CC BY
117
doi: 10.24411/0235-2451-2020-10905
УДК: 606
Использование технологии CRISPR/Cas9 при создании животных-продуцентов рекомбинантных белков человека в проектах НОЦ мирового уровня «Инновационные решения в АПК»
А. В. ДЕЙКИН1, В. О. СОЛДАТОВ2, М. В. КОРОКИН3, С. В. НАДЕЖДИН3, Л. М. ДАНИЛЕНКО3, А. Л. КУЛИКОВ3, О. А. ПУЧЕНКОВА3, М. В. ПОКРОВСКИЙ13
'Белгородский научно-образовательный центр мирового уровня «Инновационные решения в АПК», Соборная пл., 4, Белгород, 308005, Российская Федерация
2Институт биологии гена Российской академии наук, ЦКП «Геномное редактирование», ул. Вавилова, 34/5, Москва, 119334, Российская Федерация
3Белгородский государственный национальный исследовательский университет, НИИ Фармакологии живых систем, ул. Победы, 85, Белгород, 308015, Российская Федерация
The use of the CRISPR/Cas9 technology in the development of animal producers of human recombinant proteins in the projects of the world-class research and educational centre "Innovative Solutions in the Agro-Industrial Complex"
A. V. Deikin1, V. O. Soldatov2, M. V. Korokin3, S. V. Nadezhdin3, L. M. Danilenko3, A. L. Kulikov3, O. A. Puchenkova3, M. V. Pokrovskii13
Belgorod world-class Scientific and Educational Center "Innovative Solutions in the Agro-Industrial Complex", Sobornaya pl., 4, Belgorod, 308005, Russian Federation
2Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, Core Facility Centre "Genome editing", ul. Vavilova, 34/5, Moskva, 119334, Russian Federation
3Belgorod State National Research University (NRU "BelSU"), Research Institute of Pharmacology of Living Systems, ul. Pobedy, 85, Belgorod, 308015, Russian Federation
Рождение эры рекомбинантных препаратов ознаменовало создание в 1978 г. компанией 0епеп1ес первого генно-инженерного инсулина, продуцируемого штаммом Е. соИ. На сегодняшний день объем мирового рынка биотехнологий оценивается более чем в 300 млрд долл. США с ожидаемым ростом к 2025 г. до 729 млрд долл. [1].
Технологии создания рекомбинантных белков, применяемых для терапии заболеваний человека, продолжают занимать огромную долю мирового фармацевтического рынка. При этом уровень развития биотехнологий в Российской Федерации позволяет создавать конкурентоспособный продукт, что подтверждает высокая доля биологических препаратов отечественного производства в общей структуре продаж. На сегодняшний день рекомбинантные препараты используют для стимуляции кроветворения (эритропоэтины, факторы роста), заместительной (ферменты, факторы свертывания крови), противоопухолевой (моноклональные антитела) и иммунотерапии (интерферо-ны, интерлейкины, вакцины) [2]. Среди прочих преимуществ создания рекомбинантных белков перед их извлечением непосредственно из донорской крови или органов животных можно выделить удешевление и высокое качество продукта. Количество зарегистрированных рекомбинантных средств и лиц, подвергшихся лечению такими препаратами, возрастает ежегодно [3].
Подобную популярность биотехнологических препаратов в медицинской сфере в первую очередь объясняет их высокая эффективность. Кроме того, большое значение приобретает феномен патентного обвала. Фармацевтический рынок постепенно смещается в сторону дженери-ческих препаратов в связи с окончанием срока действия патентной защиты. Эта тенденция вынуждает крупнейшие фармацевтические компании фокусироваться на разработке менее прибыльных нишевых лекарств, направленных на лечение орфанных заболеваний, а также биофармацевтиче-
ских препаратов. Создавая биофармпрепараты, компания надежнее защищает себя от дженерических аналогов, поскольку воспроизведение рекомбинантных средств -это намного более длительный, сложный и рискованный процесс [4].
В статье проведён критический обзор современных направлений использования технологий модификации генома для решения задач сельского хозяйства и биомедицины с целью анализа предпосылок и современных подходов к генетическому редактированию сельскохозяйственных пород животных.
