CC BY
0Оригинальные исследования
Исследование антиоксидантной активности мальвидина в условяих ишемии головного мозга
С.А. Даниелян, Д.И. Поздняков
Study of malvidine activity in conditions of brain ischemia
S.A. Danielyan, D.I. Pozdnyakov
Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Пятигорск
Ключевые слова: церебральная ишемия, фокальная ишемия головного мозга, антиоксидантная активность, ферменты антиоксидантной защиты, перекисное окисление липидов, этилметилгидроксипиридина сукцинат, ацетилцистеин, холина альфосцерат, флавоноиды, мальвидин
Резюме
Исследование антиоксидантной активности мальвидина в условяих ишемии головного мозга
С.А. Даниелян, Д.И. Поздняков
Работа посвящена исследованию соединения растительного происхождения - мальвидина на предмет антиоксидантной активности в условиях фокальной церебральной ишемии. Эксперимент был выполнен на крысах-самцах линии Вистар массой 220-240 г. 36 особей были разделены на шесть равных групп (п=6). В качестве референтных препаратов использовали Этилметилгидроксипиридина сукцинат (100 мг/кг), Ацетилцистеин (150 мг/кг), Холина альфосцерат (100 мг/кг). Мальвидин вводили в дозе (100 мг/кг). Все соединения вводились внутрибрюшинно на следующие сутки после операции и в течение трех суток. Фокальную ишемию головного мозга моделировали путем термокоагуляции правой среднемозговой артерии. Все манипуляции над животными проводились под хлоралгидратным наркозом (350 мг/кг). В результате эксперимента наблюдалось снижение ферментов эндогенной антиоксидантной защиты (АОЗ) (супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, каталазы) на фоне фокальной ишемии головного мозга. Применение референтных препаратов за счет повышения активности антиоксидантной системы привело к коррекции данного состояния. Введение мальвидина, в свою очередь, также привело к увеличению концентрации ферментов АОЗ относительно группы крыс НК. Исходя из полученных данных, можно предполагать, что мальвидин представляет особый интерес для дальнейшего углубленного изучения.
Ключевые слова: церебральная ишемия, фокальная ишемия головного мозга, антиоксидантная активность, ферменты антиоксидантной защиты, перекисное окисление липидов, этилметилги-дроксипиридина сукцинат, ацетилцистеин, холина альфосцерат, флавоноиды, мальвидин
Даниелян Сирануш Артуровна - преподаватель, кафедра фармакологии с курсом клинической фармакологии, Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский Университет» Минздрава России. ORCID ID: 00000001-9898-0518. E-mail: 79682650210@yandex.ru, +79682624442
Поздняков Дмитрий Игоревич - кандидат фармацевтических наук, доцент, кафедра фармакологии с курсом клинической фармакологии, Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России. ORCID ID:0000-0003-0889-7855. E-mail: pozdniackow.dmitry@yandex.ru, +79187560889.
Abstract
Study of malvidine activity in conditions of brain ischemia
S.A Danielyan, D.I. Pozdnyakov
The work is devoted to the study of a plant compound, malvidin, for antioxidant activity under conditions of focal cerebral ischemia. The experiment was carried out on male Wistar rats weighing 220-240 g. 36 animals were divided into six equal groups (n = 6). Ethylmethylhydroxypyridine succinate (100 mg / kg), acetylcysteine (150 mg / kg), and Choline alfoscerate (100 mg / kg) were used as reference preparations. Malvidin was administered at a dose (100 mg / kg). All compounds were injected intraperitoneally on the next day after the operation and within three days. Focal cerebral ischemia was modeled by thermocoagulation of the right middle cerebral artery. All manipulations on the animals were performed under chloral hydrate anesthesia (350 mg / kg). As a result of the experiment, a decrease in the enzymes of endogenous antioxidant defense (AOD) (superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase) was observed against the background of focal cerebral ischemia. The use of reference drugs by increasing the activity of the antioxidant system led to the correction of this condition. The administration of malvidin, in turn, also led to an increase in the concentration of AOD enzymes relative to the group of NK rats. Based on the data obtained, it can be assumed that malvidin is of particular interest for further in-depth study. Key words: cerebral ischemia, focal cerebral ischemia, antioxidant activity, antioxidant defense enzymes, lipid peroxidation, ethylmethylhydroxypyridine succinate, acetylcysteine, choline alfoscerate, flavonoids, malvidin
Введение
По данным ВОЗ, цереброваскулярные заболевания являются второй ведущей причиной смерти в мире и основной причиной инвалидности среди взрослых [1].
