CC BY
175
УДК 636.32/38.082.2 UDC636.32/38.082.2
ГЕНОМНОЕ РЕДАКТИРОВАНИЕ GENOME EDITING AS A PROMISING
КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЙ ПОДХОД К APPROACH TO CREATING
СОЗДАНИЮ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ GENETICALLY ENGINEERED FARM
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ANIMALS
ЖИВОТНЫХ
А.В.Дейкин, к.б.н. Deykin A.V., Cand. Biol. Sci.
ИБГ РАН IGB RAS
Ю.К. Кирикович Kirykovich Yu.K.
РУП «НПЦ НАН Беларуси по Животно- RUE "SPC NAS of Belarus on Animal водству» Husbandry"
Д.В. Коваленко, к.б.н. Kovalenko D.V., Cand. Biol. Sci.
ФГБНУ ВНИИОК Federal State Budgetary Scientific Insti-
tution «All-Russian Research Institute for Sheep and Goat Breeding» [email protected]
Генная инженерия сельскохозяй- Genetic engineering is an unalternative ственных животных является безаль- and highly effective way of creating of тернативным и высокоэффективным new breeds and types of farm animals. способом создания новых пород и Modern approaches allow to provide типов животных. Современные под- high specificity of changing in genome of ходы позволяют обеспечить высокую animals. It opens up new opportunities for специфичность внесения изменений в testing of hypothesis about the influence of геном животных, что открывает новые various genes on economically important возможности как для проверки гипотез traits and raises the level of work on о влиянии тех или иных генов на хо- recombinant proteins produced in animals, зяйственно значимые признаки, так и including the needs of the pharmaceutical выводит на новый уровень работы по industry. The article gives a brief созданию животных-продуцентов ре- overview of the development of genetic комбинантных белков, в т.ч. для нужд engineering of farm animals, and markes фармацевтической промышленности. the main directions of development of this В статье дан краткий обзор развития technology corresponding to agriculture in методов генной инженерии сельскохо- Russia. зяйственных животных и обозначены основные направления развития этой технологии применительно к сельскому хозяйству России.
Ключевые слова: генная инженерия, Key words: genetic engineering, трансгенные животные, геномное ре- transgenic animals, genome editing, дактирование, CRISPR/Cas9 CRISPR / Cas9
Ключевым направлением селекции сельскохозяйственных животных является использование методов генной инженерии для решения таких задач, как: получение животных с желаемыми признаками за счёт выключения - нокаута или внесения дополнительного - нокин гена, связанного с полезным признаком; получение животных-продуцентов ценных белков, в том числе для фармацевтической промышленности; изменение генома животных с целью модификации окружающей среды [1]. Методы генной инженерии значительно совершенствовались одновременно с развитием молекулярной биологии и биохимии [2, 3]. Первые трансгенные животные содержали вставки чужеродных генов под контролем высокоэффективных вирусных промоторов, затем для регулирования экспрессии чужеродного гена стали использовать более специфичные промоторы и до-
полнительные регуляторные элементы, например, инсуляторы. Всё это позволяло обеспечить высокий уровень экспрессии чужеродного гена, но открытым оставался вопрос сайтспецифичности вставки и выключения - нокаута гена [4, 5]. Если не рассматривать в этом смысле как метод химический или радиационный мутагенез, единственным инструментом в руках исследователя был метод гомологичной рекомбинации, который теоретически позволял интегрировать протяжённые последовательности в нужное место генома. Критическим ограничением этой технологии была крайне низкая эффективность такого встраивания. Для лабораторных животных проблема была решена с получением эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), которые после инъекции в полость бластоци-сты становились частью зародышевых листков и включались в состав будущего организма. После манипуляций с геномом ЭСК стало возможно резко повысить эффективность работы по получению лабораторных животных - мышей с заданными изменениями в геноме. Достигалось это за счёт переноса самой малоэффективной стадии на уровень работы с культурой клеток, где возможно отслеживать редкие события. К сожалению, в отношении сельскохозяйственных животных ЭСК получены не были, и случайное встраивание конструкции в геном зигот или сперматозоидов долго оставалось единственно доступным способом создания трансгенных сельскохозяйственных животных. На этом фоне большое развитие получили методы переноса ядер соматических или стволовых клеток в зиготу, которая после стимуляции начинала делиться, запуская эмбриогенез [6, 7, 8]. В данном случае низкоэффективная стадия внесения направленных изменений в геном проводилась на уровне культуры соматических клеток, и для клонирования выбиралось ядро с заведомо нужным генотипом.