Использование многоклеточных животных как продуцентов рекомбинантных белков. Большинство существующих рекомбинантных препаратов производят на основе культур E. coli или дрожжей. В то же время некоторые белки принципиально могут быть получены только из клеток высших эукариот, которые имеют необходимый для ряда посттрансляционных модификаций набор ферментов. Первым препаратом из культуры клеток Metazoa был рекомбинантный эритропоэтин. В 1985 г. Лин с группой ученых клонировали и экспрессировали ген человеческого эритропоэтина в клетках яичников китайского хомячка [5].
Один из наиболее экономически эффективных способов производства рекомбинантных препаратов - создание генетически модифицированных (ГМ) животных, экспрессирующих целевую молекулу в молоке. Подобный подход обеспечивает простоту и стандартизацию выделения белка, не требуя высокотехнологичных условий для содержания и выращивания продуцентов. Выбор молока в качестве биологического сырья для выделения целевых белков позволяет производить продукт в течение всей жизни животного, не требуя забоя и особых процедур для выделения материала. Немногочисленные примеры создания животных, продуцирующих рекомбинантные белки человека в молоке, демонстрируют крайне высокую рентабельность и медицинскую значимость такого рода ра-
бот. Например, антитромбин III - антикоагулянтный фактор крови, применяемый для заместительной терапии у лиц с наследственной недостаточностью собственного фермента, который классически извлекали из крови доноров. В 2009 г. компания rEVO Biologies создала трансгенных коз, из молока которых в год выделяют столько же человеческого антитромбина III (препарат Атрин) сколько из крови 90 000 доноров. Кроме того, Атрин намного безопасней аналогов в отношении контаминации вирусными агентами, поскольку не контактирует с компонентами крови потенциально зараженных доноров [6].
Еще один рекомбинантный препарат, который производят таким же способом - C1 ингибитор, применяемый для лечения наследственного ангионевротического отека, синтезируется в молоке трансгенных кроликов (Компания Pharming). Благодаря революционным изменениям в области модификации генома после открытия системы CRISPR/ Cas9 подходы к модификации генома многоклеточных животных существенно упростились и усовершенствовались [7].
В 2003-2013 гг. в России реализован успешный проект по получению рекомбинантного лактоферрина человека из молока трансгенных коз [8]. Исследование проводили на базе Института биологии гена РАН (Россия) и РУП «НПЦ по животноводству НАН Белоруссии» (Белоруссия). На первом этапе была создана серия генетических конструкций, содержащих ген лактоферрина человека. Конструкцию создавали на базе общепринятого для такого рода работ вектора pBC1 milk expression kit (Invitrogen) e рядом модификаций. В первую очередь, наряду с использованием промотора бета-казеина, содержащегося в исходной конструкции, создавались конструкции с альфа-казеиновым промотором, а также с собственным промотором лактоферрина человека. Кроме различий в регуляторных элементах генетические конструкции содержали разные варианты открытой рамки считывания гена лактоферрина человека: кДНК, гибридную кДНК с первыми 3 интронами, а также полную геномную копию кодирующей части гена со всеми 14 интронами. Всего было создано 11 вариантов генетических конструкций. Следующим этапом стало исследование эффективности разработанных конструкций. Для этих целей невозможно было использовать модель транзиторной экспрессии в клеточной культуре, поскольку она драматически не соответствует условиям работы конструкции в молочной железе трансгенного животного из-за действия геномного окружения, гормонального фона и особенностей функционирования (активности синтеза белка и профиля гли-козилирования) в молочной железе. Таким образом были созданы более 100 линий первичных трансгенных мышей и более 15000 голов их потомков (вплоть до 14 поколениия). От экспериментальной популяции получено более 650 мл молока (всего более 2000 проб от лактирующих самок). Все пробы молока исследовали для определения содержания лактоферрина человека. Его выделили, проанализировали физико-химические свойства, определили вторичную структуру и аминокислотную последовательность, а также профиль гликозилирования. Анализ такого массива данных позволил определить оптимальный вариант генетической конструкции, обеспечивающей высокий (до 160 мг/мл) уровень рекомбинантного лактоферрина в молоке трансгенных мышей, полностью соответствующего природному из донорского грудного молока. Выбранные конструкции использовали для создания трансгенных коз. Все эксперименты с ними осуществляли в Белоруссии. Было проведено 118 операций по трансплантации микроинъецированных генетическими конструкциями зигот коз, родилось 33 козленка, среди которых обнаружено 2 первичных трансгена.
