CC BY
24©Коллектив авторов, 2019 Вопросы онкологии, 2019. том 65, № 3
УДК 618.19-006
К.А. Загороднев1,3, E.H. Суспицын1,3 , А.П. Соколенко1,3, А.А. Романько13, М.О. Анисимова1,3, и.В. Бизин1, Е.Ш. Кулигина1, Е.н. имянитов1,234
использование таргетной мультигенной панели для поиска генетических детерминант наследственного рака молочной железы
у российских пациенток
1НМиЦ онкологии им. Н.Н. петрова Минздрава россии, санкт-петербург, 2ФгБОу ВО «северо-западный государственный медицинский университет им. и.и. Мечникова»
Минздрава россии, санкт-петербург, 3ФгБОу ВО «санкт-петербургский государственный педиатрический медицинский университет»
Минздрава россии, санкт-петербург, 4ФгБОу ВО «санкт-петербургский государственный университет», санкт-петербург
понимание молекулярно-генетического патогенеза наследственного ракового синдрома чрезвычайно важно для разработки персональных терапевтических подходов и для увеличения эффективности превентивных мер. на данный момент оптимальным решением для диагностики каузативных мутаций наследственного рака молочной железы (рМЖ) является тестирование тар-гетных мультигенных панелей с помощью высокопроизводительного секвенирования (NGS). Авторы сформировали NGS-панель из 31 гена, основываясь на их потенциальной причастности к формированию онкологической предрасположенности и встречаемости патогенных аллелей в российской популяции. В эту группу вошли «канонические» гены наследственного рМЖ (BRCA1, BRCA2, BRIP1, PALB2, TP53, ATM, NBN), «новые» гены, в которых относительно недавно были идентифицированы каузативные мутации (BLM, FANCD2, POLE, FANCM, RAD51C, MRE11A, RECQL), а также некоторые другие гены, вовлеченные в репарацию Днк, апоптоз и поддержание стабильности генома. Был выполнен скрининг мутаций у 94 пациенток с предположительно наследственным рМЖ неизвестной генетической этиологии, отбор пациенток был произведен согласно критериям соответствия наследственным опухолевым синдромам. применение таргетной панели позволило с высокой долей уверенности назвать генетическую детерминанту заболевания у 21/94 (22,3%) больных, причем у 19 пациенток причиной заболевания были редкие мутации BRCA1 и BRCA2, не относящиеся к российским «фаундер» мутациям, а в оставшихся двух случаях были
нарушены функции генов ATM (p.Glu73fs) и POLE (p.Leu1171fs). Данное наблюдение имеет большую клиническую значимость, поскольку является основанием для расширения диагностической панели, нацеленной на мониторинг лиц с повышенным онкологическим риском, и внедрения в клиническую диагностику мультигенного таргетно-го секвенирования.
ключевые слова: наследственный рак молочной железы, таргетная мультигенная панель
Введение
10-18% всех случаев рака молочной железы (рмЖ) и яичников (рЯ) развиваются в результате наследственного моногенного дефекта [9]. Самые «знаменитые» и хорошо изученные гены наследственного рмЖ и рЯ — BRCA1 и BRCA2 — являются причиной заболевания в 17-25% семейных случаев [14, 23]. Ещё 4-6% наследственной составляющей приходится на долю редких «неканонических» раковых мутаций в генах репарации ДнК с разной степенью пенетрантности — ATM, TP53, PALB2, PTEN, STK11, CHEK2, BARD1, BRIP1, CDH1, BLM, NF1, RAD51C и др. [11, 19]. Успехи широкомасштабных исследований генетических ассоциаций (GWAS) позволили добавить в список около сотни низкопенетрантных предрасполагающих вариантов, совокупный вклад которых объясняет еще 8-10% наследственного риска рмЖ [21, 24]. таким образом, следует признать, что, несмотря на использование высокопроизводительного секвенирования (NGS), полногеномного скрининга и вовлечение в эксперименты огромных когорт пациентов, генов, аналогичных BRCA1/2
по клинической значимости, обнаружить пока не удалось, и у большей доли наследственных случаев РМЖ генетические детерминанты повышенного риска так и остаются неизвестными. Тем не менее, понимание генетической природы наследственного ракового синдрома чрезвычайно важно для разработки персональных терапевтических подходов и для увеличения эффективности превентивных мер, поэтому исследователи не оставляют попыток выявить каузативную наследственную мутацию в каждом конкретном, предположительно наследственном случае, используя современные подходы и ресурсы. Основными клиническими признаками наследственной природы РМЖ и РЯ считают: 1) раннее начало заболевания (<45 лет), 2) билатеральный характер поражения, 3) семейный анамнез, отягощенный раком молочной железы и яичников у родственников первого или второго порядка, 5) трижды-негативный рецепторный статус РМЖ 4) рак молочной железы у мужчин [1].