Ключевым фактором, опосредующим повреждение, связанное с инсультом, является окислительный стресс. Окислительный стресс представляет собой дисбаланс двух противоположных систем организма - производства активных форм кислорода (АФК) и антиоксидантов, при этом повреждающие эффекты АФК более сильны по сравнению с компенсирующим эффектом антиоксидантов в клетках. АФК образуются в биологических системах как побочные продукты метаболизма, включая супероксидные радикалы (О2 -), пероксид водорода (Н202) и гидроксильные радикалы (ОН) [2].
Следовательно, одним из защитных механизмов клетки от оксидативного стресса является активация антиоксидантных защитных систем организма. Выделяют несколько важнейших ферментативных антиоксидантов, которые преобразуют реакционно-активные свободные радикалы кислорода в менее токсичные соединения. К ним относятся: су-пероксиддисмутаза (СОД), глутатионпероксидаза (ГП), каталаза [3].
Стоит отметить, что в производстве АФК участвуют митохондрии. Митохондрии являются электростанциями клетки и реализовывают ее основные функции, включая производство АТФ, внутриклеточного Са 2+, но вместе с этим митохондрии участвуют в производстве АФК, регуляции апоптотиче-ской гибели клеток и в активации семейства проте-аз каспаз [4]. Окислительный стресс и дисфункция митохондрий играют важную роль в патогенезе нейродегеративных заболеваний, таких как ишеми-ческий инсульт [4-6].
Было доказано, что Холина альфосцерат представляет собой соединение, которое косвенно снижает активность основных внутриклеточных ферментов, генерирующих супероксид. Препарат увеличивал эффективность потребления кислорода митохондриями, связанного с комплексом I, что приводило к снижению биохимических признаков окислительного стресса [7].
Ацетилцистеин, являясь предшественником глутатиона, защищает клетки от окислительного стресса и поддерживает внутри них окислительно-восстановительный баланс, улучшая при этом выживаемость клеток [8].
Возможность применения
Этилметилгидроксипиридина сукцината при ней-родегенеративных болезнях обусловлена именно наличием антиоксидантных свойств данного препарата [9].
Полифенолы - это природные соединения с различными потенциальными фармакологическими эффектами, такими как антиоксидантный, противовоспалительный, метаболический и нейропро-тективный. Полифенолы могут нейтрализовать свободные радикалы, отдавая электрон или атом водорода, чтобы подавить образование свободных радикалов или деактивировать активные частицы и предшественники свободных радикалов [10, 11].
Одним из фенольных соединений, которое изучалось нами ранее, является мальвидин [12]. Известно, что данное соединение может противодействовать окислительному стрессу в нейрональ-ных клетках [13].
Таким образом, данные классприродных соединений вызывает интерес в связи с их широким применением при различных патологических состояниях организма.
Цель работы
Изучить антиоксидантные свойства мальвидина
в условиях фокальной церебральной ишемии.
Материал и методы
Исследование выполнено на 36 крысах-самцах линии Wistar массой 220-240 грамм, разделенных на 6 равных групп (n=6). Работа с экспериментальными животными выполнялась в соответствии с общепринятыми этическими нормами: Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (1986). Все манипуляции соответствовали национальному стандарту Российской Федерации ГОСТ Р-53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики».
Первая группа крыс - ложнооперированные (Л/О) животные. Вторая группа животных - группа негативного контроля (НК), получала 0,9% раствор натрия хлорида в эквивалентном объеме. Второй - шестой группам крыс моделировали ишемиче-ское повреждение головного мозга методом необратимой окклюзии правой средней мозговой артерии [14].
В качестве препаратов сравнения былы выбраны Этилметилгидроксипиридина сукцинат (Мексикор, 100 мг/кг, ЭкоФармИнвест, Россия) [15], Ацетилцистеин (АЦЦ, 100 мг/кг, Гермес Арцнаймиттель ГмбХ, Германия [8], и Холина аль-фосцерат (Церепро, 150 мг/кг, Верофарм) [16].
Препарат сравнения и исследуемые соединения вводили интрагастрально на следующие сутки после воспроизведения ишемии и далее на протяжении 3 суток. Исследуемое соединение - мальвидин, вводили животным в дозировке 100 мг/кг [12].