Обе линии генетически модифицированных коз удалось сохранить, в молоке лактирующих самок содержится лакто-феррин человека с концентрацией до 10,8 г/л. К сожалению, промышленное использование этой разработки ограничено как ввиду несовершенства системы регулирования, так и в связи с переоценкой перспектив клинического применения после неудачных клинических исследований аналогичного препарата Talactoferrin (Адегнх) и критикой применения лактоферрина для выкармливания недоношенных младенцев. Вместе с тем, этот проект демонстрирует возможность реализации в России комплекса научно-исследовательских и производственных мероприятий для создания биофарминдустрии нового типа на основе рекомбинантных белков человека из молока трансгенных животных.
В то же время активно развивается технология сайт-специфичного внесения двуцепочечных разрывов в ДНК с использованием нуклеазы Сав9 из локуса С^БРЯ [9] (рис. 1).
CRISPRJCai9
гащгщ -пгйм ттйптпт тогпг
ШШЮЕШШ
1 " ' 1
lllll'IIHlii ............in-....................."Я
Рис. 1. Технология CRISPR/Cas9 и ZNF/TALEN.
Системы, основанные на применении нуклеаз ZNF и TALEN, специфично связываются с целевой последовательностью геномной ДНК и создают в ней двухцепочечный разрыв. Восстановление поврежденного участка происходит посредством гомологичной или случайной репарации. К плюсам такой технологии геномного редактирования можно отнести высокую специфичность и низкий процент off-target взаимодействий, к минусам - высокую стоимость создания рекомбинантных нуклеаз ZNF и TALEN. Ввиду высокой специфичности и предсказуемости эффекта такая технология в целом более применима для решения медицинских задач. В свою очередь, система CRISPR/Cas9, принцип работы которой основан на комплементарном взаимодействии sgPHK и целевого участка геномной ДНК, относительно проще и дешевле. Ее применение более оправдано при научных исследованиях и работе с животными.
Сочетание технологий случайного трансгенеза и генного редактирования позволит получать животных-продуцентов рекомбинантных белков человека без примеси собственного животного белка(в результате нокаута собственного гена или его гуманизации), а также обеспечить встраивание гена человека в благоприятное место генома животного-продуцента [10]. Несмотря на то, что технологии генетического редактирования и трансгенезаразвиваются достаточно динамично, в мире предложено ограниченное количество целей для улучшения хозяйственно-значимыхпризнаков [11]. Это связано с тем, что существующие технологии позволяют вноситьлишь небольшое количество изменений одновременно. Для того, чтобы собрать в одном организме несколько изменений, привнесенных методами генной инженерии, требуется, как и в случае обычной селекции, несколько поколений различных скрещиваний родительских линий. При этом лишь небольшое количество признаков связано с каким-то одним геном. Чаще всего у современных пород они обусловлены влиянием множества генов, которые по отдельности могут ухудшать хозяйственные свойства, и только результат их
сочетания, найденного столетиями упорной селекции, становится продуктом на нашем столе [12]. Среди примеров успешного приложения генной инженерии, кроме кроликов и коз - продуцентов лекарственных белков, можно назвать животных с повышенной экспрессией гормона роста - такой трансгенный лосось уже вышел на рынок. Кроме того, разрабатывается технология получения гипоаллергенного молока на основе нокаута по гену бета-лактоглобулина, проводятся работы по созданию мясных пород разных видов с нокаутом по гену миостатина, выведена порода свиней, устойчивая к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома, ведутся исследования по созданию безрогих коров, устойчивых к вирусу лейкоза [6, 7].
В рамках реализации программ научно-образовательного центра мирового уровня «Инновационные решения в АПК» предполагается разработка проектов создания кроликов - продуцентов белков крови человека (рис. 2), свиней, нокаутных по генам рецепторов вируса репродуктивно-респираторного синдрома [12], а также мышей - моделей заболеваний человека [13, 14].
