CC BY
49
УДК: 579.8.083.32
ИСПЫТАНИЕ МОНОАЛЛЕРГЕНОВ ИЗ НОКАРДИЙ И РОДОКОККОВ В КОЖНЫХ РЕАКЦИЯХ
© 2011 Нуратинов Р.А.1, Султанов А.А.2
1 Дагестанский государственный университет 2 Комитет по ветеринарии при Правительстве Республики Дагестан
Обнаружена аллергическая реакция на моноаллергены из нокардий и родококков у опытных животных, сенсибилизированных микобактериями и наоборот, что указывает на близкое родство антигенной структуры этих микроорганизмов. The allergic reaction on monoallergens from Nocardia and Rhodococcus in experimental animals, sensitized by Micobacte-rium, is discovered and, on the contrary, that shows on close relacionship of antigenic structure of these microorganisms. Ключевые слова: микобактерии, нокардии, родококки, аллергены, антиген, иммунологические реакции. Keywords: mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, allergens, antigen, immunologic reactions.
Введение. Часто, в практике бактериологических исследований материалов на обнаружение микобактерий, выделяются микроорганизмы, морфологические признаки которых очень напоминают таковых у микобактерий, однако при дополнительном исследовании специальными методами, удается идентифицировать нокардий и родококков.
Экспериментальные исследования показали, что некоторые виды нокардий и родококков способны сенсибилизировать опытных животных к туберкулину. Наличие общих антигенов у микобактерий, нокардий и родококков отражалось в перекрестных реакциях клеточного и гуморального иммунитета. Эти исследования позволили рассматривать данных микроорганизмов, как весьма вероятных факторов неспецифической сенсибилизации к туберкулину.
По культуральным и морфологическим свойствам, нокардий и родококков трудно отличить от микобактерий. Поэтому для их идентификации, наряду с изучением культуральных, морфологических и тинкториальных свойств, необходимо использовать множество биохимических тестов, с помощью которых можно было бы эффективно дифференцировать выделенных культур.
Материалы и методы. Исследования показали, что в целях дифференциации микобактерий от нокардий и родококков можно с успехом использовать метод определения липида LCN-а в этанол-эфирных экстрактах с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Как известно, высокомолекулярные миколовые кислоты микобактерий не извлекаются данным растворителем и не выявляются по хроматограмме. Метод, предложенный Kanetsuna F. and Bartoli A.(1972), относительно легкий в исполнении и не требует больших материальных затрат и состоит из 3 этапов:
а) получение и подготовка бакмассы;
б) экстракция миколовых кислот;
в) тонкослойная хроматография на силикагеле.
Выращенную на среде Сотона бактериальную массу дважды промывают дистиллированной водой (при 5000 об/мин), высушивают в течение суток при 370С. После высушивания ее измельчают в ступке и навеску 400 мг заливают 4 мл 96% этилового спирта и серного эфира (в соотношении 1:1). Пробирку маркируют, оставляют на 24 часа, периодически встряхивая, и дважды меняя экстракционную смесь. Чем больше экстрагируют, тем полнее выделяются миколовые кислоты. Профильтрованные через бумажный фильтр экстракты высушивают при 340С в течение 20-24 ч. Затем экстракт разводят бензолом из расчета 0,3 мл на 400 мг исходной бактериальной массы и 0,01 мл этого раствора наносят в точку «старта», на расстоянии 2,5 см от края пластинки и 1,5 см друг от друга. На пластинке отмечают фронт подъема растворителя 13,5 см. После прохождения системы растворителя пластинку вынимают, переворачивают и высушивают под вытяжкой 20 минут. Эту процедуру повторяют еще 2
раза. Глубина погружения пластинки в растворитель должна быть не более 0,5 см. Исследования показали, что наилучшее разделение пятен липида происходит в системе, состоящей из 50 мл гексана, 50 мл эфира и 2 мл ледяной уксусной кислоты.
Пятна липида выявляют обработкой пластинки 10% спиртовым раствором фосфорно-молибденовой кислоты. Для подтверждения наличия пятен липида LSN-A, параллельно, не проявленные пластинки помещают в сосуд с метанолом.