На четвертые суки крыс декапитировали, незамедлительно извлекали головной мозг для получения гомогената. Далее гомогенат головного мозга готовили на 100мМ трис-НС1 буфере (рН 7,4) в соотношении 1:10 [17].
Активность ферментов эндогенной антиокси-дантной защиты: супероксиддисмутазу, каталазу, глутатионпероксидазу определяли в постъядерной фракции гомогената головного мозга [18-20].
Обработку результатов эксперимента проводили методом вариационной статистики с применением пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., США для операционной системы Windows). Полученные данные проверяли нормальность распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. В том случае, если данные распределения оказывались нормальными, для сравнения средних использовали ANOVA с апостериорным критерием Ньюмена-Кейсла. В случае ненормального распределения результатов опыта, дальнейшую статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Вилкоксона.
Результаты и обсуждение
После воспроизведения ишемии головного мозга у крыс группы НК наблюдалось снижение ферментов АОЗ относительно ЛО группы животных.
Так, на фоне фокальной церебральной ишемии у крыс группы НК отмечено снижение СОД на 76,9% (р<0,05), ГП на 76% (р<0,05) и каталазы на 87,2% (р<0,05) в сравнении с группой ЛО (рис. 2, 3)
Введение животным препаратов сравнения привело к увеличению активности АОЗ относительно группы крыс НК. На фоне введения крысам Этилметилгидроксипиридина сукцината было отмечено повышение СОД на 58,5% (р<0,05), ГП на 64% (р<0,05) и каталазы на 74,8% (р<0,05) в сравнении с группой крыс НК. У животных, получавших в качестве фармакологической поддержки Ацетилцистеин, относительно группы крыс НК концентрация СОД была увеличена на 49% (р<0,05), ГП на 43,2% (р<0,05), каталазы на 65,6% (р<0,05). Введение Холина альфосцерата крысам привело к увеличению СОД на 33,2% (р<0,05), ГП на 35,6% (р<0,05) и каталазы на 53,3% (р<0,05) относительно группы крыс НК (рис. 2, 3).
Исследование влияния экспериментального соединения - мальвидина на концентрацию АОЗ в условиях фокальной ишемии головного мозга крыс показало, что на фоне введения мальвидина наблюдалось повышение концентрации ферментов АОЗ относительно группы крыс НК: концентрация СОД на 65,9% (р<0,05), ГП на 51% (р<0,05), каталаза на 68,4% (р<0,05). Следует отметить, что концентрация Глутатионпероксидазы у животных, получавших мальвидин, достоверно была выше, чем у группы крыс, получавших Холина альфосцерат (на 24,17%) и Ацетилцистеин (14%). При этом статистически значимых отличий при сравнении группы, получавших Этилметилгидроксипиридина сукци-нат и группы, которой вводили Мальвидин, не обну-ружено. У группы крыс, принимавших мальвидин, концентрация СОД относительно группы, которой вводили Этилметилгидроксипиридина сукцинат, была увеличена на 24,27%. В сравнении с группами, получавшими Ацетилцистеин и Холина альфосце-рат, этот показатель был повышен на 38,2% (р<0,05) и 52,9% (р<0,05) (рис. 2,3).
В последние годы был достигнут прогресс в исследованиях, посвященных проблеме ишемическо-го инсульта. Ученые сконцентрировали внимание на роли окислительного стресса на фоне ишемиче-ских повреждений, что создает перспективы для поиска новых соединений, оказывающих позитивное действие на течение ишемического инсульта [21]. Окислительный стресс характеризуется дисбалансом эндогенной антиоксидантной системы организма, при котором происходит выработка многочисленных свободных радикалов, включая АФК. В проведенном исследовании было обнаружено, что соединение мальвидин, относящееся к группе ан-тоцианов, способно увеличивать концентрацию ферментов антиоксидантной системы организма. Так, мальвидин увеличивал концентрацию СОД на 68,6% (р<0,05), ГП на 51% (р<0,05) и каталазы на 68,4% (р<0,05) относительно группы крыс НК. В этой связи остается открытым для обсуждения и
Рис. 1 Дизайн исследования
ю 400
#
I Супероксиддисмутаза ■ Глутатионпероксидаза
*
* I
н *
ш I ■ I
*
* *
*
0
Рис. 2 Влияние препаратов сравнения и мальвидина на концентрацию супероксиддисмутазы и глуттионпероксидазы в постядерной фракции гомогената головного мозга крыс на фоне ишемии
Примечание: # - достоверно относительно ЛО группы крыс; * - достоверно относительно группы крыс НК; Мексикор - этилметилгидроксипиридина сукцинат
исследования вопрос о механизме действия мальвидина. Учитывая сложный многонаправленный механизм возникновения окислительного стресса и его многочисленные последствия для организма, мы предполагаем, что мальвидин может оказывать влияние на митохондриальную дисфункцию, развивающуюся в рамках ишемического инсульта. Так как разобщение электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий лежит в основе возникновения окислительного стресса, возможно, мальвидин защищает митохондрии и сложные процессы, протекающие внутри ЭТЦ. Кроме того, активно обсуждается связь между маркерами окислительного стресса и динамикой возникновения тромбов на фоне ишемического инсульта [21]. Прямая связь между тромбозами и окислительным стрессом наводит на
предположение, что мальвидин может улучшать реологические свойства крови посредством уменьшения агрегации тромбоцитов и, соответственно, улучшать эндотелиальную функцию сосудов. Все вышеперечисленное служит основанием для проведения дальнейшего исследования мальвидина с целью изучения его подробных механизмов, направленных на терапию или профилактику ишеми-ческих состояний.