Генетическое редактирование животных в рамках НОЦ мирового уровня «Инновационные решения в АПК». Для реализации этого направления в рамках НОЦ на базе НИИ Фармакологии живых систем НИУ «БелГУ» и Института биологии гена РАН была сформирована рабочая группа, объединяющая специалистов в сфере биомедицинских исследований, экспериментальной и клинической фармакологии, генной инженерии, трансгенеза, молекулярной ней-робиологии, биоинформатики, молекулярной и клеточной биологии. Ранее ученые, вошедшие в ее состав, создали ряд трансгенных животных для биомедицинских исследований. В последние годы были получены мыши-продуценты лакто-феррина человека, проурокиназы человека, бактериального ингибитора сериновых протеаз - экотина, белка теплового шока человека HSP-70; модельные мыши, экспрессирующие альфа- и бета-цепи Т-клеточного рецептора, более 30 линий мышей, экспрессирующих люциферазу светлячка в молоке для исследования эффективности новых регуляторных элементов, модельные мыши с Cre-зависимой экспрессией интерлейкина 6 и циклофилина А, модельные мыши с суперэкспрессией мутантного белка FUS человека [8, 15, 16]. Также были созданы трансгенные козы, экспрессирующие с молоком лактоферрин человека. С применением технологии редактирования геномасозда-ны мыши, гуманизированные по гену антитромбина человека (в гетерозиготе), мыши с сайт-специфичным встраиванием под промотор бета-казеина гена GFP и сайтов узнавания дрожжевых рекомбиназ.
Кроме того, были получены и протестированы на животных с мышечной дистрофией Дюшенна препараты адено-ассоциированных вирусов, кодирующие укороченные формы утрофина. Членами коллектива создана новая мышиная модель миодистро-фии Дюшенна с делецией размером 430 т.п.о. в гене дистрофина, которая воспроизводит мутацию пациента. В рамках этой работы осуществлена трансдифференцировка фибробластов пациента в
миотубулы, для чего ген фактора транскрипции доставляли в фибробласты с помощью лентивирусов. Для создания мышиной модели использовали систему редактирования генома CRISPR/Cas9, далее при ее описании применяли различные методы молекулярной и клеточной биологии, физиологии и гистологии [16]. С целью отбора наиболее перспективных генетических конструкций для терапии мышечной дистрофии Дюшенна была создана in vitro модель заболевания на основе мышиных миобластов. В этой системе вектор на основе аденоассоциированного вируса, несущий ген микродистрофина, приводил к полному восстановлению «здорового» фенотипа в миобластах [17].
Трансляция подобного рода методологий в область сельскохозяйственных исследований в рамках программы Белогородского НОЦ «Инновационные решения в АПК» позволит создать трансгенных животных с улучшенными фенотипическими характеристиками для повышения производительности аграрного сектора [18]. Например, на сегодняшний день отечественный агропромышленный комплекс имеет потребность в породах крупного рогатого скота с улучшенными показателями молока для увеличения конкурентной способности в области сыроделия. Кроме того, трансгенные сельскохозяйственные животные могут быть использованы в сфере здравоохранения. Например, трансгенные свиньи, гуманизированные по генам главного комплекса гистосовместимости, представляют несомненный интерес для трансплантологии.
Вопросы регулирования. Важный вопрос - возможность промышленного использования результатов деятельности НОЦ мирового уровня «Инновационные решения в АПК» в области генной инженерии животных. Анализ российского [19] и международного [20] опыта показал, что принципиальный вопрос для одобрения ГМ-животных регулятором - «природоподобность» генноинженерно-го продукта. Так, использование ГМ-животных, в геном которых не встраивали чужеродную ДНК, или которые не способны к передаче модификации в ряду поколений (бесплодные гибриды), не подлежит дополнительному регулированию (это следует, например, из российского закона о генно-инженерной деятельности). В то же время повсеместно разрешены работы с ГМ-животными и растениями в рамках научных исследований (в том числе, например, при проведении полевых испытаний и клинических
Рис. 2. Получение коз/ КРС/ кроликов - продуцентов лактоферрина/альбумина/антитром-бина человека без примеси животного белка. Принципиальная схема получения животных, продуцирующих белки человека в молоке может быть представлена следующим образом: в участок, находящийся под промотором казеина (или другого белка, высокоэкспресси-рующегося в молоке) встраивается ген человека. Одновременно проводится или нокаут по гомологичному гену животного, или его замена на человеческий. Двухцепочечный разрыв в интересующей области может быть проведен с применением технологии СР18РР/Сав9.
исследований) [18]. При этом ведется активная дискуссия о пересмотре системы регулирования ГМО с целью развития отечественной биотехнологической промышленности и защиты рынка от недобросовестной конкуренции транснациональных компаний. Таким решением могло бы стать широкое распространение биотехнологических (в том числе генно-инженерных) продуктов российской разработки и строгое санитарное и технологическое регулирование доступа на рынок продукции, разработка и производство которой не локализованы в России.