Долгое время внимание молекулярных диагностов было сконцентрировано только на поиске мутаций в высокопенетрантных генах BRCA1 и BRCA2 [23]. Однако в последние годы, в связи с открытием ряда новых «раковых» генов и уде-
шевлением высокопроизводительных методик, концепция генетического тестирования предрасположенности к наследственному раку молочной железы претерпела изменения. В настоящее время оптимальным решением является высокопроизводительное секвенирование так называемых «таргетных мультигенных панелей», которые, по мнению разных исследовательских групп, могут включать от 6 до 35 локусов (Таблица 1) [9, 32, 34]. Сегодня не существует единого мнения относительно состава таргетных диагностических панелей и алгоритма интерпретации обнаруженных вариантов. Так, согласно рекомендациям Национальной онкологической сети США (National Comprehensive Cancer Network) [22] от 30 июля 2018 года, BRCAl/2-негативным пациентам с отягощенным анамнезом и соответствующими диагностическими критериями наследственного рака молочной железы рекомендовано мульти-генное тестирование, включающее следующие 20 генов: ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CDH1, CHEK2, MSH2, MLH1, MSH6, PMS2, EPCAM, NBN, NF1, PALB2, PTEN, RAD51C, RAD51D, STK11, TP53. Существуют коммерческие панели для определения мутаций в генах, ассоциированных с раком молочной железы (например, Breast-next, BRCAplus), которые, по
Таблица 1.
Мультигенные панели для таргентого секвенирования случаев наследственных РМЖ с неизвестной генетической детерминантой
Genes Число генов в панели Число пациентов Число «объясненных» случаев/ число патогенных мутаций Ссылка
BRCA1, BRCA2, CDH1, PTEN, STK11, TP53 («BRCAplus») 6 3000 (США) 172 пациентки (5,7%) с инактивирую-щими мутациями + 228 (7,6%) с ал-лельными вариантами неоднозначного значения. Chong HK et al., 2014 [3]
ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CDH1, CHEK2, EPCAM, MLH1, MSH2, MSH6, NBN, PALB2, PMS2, PTEN, RAD51C, RAD51D, STK11, and TP53 («Color panel») 19 300 (США) 26 пациенток (9%) / 28 мутаций Crawford et al., 2017 [4]
ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CDH1, CHEK2, MRE11, MUTYH, NBN, NF1, PALB2, PTEN, RAD50, RAD51C, RAD51D, TP53 («BreastNext») 17 874 (США) 64 пациентки (7,3%) с инактивиру-ющими мутациями + 173 (19,8%) с аллельными вариантами неоднозначного значения. LaDuca H et al., 2014 [18]
TP53, CDH1, PTEN, ATM, CHEK2, STK11, RAD51C, PALB2, BARD1, BRIP1, NBN, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, EPCAM, RAD51D, APC, MUTYH, CDKN2A, SMAD4, CDK4, BMPR1A, BRCA1, BRCA2 25 1781 (США) 241 пациентка (13.5%) / 246 мутаций Tung et al., 2016 [35]
ATM, CDH1, CHEK2, NBN, PALB2, RAD51C, RAD51D, TP53 8 5589 (Германия) 339 пациенток (6,1%) / 147 транкирующих мутаций Hauke et al., 2018 [11]
BRCA1, BRCA2, ATM, CDH1, CHEK2, NBN, PALB2, RAD51C, RAD51D,TP53 10 229 трижды-негативных РМЖ (Германия) 57 пациенток (24,9%)/ 57 мутаций Hoyer et al., 2018 [12]