Параллельно развивались технологии геномного редактирования: часть из них предполагала встраивание конструкции с помощью сайтспецифичных ферментов - интеграз, но сайт для встраивания опять же оказывался в геноме в результате случайного встраивания; другая технология предполагала использование многокомпонентных нуклеаз (TAL (transcriptionactivator-like) effectors - TALE), узнающих нужную последовательность посредством комбинации доменов «цинковые пальцы», сборка таких мультидоменных комплексов оказалась трудоёмкой и сложной задачей [9]. Все эти подходы не позволяли значительно повысить эффективность технологии без использования культуральной работы и клонирования [10]. Настоящим прорывом стало открытие кластера генов про-тивофагового иммунитета у бактерий - CRISPR, в составе этого кластера обнаружен ряд РНК - зависимых нуклеаз, специфичность которых обеспечивается за счёт короткой последовательности РНК, узнающей целевой участок ДНК в геноме бактериофага [11]. Ну-клеаза из кластера CRISPR - Cas9 стала одним из самых известных ферментов последнего десятилетия. Ей посвящены специальные выпуски ведущих научных журналов. В прикладном плане появление высокоэффективной технологии редактирования генома означает снижение временных и производственных затрат на создание животных с измененным геномом. Технология позволяет не только получать животных с выключенными генами за счёт того, что при репарации разрывов, вносимых Cas9, зачастую происходит сдвиг рамки считывания, но и трансгенных - за счёт значительного повышения вероятности гомологичной рекомбинации и встраивания чужеродной конструкции при наличии двухцепочечного разрыва в месте встраивания [12].
Новые технологии позволяют сделать рывок в развитии биотехнологии в России. Сегодня необходимо воспользоваться появившейся возможностью на волне технологического прорыва и реализовывать амбициозные идеи, к которым раньше невозможно было подступиться ввиду объективного технологического отставания. Анализ результатов геномных проектов, соотнесение данных по функциям генов между хорошо изученными и плохо охарактеризованными видами сельскохозяйственных животных, масштабное применение технологии геномного редактирования на основе Cas9 - вот три ключа
к успеху как в научно-техническом развитии, так и в вопросе получения новых ценных пород животных в России.
Список литературы:
1. Айбазов А.-М.М. Применение лапароскопии при внутриматочном осеменении и трансплантации эмбрионов у овец//Вестник ветеринарии. 1998. № 5. С. 51.
2. Айбазов А.-М.М. Ягнята-трансплантаты: рост развитие и репродуктивная функция //Вестник ветеринарии. 2000. № 15. С. 41.
3. Айбазов М.М., Аксенова П.В. Возможность и перспективы получения первичных трансгенных животных - продуцентов белков человека //Овцы, козы, шерстяное дело. 2012. № 3. С. 33.
4. Селионова М.И., Айбазов А.М.М. Геномные технологии в селекции сельскохозяйственных животных / //Сборник научных трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства. 2014. Т. 1. № 7 (1). С. 140-145.
5. Селионова М.И., Айбазов М.М., Мамонтова Т.В. Перспективы использования геномных технологий в селекции овец (аналитический обзор) //Сборник научных трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства. 2014. Т. 3. № 7. С. 107-112.
6. Murray J.D., Maga E.A. Genetically engineered livestock for agriculture: a generation after the first transgenic animal research conference. Transgenic Res. 2016 Jan 28. [Epub ahead of print].
7. Niemann H., Kues W., Carnwath J.W. Transgenic farm animals: present and future Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 2005, 24 (1), 285-298.
8. Robl J.M, Wang Z., Kasinathan P., Kuroiwa Y. Transgenic animal production and animal biotechnology. Theriogenology. 2007 Jan 1;67(1):127-33. Epub 2006 Oct 27.
