-222.
21. Mиnzel P.A., Schmohl S., Heel H., Kdlberer K., Bock-Hennig B.S., Bock K.W. Induction of Human UDP Glucuronosyltransferases (UGT1A6, UGT1A9, and UGT2B7) by t-Butylhydroquinone and 2,3,7,8-
Tetrachlorodibenzo-p-Dioxin in Caco-2 Cells // Drug Metab. Dispos. - 1999. - Vol. 27. - P. 569-573.
22. Quattrochi L.C., Vu T., Tukey R.H. The human CYP1A2 gene and induction by 3-ethylcholanthrene // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol. 269. - P. 6949-6954.
23. Sugatani J., Nishitani S., Yamakawa K., Yoshinari K., Sueyoshi T., Negishi M. Transcriptional Regulation of Human UGT1A1 Gene Expression: Activated Glucocorticoid Receptor Enhances constitutive Androstane Receptor/Pregnane X Receptor-Mediated UDP-Glucuronosyltransferase 1A1 Regulation with Glucocorticoid Receptor-Interacting Protein 1 // Mol. Pharm. - 2005. - Vol. 67. - P. 845-855.
24. Takahata S., Sogawa K., Kobayashi A., Ema M., Mi-mura J., Ozaki N. Transcriptionally Active Heterodimer Formation of an Arnt-like PAS Protein, Arnt3, with HIF-1a, HLF, and Clock // Bioch. bioph. res. Commun. - 1998. - Vol. 248. - P. 789-794.
25. Whitlock J.P. Induction of cytochrome P4501A1 // Annu. Rev. Toxicol. - 1999. - Vol. 39. - P. 103-125.
26. Yueh M., Huang Y., Chen S., Nguyen N., Tukey R. Involvement of the xenobiotic response element (XRE) in Ah receptor-mediated induction of human UDP-glucuronosyltransfer-ase 1A1 // J. Biol. Chem. -2003. - Vol. 278. - P. 15001-15006.
27. Zhang R., Zuckerman J.H., Giller C.A., Levine B.D. Transfer function analysis of dynamic cerebral autoregulation in humans // Am. J. Physiol. - 1998. -Vol. 274. - P. 233-241.
103