Таким образом, генетическое редактирование сельскохозяйственных животных - перспективная биотехнологическая стратегия промышленного производства рекомбинантных белков человека. Очевидные ее преимущества перед классическим селекционным подходом способствуют интенсификации научных исследований в этой области. Причем одна из наиболее многообещающих технологий для генетического редактирования - система CRISPR/Cas9, принцип работы которой основан на внесении двухцепочечного разрыва в участке геномной ДНК, комплементарной направляющим sgPHK.
Мировой опыт свидетельствует, что использование геномного редактирования на основе CRISPR/Cas9
может внести большой вклад в развитие биотехнологий и быть востребованным фармацевтической промышленностью. До сих пор основной нишей в сфере создания ГМО было совершенствование сортов растений. Их широкое распространение привело к полной трансформации рынка, сопряженной с ГМ-сортами сельскохозяйственной продукции. Аналогичного эффекта можно ожидать и при распространении ГМ-пород животных.
Помимо экономического аспекта, проведению работ в этой области благоприятствует и законодательный. Сфера регулирования в области ГМО становится все более располагающей к расширению соответствующих исследований. При этом безусловный приоритет в рамках российской и европейской системы регулирования - разработка новых пород на основе нокаута генов. Мировая экономика все более благосклонно относится к выводу на рынок ГМО (в основном растений, но есть примеры и животных), содержащих рекомбинантные гены диких родственников или других видов.
Перечисленные факторы позволяют рассчитывать на высокую востребованность продуктов Белгородского НОЦ как в России, так и на мировом рынке.
Литература.
1. Ugalmugle S., Swain R. Biotechnology market size by application (biopharmacy, bioservices, bioagriculture, bioindustries, bioinformatics), by technology (fermentation, tissue engineering and regeneration, PCR technology, nanobiotechnology, chromatography, DNA sequencing, cell based assay), industry analysis report, regional outlook, application potential, competitive market share & forecast, 2019-2025. Global Market Insights, 2019. 160 p.
2. Biotechnology in the realm of history/A. S. Verma, S. Agrahari, S. Rastogi, et al. // J Pharm Bioallied Sci. 2011. Vol. 3. No. 3. P. 321-323. doi:10.4103/0975-7406.84430.
3. Красильников И. В. Перспективы развития рынка рекомбинантных препаратов// Фармацевтический вестник. 2005. Т. 375. № 16.
C. 26-7.
4. Обзор рынка биотехнологий в России и оценка перспектив его развития//РВК. Frost & Sullivan, 2014. 70 с. [Электронный ресурс]. URL: https://Www.rvc.ru/upload/iblock/e21/20141020_Russia_Biotechnology_MarkMa_fin.pdf (дата обращения: 01.07.2020).
5. Characterization and biological effects of recombinant human erythropoietin/F. K. Lin, J. K. Browne, D. K. Hines, et al. // Immunobiology. 1986. Vol. 172. No. 3-5. P. 213-224.
6. Use of transgenic animals in biotechnology: prospects and problems / O. G. Maksimenko, A. V. Deykin, Y. M. Khodarovich, et al. //Acta Naturae. 2013. Vol. 5. No. 1. P. 33-46.
7. Production of recombinant proteins in the milk of transgenic animals: current state and prospects / M. V. Shepelev, S. V. Kalinichenko, A. V. Deykin, et al. //Acta Naturae. 2018. Vol. 10. No. 3. P. 40-47.
8. Production of human lactoferrin in animal milk/I. L. Goldman, S. G. Georgieva, Y. G. Gurskiy, et al. // Biochem Cell Biol. 2012. Vol. 90. No. 3. P. 513-519. doi: 10.1139/o11-088.
9. Modification of the method for analysis of genome editing results using CRISPR/Cas9 system on preimplantation mouse embryos/T. Dimitireva,
D. Reshetov, V. Zhernovkov, et al. // Bulletin of Russian State Medical University. 2016. No. 3. P. 15-20. doi: 10.24075/brsmu.2016-03-02.
10. Production of human lactoferrin and lysozyme in the milk of transgenic dairy animals: past, present, and future / C. A. Cooper, E. A. Maga, J. D. Murray//TransgenicRes. 2015. Vol. 24. No. 4. P. 605-614. doi: 10.1007/s11248-015-9885-5.
11. Yang H., Wu Z. Genome editing of pigs for agriculture and biomedicine // Front Genet. 2018. No. 9. P. 360. doi:10.3389/ fgene.2018.00360.