После того как метанол достигает отмеченного уровня, пластинку высушивают 2-3 мин и опрыскивают фосфорно-молибденовой кислотой. Затем ставят в сушильный шкаф для проявления при температуре 1050С в течение 10-12 минут. В качестве контроля используют музейный штамм
Для родовой дифференциации Nocardiа и Rhodococcuc использовали 2 теста: определение арильсульфатазной активности (через 2 недели выращивания культур) и определение анаэробного усвоения глюкозы (тест Hugh R., Leifson E.). Как известно, родококки не обладают арильсульфатазной активностью, а нокардии не способны анаэробному усвоению глюкозы.
Анаэробное усвоение кислорода определяют на среде, состоящей из следующих компонентов: пептон - 5,0; дрожжевой экстракт - 0,5 г; глюкоза - 5,0; бромкрезолпурпур - 0,02; агар - 1,0; вода дистиллированная - 500 мл; рН среды устанавливают - 7,0. Компоненты растворяют, разливают в пробирки, заполняя 2/3 часть. Стерилизуют 20 минут при 1250С. Перед использованием среду пропаривают 1015 минут для удаления растворенного кислорода, а затем ставят в холодную воду для затвердевания. Посев производили погружением петли с исследуемой культурой до дна пробирки. Затем пробирки заливали стерильным парафином толщиной слоя 25 мм и инкубировали 5 дней при температуре 370С.
Изменение малинового цвета индикатора на желтый, по всей длине пробирки, указывало на анаэробное образование кислоты.
В сомнительных случаях, в качестве дополнительного теста дифференциации нокардий от ро-дококков использовали метод определения их устойчивости к митомицину-С. Родококки проявляют устойчивость к этому антибиотику.
Результаты сравнительного изучения способов очистки и концентрации активного белка из культуральной жидкости после 2 месячного выращивания N. asteroides, R.bronchialis показали, что наиболее приемлемым является способ осаждения хлористым натрием в концентрации 15-20% и при
Результаты исследований. Многие исследователи предлагают использовать для дифференциации аллергических реакций на туберкулин моноаллергены, изготовленные из одного вида атипичных микобактерий, который чаще всего выделяется от животных и наиболее распространен в объектах внешней среды.
Аналогично этому, нами была предпринята попытка получить аллергены из нокардий и родо-кокков, а затем испытывать их на сенсибилизированных животных.
Испытание аллергенов проводили на кроликах, зараженных музейными культурами микобак-терий, нокардий и родококков, а также выделенными из патматериалов, реагировавших на туберкулин животных культурами N.asteroides, N.brasiliensis, N.transvalensis, R.eritropolis. R.bronchialis. Каждой культурой заражали по 3 кролика, подкожно, в область брюшка, введением 10 мг влажной культуры в физиологическом растворе.
Динамику кожных аллергических реакций на тот или иной сенситин изучали через 30, 60 и 90 дней после заражения. Полученные данные отражены в таблице 1.
Как видно, через месяц после заражения на оба аллергена реагировали кролики почти всех групп. На гомологичные заражению аллергены реакции были интенсивнее выражены, чем на гетеро-логичные. Они наблюдались также на оба аллергена у кроликов зараженных родококками, но интенсивность реакций больше проявлялась на сенситин из нокардий. При исследовании через 2 месяца после заражения, реакции на туберкулин сохранились только у кроликов зараженных микобактерия-ми и у одного животного инфицированного N.transvalensis. У этого кролика реакция сохранилась до конца наблюдений. В остальных группах кролики реагировали только на нокардиозный аллерген.
Аналогичной была картина и при исследованиях через 90 дней, однако интенсивность реакций была высокой, чем при предыдущих исследованиях. За время наблюдений, на туберкулин не реагировали кролики, зараженные музейной культурой N. vaccinii и выделенной культурой R. eri-tropolis и R. bronchialis. У всех этих животных были отмечены реакции на нокардиозный аллерген.
N.asteroides.
рН - 3,9 - 4,1.