9. Maksimenko O.G., Deykin A.V., Khodarovich Y.M., Georgiev P.G. Use of transgenic animals in biotechnology: prospects and problems. ActaNaturae. 2013 Jan;5(1):33-46.
10. Goldman I.L., Georgieva S.G., Gurskiy Y.G., Krasnov A.N., Deykin A.V., Popov A.N., Ermolkevich T.G., Budzevich A.I., Chernousov A.D., Sadchikova E.R. Production of human lactoferrin in animal milk.Biochem Cell Biol. 2012 Jun;90(3):513-9. doi: 10.1139/o11-088. Epub 2012 Feb 23.
11. Liang P., Xu Y., Zhang X., Ding C., Huang R., Zhang Z., Lv J., Xie X., Chen Y., Li Y., Sun Y., Bai Y., Songyang Z., Ma W., Zhou C., Huang J. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes.Protein Cell. 2015 May;6(5):363-72. doi: 10.1007/s13238-015-0153-5. Epub 2015 Apr 18.
12. Luo Y., Wang Y., Liu J., Cui C., Wu Y., Lan H., Chen Q., Liu X., Quan F., Guo Z., Zhang Y.. Generation of TALE nickase-mediated gene-targeted cows expressing human serum albumin in mammary glands. Sci Rep. 2016 Feb 8;6:20657. doi: 10.1038/srep20657.
13. Hwang I.S., Kwon D.J., Oh K.B., Ock S.A., Chung H.J., Cho I.C., Lee J.W., Im G.S., Hwang S. Production of Cloned Korean Native Pig by Somatic Cell Nuclear Transfer. DevReprod. 2015 Jun;19(2):79-84. doi: 10.12717/DR.2015.19.2.079.
14. Boch J. TALEs of genome targeting. Nat Biotechnol. 2011 Feb;29(2):135-6. doi: 10.1038/nbt.1767.
15. Wu H, Wang Y, Zhang Y, Yang M, Lv J, Liu J, Zhang Y. TALE nickase-mediated SP110 knockin endows cattle with increased resistance to tuberculosis Proc Natl AcadSci U S A. 2015 Mar 31;112(13):E1530-9. doi: 10.1073/pnas.1421587112. Epub 2015 Mar 2.
16. Makarova K.S., Haft D.H., Barrangou R., Brouns S.J., Charpentier E., Horvath P., Moineau S., Mojica F.J., Wolf Y.I., Yakunin A.F., van der Oost J., Koonin E.V. Evolution and classification of the CRISPR-Cassystems.Nat Rev Microbiol. 2011 Jun;9(6):467-77. doi: 10.1038/nrmicro2577. Epub 2011 May 9.
17. Cooper C.A., Maga E.A., Murray J.D. Production of human lactoferrin and lysozyme in the milk of transgenic dairy animals: past, present, and future. Transgenic Res. 2015 Aug;24(4):605-14. doi: 10.1007/s11248-015-9885-5. Epub 2015 Jun 10.
УДК 635.63:575.222.7 СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИБРИДОВ ОГУРЦА В УСЛОВИЯХ ЗАЩИЩЕННОГО ГРУНТА
UDC 635.63:575.222.7 COMPARATIVE CHARACTERISTICS OF CUCUMBER HYBRIDS IN THE CONDI-TIONS OF PROTECTED GROUND
Есаулко Н.А., кандидат с.-х. наук ФГ- Esaulko N.A., Cand. Agr. Sci. БОУ ВО Ставропольский ГАУ SSAU
Огурец - ведущая культура защищенного грунта, как по площадям, так и по объему производства. Оптимизация всех условий роста и развития огурца позволяет получать стабильно высокие урожаи, что особенно актуально для по-вышения рентабельности производства. Важное значение в получении высоких урожаев огурца имеет правильный подбор гибридов. Выявление наиболее продуктивных
A cucumber is the leading culture of the pro-tected ground both in area and in terms of production.
An optimization of the growth conditions and development of cucumber gives a chance to produce consistently high yields, which is especially important to improve the profitability of production . The great importance of cucumber high yields obtaining has the correct selection of hybrids. The identification of the most