BRCA1, BRCA2, PALB2, BARD1, BRIP1, RAD51C, RAD51D, RAD50, NBN, MRE11A, ATM, CHEK2, TP53, PTEN, APC, BLM, BMPR1A, CDH1, CDK4, CDKN2A, EPCAM, MEN1, MLH1, MSH2, MSH6, MUTYH, PMS2, POLE, PRSS1, RET, SLX4, SMAD4, STK11, VLH, WT1 35 о2 Р0 CD ) 9 пациенток (7,5%)/ 10 мутаций Park et al., 2018 [26]
сути, представляют собой компромисс между эффективностью выявления каузативных мутаций и стоимостью выполнения анализа. Входным порогом для включения определённого гена в панель обычно является двукратное повышение риска развития рака молочной железы у носителей мутации, что соответствует характеристикам умеренной пенетрантности [20]. Для сравнения, патогенные мутации в генах BRCA1/2 связаны, в среднем, с пятикратным повышением риска развития рака молочной железы [9, 17]. Кроме BRCA1 и BRCA2, наиболее часто обнаруживаются наследственные повреждения в генах CHEK2 (2.5%), ATM (1.5%), PALB2 (1.2%), частота остальных мутаций не превышает, как правило, 0.3% [11, 19]. Примерно 3% пациенток являются носительницами одновременно двух патогенных мутаций [4, 18].
Эффективность панели выражается в количестве «объясненных» случаев рмЖ и обнаруженных патогенных мутаций; этот показатель варьирует от 7% до 25% в зависимости от количества проанализированных генов, критериев отбора пациенток, биоинформатической обработки и строгости интерпретации функциональных последствий альтернативных вариантов [7, 36]. так, например, применение 10-ген-ной панели у неселектированных пациенток с трижды-негативным рМЖ позволяет определить каузативную мутацию в 25% случаев, и это, пожалуй, один из наилучших результатов (табл. 1) [12].
расширение панели за счет включения большего числа предрасполагающих генов, к сожалению, не приводит к возрастанию её эффективности, так как мутации в новых локусах, как правило, носят «приватный» характер, т.е. встречаются исключительно редко и, таким образом, не представляют большой клинической ценности. Кроме того, не существуют клинических рекомендаций по ведению пациенток-носительниц «неканонических» раковых мутаций — на сегодняшний день они имеют ценность только в плане оценки онкологического риска у родственников [10, 29]. Тем не менее, следует отметить, что разным популяциям присущи специфические черты, отражающие генетическую архитектуру наследственного риска рМЖ. Так, популяция Северо-Запада россии оказалась гомогенной в плане генетического груза, для нее характерен выраженный эффект «основателя» с преобладанием среди семейных рМЖ ограниченного набора рекуррентных патогенных мутаций [2, 31]. Это обстоятельство благоприятно для упрощения и удешевления мониторинга и молекулярной диагностики лиц с высоким онкологическим риском рмЖ и рЯ, поскольку позволяет на прак-
тике ограничиться прицельным анализом всего нескольких позиций (BRCA1 5382insC; BRCA1 4153delA; BRCA1 185delAG; BRCA2 6174delT; CHEK2 1100delC; CHEK2 IVS2+1G>A; NBS1 657del50, BLM c.1642C>T).