Выводы
1. Экспериментально воспроизведенная ишемия головного мозга крыс приводит к окислительному стрессу, что выражалось в снижении ферментов антиоксидантной защиты клеток. У группы крыс
1,4
1,2 Ш 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
¿Г
Рис. 3 Влияние препаратов сравнения и мальвидина на концентрацию каталазы в постядерной фракции гомогената головного мозга крыс на фоне ишемии
*
ж
ж
*
#
НК относительно группы ЛО животных концентрация СОД была снижена на 76,9% (p<0,05), ГП на 76% (p<0,05) и каталазы на 87,2% (p<0,05).
2. Введение референтных препаратов крысам вызывает усиление антиоксидантной защиты нейронов в сравнении с группой НК. У группы крыс, которой вводили Этилметилгидроксипиридина сукци-нат, концентрация СОД возросла на 58,5% (p<0,05), ГП на 64% (p<0,05) и каталазы на 74,9% (p<0,05) относительно группы крыс НК. На фоне введения Ацетилцистеина крысам, отмечалось повышение концентрации СОД на 49% (p<0,05), ГП на 43,2% (p<0,05) и каталазы на 65,6% (p<0,05) относительно группы крыс НК. Терапия крыс Холина альфосце-ратом также привела к увеличению концентрации СОД на 33,2% (p<0,05), ГП на 35,5% (p<0,05) и ката-лазы на 53,3% (p<0,05) в сравнении с группой крыс НК.
3. На фоне введения мальвидина животным наблюдалось увеличение концентрации СОД на 68,6% (p<0,05), ГП на 51% (p<0,05) и каталазы на 68,4% (p<0,05) относительно группы крыс НК. Следует предполагать, что исследуемое соединение - маль-видин обладает антиоксидантной активностью, повышая концентрацию ферментов АОЗ. В дальнейшем особенный интерес представляет углубленное исследование мальвидина с целью выявления потенциального механизма действия.
Литература
1. Cheng YC, Sheen JM, Hu WL, Hung YC. Polyphenols and Oxidative Stress in Atherosclerosis-Related Ischemic Heart Disease and Stroke. Oxid Med Cell Longev. 2017;2017:8526438. doi: 10.1155/2017/8526438. Epub 2017 Nov 26. PMID: 29317985; PMCID: PMC5727797.
2. G. Pizzino, N. Irrera, M. Cucinotta et al., "Oxidative stress: harms and benefits for human health," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2017, Article ID 8416763, 13pages, 2017.
3. Kofler J., Hurn P.D., Traystman R.J. SOD1 overexpression and female sex exhibit region-specific neuroprotection after global cerebral ischemia due to
cardiac arrest //J. Cereb Blood. Flow. Metab. — 2005. — № 25. — P. 1130.
4. Baxter P, Chen Y, Xu Y, Swanson RA. Mitochondrial dysfunction induced by nuclear poly(ADP-ribose)polymerase-1: a treatable cause of cell death in stroke. Transl Stroke Res. 2014 Feb;5(1):136-44. doi: 10.1007/ s12975-013-0283-0. Epub 2013 Sep 7. PMID: 24323707; PMCID: PMC4034530.