Таблица 1
Динамика проявления аллергических реакций на туберкулин и нокардиозный аллерген
у экспериментально зараженных кроликов
№ п/п Вид заражаемой культуры Интенсивность реакций (в мм2) при исследовании через дней
30 60 90
ППД-туберкулин Аллерген из нокардий ППД-туберкулин Аллерген из нокардий ППД-туберкулин Аллерген из нокардий
1 М.БЦЖ 171,7+14,4 101,5+57,5 193,5+78,5 187,1+62,5 215,0+0 -
2 M.avium 114,7+92,7 134,3+56,7 345,0+0 253,5+91,5 - -
3 M.scrofulaceum 157,3+52,4 110,3+41,3 65,0+0 - 137,0+0 90,0+0
4 M.phlei 106,0+6,0 113,0+23,6 56,0+0 153,3+17,4 62,0+17,4 42,5+0
5 N.asteroides 100,0+0 196,0+56,1 - 219,0+56,0 100,0+0 62,0+0
6 N.brasiliensis 42,7+8,9 - - 79,0+26,0 - 190,3+38,5
7 N.transvalensis 110,0+10,0 135,0+7,7 166,0+0 150,0+0 75,0+0 -
8 N.vakcinii - 150,0+0 - - - 67,0+0
9 R.equi 150,0+0 - 50,0+0 - 208,0+97,7
10 R.bronchialis - - 67,0+11,3 - 155,0+20,0
11 N.transvalensis (в) 262,8+54,0 - 128,0+68,0 - 201,0+74,0
12 N.asteroides (в) 231,0+19,0 - 71,7+22,0 - 143,0+7,0
13 N.brasiliensis (в) 347,8+89,2 - 59,5+29,5 95,0+0 135,3+39,8
14 R.eritropolis (в) - - 57,8+18,4 - 181,5+31,5
15 R.bronchialis (в) 207,8+16,7 158,5+8,5 - - 125,0+0 112,3+17,3
16 Контрольные (8 голов) - - - - - -
Примечание: (в) - выделенная культура.
Почти такие же результаты получили в опыте с параллельным введением ППД-туберкулина и аллергена из родококков. Наибольшая интенсивность наблюдалась в группах зараженных родокок-ками на аллерген из R. bronchialis. На этот аллерген обнаружили самую меньшую интенсивность реакций у кроликов, зараженных микобактериями.
Исследования показали, что животные, инфицированные нокардиями и родококками, реагируют на ППД-туберкулин для млекопитающих и на аллергены, приготовленные из них. Однако наблюдалась строгая закономерность проявления повышенной интенсивности реакции на гомологичный заражению аллерген. Наличие общих группоспецифических антигенов у этих микроорганизмов проявлялась и в других иммунологических тестах (РБТЛ - реакция бласттрансформации, РСЛЛ - реакция специфического лизиса лимфоцитов, РСК - реакция связывания комплемента, РНГА - реакция непрямой гемагглютинации).
Аллергены из нокардий и родококков испытали на больных туберкулезом животных неблагополучного по туберкулезу хозяйства (совхоз им. «Коркмасова», Карабудахкентского района РД). При проведении предварительных исследований 98% животных на ферме реагировали на туберкулин.
В опыт взяли 50 голов. Каждую серию сенситина испытывали на 10 животных. С правой стороны шеи животного, подкожно, вводили ППД-туберкулин, а с левой - аллергены из нокардий и родококков. Учет и оценку реакции давали через 72 часа после введения. При этом установили следующее: ни одно животное не реагировало на сенситин из родококков; на вторую и третью серии нокардиозно-го аллергена также не реагировали; 5 из 10 - во второй и 2 из 20-в третьей группе реагировали на туберкулин; одно животное в первой группе реагировало на оба аллергена; в четвертой группе на туберкулин реагировали 4 животное, а 3 из них - на нокардиозный аллерген. Средняя интенсивность реакций на туберкулин составляла 4,7+0,09, на нокардиозный аллерген - 4,0+0,07. Эти исследования также подтвердили данные, полученные в экспериментальных условиях.