12. On the way from SARS-CoV-sensitive mice to murine COVID-19 model/ V. O. Soldatov, M. V. Kubekina, Y. Y. Silaeva, et al. // Research Results in Pharmacology. 2020. Vol. 6. No. 2. P. 1-7. doi: 10.3897/rrpharmacology.6.53633.
13. Genome editing as an approach to the study of in vivo transcription reprogramming / Y. Y. Silaeva, V. A. Kalmykov, E. A. Varlamova, et al. //Dokl Biochem Biophys. 2020. Vol. 490. No. 1. P. 43-46. doi: 10.1134/S1607672920010147.
14. Transcription termination sequences support the expression of transgene product secreted with milk/A. Deykin, M. Tkhonov, V. Kalmykov, et al. //Transgenic Research. 2019. Vol. 8. No. 3-4. P. 401-410. doi: 10.1007/s11248-019-00122-9.
15. Human disease modelling techniques: current progress. / V. U. Glanz, A. N. Orekhov, A. V. Deykin, et al. // Current molecular medicine. 2018. Vol. 18. No. 10. P. 655-660. doi: 10.2174/1566524019666190206204357.
16. CRISPR/Cas9-generated mouse model of Duchenne muscular dystrophy recapitulating a newly identified large 430 kb deletion in the human DMD gene/T. V. Egorova, E. D. Zotova, D.A. Reshetov, et al.//Disease Models & Mechanisms. 2019. Vol. 12. No. 4. Article dmm037655. doi: 10.1242/dmm.037655.
17. In vitro assay for the efficacy assessment of AAV vectors expressing microdystrophin / K. A. Danilov, S. G. Vassilieva, A. V. Polikarpova, et al. //Experimental Cell Research. 2020. Vol. 392. No. 2. Article 112033. [Электронный ресурс]. URL: https://www.sciencedirect.com/science/ article/abs/pii/S0014482720302603?via%3Dihub (дата обращения: 01.08.2020). doi: 10.1016/j.yexcr.2020.112033.
19. Gene editing CRISPR/Cas9 system for producing cows with hypoallergenic milk on the background of a beta-lactoglobulin gene knockout/ Yu. Yu. Silaeva, M. V. Kubekina, A. V. Bruter, et al. //E3S Web of Conferences. 2020. Vol. 176. Article 01006[Электронный ресурс]. URL: https:// www.e3s-conferences.org/articles/e3sconf/abs/2020/36/e3sconf_idsisa2020_01006/e3sconf_idsisa2020_01006.html (дата обращения: 01.07.2020). doi: 10.1051/e3sconf/202017601006.
21. GMOs in Russia: research, society and legislation /1. V. Korobko, P. G. Georgiev, K. G. Skryabin, et al.//Acta Naturae. 2016. Vol. 8. No. 4. P. 6-13. doi: 10.32607/20758251-2016-8-4-6-13.
22. ГМО регулирование: Белоруссия, БРИКС, ЕС, США /А. В. Дейкин, В. Н. Кузнецова, Ю. К. Кирикович и др. //Азимут научных исследований: экономика и управление. 2019. Т. 8. № 4 (29). С. 141-145.
References
1. Ugalmugle S, Swain R. Biotechnology market size by application (biopharmacy, bioservices, bioagriculture, bioindustries, bioinformatics), by technology (fermentation, tissue engineering and regeneration, PCR technology, nanobiotechnology, chromatography, DNA sequencing, cell based assay), industry analysis report, regional outlook, application potential, competitive market share & forecast, 2019-2025. Global Market Insights; 2019. 160 p.
2. Verma AS, Agrahari S, Rastogi S, et al. Biotechnology in the realm of history. J Pharm Bioallied Sci. 2011;3(3):321-3. doi: 10.4103/09757406.84430.
3. Krasil'nikov IV. [Prospects for the development of the recombinant drug market]. Farmatsevticheskij vestnik. 2005;375(16):26-7. Russian.
4. [Overview of the biotechnology market in Russia and assessment of its development prospects] [Internet]. Frost & Sullivan; 2014 [cited2020 Jul 1]. 70p. Russian. Available from: https://Www.rvc.ru/upload/iblock/e21/20141020_Russia_Biotechnology_MarkMa_fin.pdf.