5. Zhao H, Han Z, Ji X, Luo Y. Epigenetic Regulation of Oxidative Stress in Ischemic Stroke. Aging Dis. 2016 May 27;7(3):295-306. doi: 10.14336/AD.2015.1009. PMID: 27330844; PMCiD: PMC4898926.
6. Melo A, Monteiro L, Lima RM, Oliveira DM, Cerqueira MD, El-Bacha RS. Oxidative stress in neurodegenerative diseases: mechanisms and therapeutic perspectives. Oxid Med Cell Longev. 2011,2011:467180. doi: 10.1155/2011/467180. Epub 2011 Nov 24. PMID: 22191013; PM-CID:
7. Strifler G, Tuboly E, Görbe A, Boros M, Pe'z D, Hartmann P. Targeting Mitochondrial Dysfunction with L-Alpha Glycerylphosphorylcho-line. PLoS One. 2016 Nov 18;11(11):e0166682. doi: 10.1371/journal. pone.0166682. PMID: 27861548; PMCID: PMC5115775.
8. Tardiolo G., Bramanti P., MazZ?n E. Overview on the Effects of N-Acetylcysteine in Neurodegenerative Diseases. Molecules. 2018; 13;23(12). pii: E3305. doi:10.3390/molecules23123305.
9. Воронина ТА. Мексидол. Основные неиропсихотропные эффекты и механизм действия // Поликлиника. — 2009. — № 5. — С. 32-36.
10. Hussain T, Tan B, Yin Y, Blachier F, Tossou MC, Rahu N. Oxidative Stress and Inflammation: What Polyphenols Can Do for Us? Oxid Med Cell Longev. 2016;2016:7432797. doil 10.1155/2016/7432797. Epub 2016 Sep 22. PMID: 27738491; PMCID: PMC5055983.
11. Kleinschnit^C., Grund H., Wingler K. et al. Post-stroke inhibition of induced NADPH oxidase type 4 prevents oxidative stress and neurodegeneration // PLoS Biology. — 2010. — № 8. — Р.1-13.
12. Воронков А.В., Поздняков Д.И., Нигарян СА. Дозозависимое изучение церебропротективных свойств мальвидина. Медицинская наука Армении НаН РА. 2019;(2):3-11.
13. Matsunaga N., Imai S., Inokuchi Y. et al., "Bilberry and its main constituents have neuroprotective effects against retinal neuronal damage in vitro and in vivo," Molecular Nutrition and Food Research, vol. 53, no. 7, pp. 869877, 2009.
14. Воронков А.В., Поздняков Д.И., Нигарян СА, Хури Е.И., Мирошниченко К.А., Сосновская А.В., Олохова Е.А. Оценкареспироме-трической функции митохондрий в условиях патологийразличного генеза. Фармация и фармакология. — 2019. — Vol.7, №1. — P.20-31. DOI:10.19163/2307-9266-2019-7-1-20-31.
15. Voronkov A.V., Pozflnyakov D.I. Endothelotropic activity of 4-hydroxy-3, 5-di-tret-butylcinnamic acid in the conditions of experimental cerebral ischemia // Research Result: Pharmacology and Clinical Pharmacology/. - 2018. - Vol.4, №2. - Р. 1-10. DOI: 10.3897/ rrpharmacology.4.26519.
16. Shul'ginovaA.A., Laskov V.B., KonoplyaA.I., KaraulovA.V. Pharmacological correction of red blood cell membrane lipid spectrum in patients
with chronic cerebral ischemia on the background of hypertensive disease // Eksp Klin Farmakol. — 2016. — Vol.79, №7. — P.3-7.
17. Владимиров ЮА., Арчаков, А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. — М.: Наука, 1972. — 252 с.
18. Чумаков В.Н., Осинская Л.Ф. Количественный метод определения активности цинк-медь-зависимои супероксиддисмутазы в биологическом материале // Вопр. мед. химии. — 1977. — № 5. — С. 712-716.
19. Королюк М.А. Метод определения активности каталазы //Лаб. дело. — 1988. — № 1. — С. 16-19.
20. Prohaska, J.R. The glutathione peroxidase activity of glutathione-S-trans-ferases // Biochim. Biophys. Acta. - 1980. - Vol. 611. - P. 87-98.
21. Li, Z, Bi, R, Sun, S, et al. The Role of Oxidative Stress in Acute Ischemic Stroke-Related Thrombosis // Oxid Med Cell Longev. — 2022. — Vol.16.