Обсуждение. Таким образом, исследования показали, что при индикации различных культур из биоматериалов, используя методы выявления микобактерий, часто обнаруживаются колонии с похо-
жей морфологией. Детальная идентификация этих культур на основе исследования комплексом биохимических тестов показали, что часто среди выделенных штаммов обнаруживаются не микобакте-рии, а нокардии и родококки. Поэтому, при микробиологических исследованиях биоматериалов на обнаружение микобактерий выделенных культур, следует идентифицировать хотя бы в пределах родов, поскольку может создаться ложное представление в определении видов выделенных штаммов.
Исходя из этих соображений, в практике аллергических исследований, для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин, нам представляется перспективным создание комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ) с широким спектром антигенной структуры, в состав которого можно дополнительно внести сенситины нокардий и родококков.
УДК: 578.824.11
КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НОЗОАРЕАЛА БЕШЕНСТВА
© 2011 Нуратинов Р.А.
Дагестанский государственный университет
В статье дается история бешенства в России и в мире, характеризуется смертность различных животных от бешенства и особенности ее распространения в горных странах.
The article gives rabies's history in Russia in the world. Mortality of animals against rabies and how it spread in the mountainous country are characterized.
Ключевые слова: Бешенство, распространение, смертность. Keywords: Rabies, spread, mortality.
Бешенство известно человеку более 5 тысяч лет. Целенаправленную работу по изучению бешенства начали только в 40-50-х годах ХХ века (Карпов, 1961). Первая крупная вспышка бешенства в Европе произошла во Франконии в 1271 году (среднее течение Рейна и бассейн Майна). Упоминается о том, что бешеные волки в тот период нападали на людей и животных во многих городах и селах этой исторической области (Ведерников, 1987).
Крупные эпизоотии бешенства среди лисиц и волков происходили в 1590 г. во Франции, в 165860 гг. в Ирландии, в 1708 г. в Германии, в 1719-25 гг. - во Франции и Германии. В 1803-1830 гг. лисье бешенство охватило Французские Альпы, Южную Германию, Гессен, Гонновер, Австрию, Швейцарию. Однако, к 1850 г. лисье бешенство в Европе перестало наводить панику среди населения. Отмечают, что произошла спонтанная ликвидация эпизоотии (Ведерников, 1987; Селимов, Winkler, 1975). Единственным местом, где не укоренились очаги бешенства, является островная Британия, хотя бешенство волков и лисиц в континентальной Европе было известно издревле.
Первые сведения о заболевании людей и собак бешенством в России относятся к 1534 и 1677 годам (Сидоров, 2002), а официальным свидетельством о регистрации болезни является указ Анны Ивановны (1739), касающийся бешеной собаки, забежавшей в летний царский дворец. О случаях появления «бешеной скотинки» у кочевых племен Западной Сибири и Казахстана, покусанных волками, упоминает Карпов С.П. (1961), однако, вплоть до XIX в. бешенство «мелких» псовых (корсаков, шакалов, енотовидных собак) на территории России не обнаружено.
Эпизоотии с заболеванием лисиц бешенством были отмечены в России в 1810-1818 гг. и в 1824 г., последовавшие после вспышек, возникших в Центральной Европе. Хотя бешенство собак и волков регистрировалось постоянно, однако, вплоть до 20-х годов ХХ века бешенство корсаков, шакалов, енотовидных собак не зарегистрировано. Известно, что в течение 36 лет (1886-1922 гг.) ежегодно в России в среднем от бешенства умирало 145 человек, однако, ни один из них не погиб после контакта с лисицей (Елкин и др., 1968). Палавандов Г.В. (1928) упоминает о том, что хотя случаи укусов людей лисицами были, но все они, кроме одного случая, заканчивались благополучно.
На территории Нижнего Поволжья, Сибири, на Дальнем Востоке и в азиатской части дореволюционной России и бывшего СССР в большинстве случаев бешенство устанавливали у волков (Ведерников, 1987; Рудаков, 1971; Сидоров, 1995). Почти до середины ХХ века хозяевами и переносчи-