5. Lin FK Browne JK Hines DK, et al. Characterization and biological effects of recombinant human erythropoietin. Immunobiology. 1986;172(3-5):213-24.
6. Maksimenko OG, Deykin AV, Khodarovich YM, et al. Use of transgenic animals in biotechnology: prospects and problems. Acta Naturae. 2013;5(1):33-46.
7. Shepelev MV, Kalinichenko SV, Deykin AV, et al. Production of recombinant proteins in the milk of transgenic animals: current state and prospects. Acta Naturae. 2018;10(3):40-7.
8. Goldman IL, Georgieva SG, Gurskiy YG, et al. Production of human lactoferrin in animal milk. Biochem Cell Biol. 2012;90(3):513-9. doi: 10.1139/o11-088.
9. Dimitireva T, ReshetovD, ZhernovkovV, et al. Modification of the method foranalysis of genome editing results using CRISPR/Cas9 system on preimplantation mouse embryos. Bulletin of Russian State Medical University. 2016;(3):15-20. doi: 10.24075/brsmu.2016-03-02.
10. Cooper CA, Maga EA, Murray JD. Production of human lactoferrin and lysozyme in the milk of transgenic dairy animals: past, present, and future. Transgenic Res. 2015;24(4):605-14. doi: 10.1007/s11248-015-9885-5.
11. Yang H, Wu Z. Genome editing of pigs for agriculture and biomedicine. Front Genet. 2018;(9):360. doi:10.3389/fgene.2018.00360.
12. Soldatov VO, Kubekina MV, Silaeva YY, et al. On the way from SARS-CoV-sensitive mice to murine COVID-19 model. Research Results in Pharmacology. 2020;6(2):1-7. doi: 10.3897/rrpharmacology.6.53633.
13. Silaeva YY, Kalmykov VA, Varlamova EA, et al. Genome editing as an approach to the study of in vivo transcription reprogramming. Dokl Biochem Biophys. 2020;490(1):43-6. doi: 10.1134/S1607672920010147.
14. Deykin A, Tikhonov M, KalmykovV, et al. Transcription termination sequences support the expression of transgene product secreted with milk. Transgenic Research. 2019;8(3-4):401-10. doi: 10.1007/s11248-019-00122-9.
15. Glanz VU, Orekhov AN, Deykin AV, et al. Human disease modelling techniques: current progress. Current molecular medicine. 2018;18(10):655-60. doi: 10.2174/1566524019666190206204357.
16. Egorova TV, Zotova ED, Reshetov DA, et al. CRISPR/Cas9-generated mouse model ofDuchenne muscular dystrophy recapitulating a newly identified large 430 kb deletion in the human DMD gene. Disease Models & Mechanisms. 2019;12(4):dmm037655. doi: 10.1242/dmm.037655.
17. Danilov KA, Vassilieva SG, Polikarpova AV, et al. In vitro assay for the efficacy assessment of AAV vectors expressing microdystrophin. Experimental Cell Research [Internet]. 2020 Jul 15 [cited2020Aug 1];392(2):112033. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/ article/abs/pii/S0014482720302603?via%3Dihub. doi: 10.1016/j.yexcr.2020.112033.
19. Silaeva YuYu, Kubekina MV, Bruter AV, et al. Gene editing CRISPR/Cas9 system for producing cows with hypoallergenic milk on the background of a beta-lactoglobulin gene knockout. In: E3S Web Conf [Internet]. 2020 Jun 22[cited 2020 Jul 1];176:01006. Available from: https://www.e3s-conferences.org/articles/e3sconf/abs/2020/36/e3sconfjdsisa2020_01006/e3sconfjdsisa2020_01006.html. doi: 10.1051/ e3sconf/202017601006.
21. Korobko IV, Georgiev PG, Skryabin KG, et al. GMOs in Russia: research, society and legislation. Acta Naturae. 2016;8(4):6-13. doi: 10.32607/20758251-2016-8-4-6-13.
22. Dejkin AV, Kuznetsova VN, Kirikovich YuK, et al. [GMO regulation: Belarus, BRICS, EU, USA]. Azimut nauchnyh issledovanij: ekonomika i upravlenie. 2019;8(4):141-5. Russian.
Резюме. Создание трансгенных организмов открывает ряд направлений их биомедицинского использования, к числу которых относится производство рекомбинантных белков человека для заместительной, патогенетической и этиологической терапии широкого спектра заболеваний. Перспективное биотехнологическое направление - геномное редактирование для создания сельскохозяйственных животных продуцентов гуманизированных белков. Системы, основанные на применении нуклеаз ZNF и TALEN, специфично связываются с целевой последовательностью геномной ДНК и создают в ней двухцепочечный разрыв. Восстановление поврежденного участка происходит посредством гомологичной или случайной репарации. К плюсам такой технологии геномного редактирования можно отнести высокую специфичность и низкий процент off-target взаимодействий, к минусам - высокую стоимость рекомбинантных нуклеаз ZNF и TALEN. Ввиду высокой специфичности и предсказуемости эффекта она, в целом, более применима для решения медицинских задач. Система CRISpR/Cas9, принцип работы которой основан на комплементарном взаимодействии sgРНК и целевого участка геномной ДНК, проще и дешевле. Ее применение более оправдано при научных исследованиях и в работе с животными. Сегодня существуют все теоретические предпосылки как в научной, так и в экономической сфере, указывающие на то, что геномное редактирование с использованием CRISPR/Cas9 приведет к значимым качественным изменениям в аграрном секторе. Улучшению ситуации в этой сфере способствует и постепенное смягчение регуляторной политики в отношении генно-модифицированных животных. Ключевые слова: CRISPR/Cas9, животные-продуценты, рекомбинантные белки, биотехнологии, биомедицина. Сведения об авторах: А. В. Дейкин, кандидат биологических наук, научный сотрудник; В. О. Солдатов, младший научный сотрудник; М. В. Корокин, доктор медицинских наук, доцент; С. В. Надеждин, кандидат биологических наук, научный сотрудник; Л. М. Даниленко, доктор фармацевтических наук, доцент; А. Л. Куликов, научный сотрудник; О. А. Пученкова, студент; М. В. Покровский, доктор медицинских наук, профессор, руководитель (e-mail: pokrovskii@bsu.edu.ru).
Для цитирования: Использование технологии CRISPR/Cas9 при создании животных-продуцентов рекомбинантных белков человека в проектах НОЦ мирового уровня «Инновационные решения в АПК» / А. В. Дейкин, В. О. Солдатов, М. В. Корокин и др. // Достижения науки и техники АПК. 2020. Т 34. № 9. С. 25-29. doi: 10.24411/0235-2451-2020-10905.
Abstract. The development oftransgenic organisms opens up a number of areas of their biomedical use, which include the production of recombinant human proteins for replacement, pathogenetic, and etiological treatment of a wide range of diseases. Genomic editing for breeding farm animals as producers of humanized proteins is a promising biotechnological direction. Systems based on the use of ZNF and TALEN nucleases specifically bind to the target genomic DNA sequence to create a double-stranded break in it. The damaged area is restored through homologous or random repair. The advantages of this genomic editing technology include high specificity and a low percentage of off-target interactions, and the disadvantages are the high cost of recombinant ZNF and TALEN nucleases. Due to the high specificity and predictability of the effect, it is generally more applicable to solving medical problems. The CRISPR/Cas9 system is based on the complementary interaction of sgRNA and the target genomic DNA region. Thus, it is simpler and cheaper. Its use is more justified in scientific research and in working with animals. Today, there are all scientific and economic reasons to think that genomic editing using CRISPR/Cas9 will lead to significant qualitative changes in the agricultural sector. The situation in this area is improved by the gradual easing of the regulatory policy on genetically modified animals. Keywords: CRISPR/Cas9; animal producers; recombinant proteins; biotechnology; biomedicine.
Author Details: A. V. Deikin, Cand. Sc. (Biol.), research fellow; V. O. Soldatov, junior research fellow; M. V Korokin, D. Sc. (Med.), assoc. prof.; S. V. Nadezhdin, Cand. Sc. (Biol.), research fellow; L. M. Danilenko, D. Sc. (Pharm.), assoc. prof.; A. L. Kulikov, research fellow; O. A. Puchenkova, student; M. V. Pokrovskii, D. Sc. (Med.), prof., director (e-mail: pokrovskii@bsu.edu.ru).
For citation: Deikin AV, Soldatov VO, Korokin MV, et al. [The use of the CRISPR/Cas9 technology in the development of animal producers of human recombinant proteins in the projects of the world-class research and educational centre "Innovative Solutions in the Agro-Industrial Complex"]. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2020;34(9):25-9. Russian. doi: 10.24411/0235-2451-2020-10905.