Целью данного исследования было изучение структуры генетической предрасположенности больных наследственным РМЖ, оставшейся за пределами стандартного диагностического теста, рутинно использующегося в лаборатории молекулярной онкологии НМИЦ онкологии им. H.H. Петрова (Санкт-Петербург). С помощью таргетного секвенирования была проанализирована полная кодирующая последовательность 33 генов, известных своим значительным онкологическим потенциалом в отношении РМЖ, у 94 российских пациенток с клиническими признаками наследственного ракового синдрома.
Материалы и методы
Пациентки
В исследование были включены 94 пациентки с РМЖ, проходившие лечение в НМИЦ онкологии им H.H. Петрова (Санкт-Петербург) с 2015 по 2017 гг. Возраст больных варьировал от 25 лет до 71 года (медиана — 41 год). У пациенток были зафиксированы клинические признаки наследственного ракового синдрома: первично множественный характер поражения (43 (45.7%)), ранний возраст манифестации (<45 лет; 59 (62.8%) и/ или наличие РМЖ или РЯ у кровных родственниц (42 (44.7%). У 40 (42.6%) больных было отмечено сочетание двух, а у 9 (9.6%) - всех трех клинических признаков наследственного РМЖ. Все участницы были предварительно протестированы на предмет отсутствия у них характерных «славянских» фаундер-мутаций BRCA1 5382insC; BRCA1 4153delA; BRCA1 185delAG; BRCA2 6174delT; CHEK2 1100delC; CHEK2 IVS2+1G>A; NBS1 657del50, BLM c.1642C>T. Материалом для секвенирования служили образцы хромосомальной ДНК, полученные из клеток периферической крови.
таргетное мультигенное секвенирование
Авторы сформировали NGS-панель из 31 гена, основываясь на их потенциальной причастности к формированию онкологической предрасположенности и встречаемости патогенных вариантов в российской популяции. В эту группу вошли «канонические» гены наследственного РМЖ (BRCA1, BRCA2, BRIP1, PALB2, TP53, ATM, NBN) [Hauke et al., 2018], «новые» гены, в которых относительно недавно были идентифицированы каузативные мутации (BLM, FANCD2, POLE, FANСM, RAD51C, MRE11A, RECQL [5, 15, 30, 33], а также другие гены, вовлеченные в репарацию ДНК, апоптоз и поддержание стабильности генома (FANCA, FANCB, FANCC, FANCE, FANCF, FANCG, FANCI, FANCL, ATRIP, CASP10, CASP8, CHD7, LCK, PIK3CD, PIK3R1, PMS2, TERC, TERT).
Для создания библиотек использовали набор SeqCapEZ System (Roche); секвенирование осуществлялось на приборе MiSeq (Illumina, USA). Анализ целевого покрытия оценивали с помощью инструмента GATK DepthOfCoverage; показатели средней глубины покрытия
по всей совокупности таргетных участков (98.8%), а также среднего покрытия по конкретным регионам (70-90х) были признаны удовлетворительными. В дальнейшем учитывали варианты с высоким показателем качества (PHRED > 50). Биоинформатический процессинг и аннотирование вариантов выполняли с помощью последовательного применения инструментов MiSeq Reporter, GATK v.2.7 и Picard v.1.86, Annovar. При отборе потенциально патогенных вариантов учитывались следующие параметры:
Популяционная частота варианта менее 1% по данным ресурса Exome Aggregation Consortium (ExAC) [http://exac.broadinstitute.org]. В расчет принимали также сведения о встречаемости варианта в подгруппах онкологических больных (TCGA) и здоровых индивидуумов (nonTCGA), которые позволяли рассчитать величину риска (odds ratio, OR), ассоциированного с носительством аллеля и его значимость (p-value). Превышение более чем в два раза частоты аллеля среди пациентов рассматривали как аргумент в пользу его потенциальной он-когенной роли.
тип мутации: транкирующие мутации почти всегда являются патогенными; среди миссенс-мутаций выбирали варианты с высокими показателями патогенности CADD-score > 25 [16; https://cadd.gs.washington.edu/]
Наличие сведений о патогенности в литературе или базах данных PubMed, «BRCA Mutation Database» (http:// arup.utah.edu/database/BRCA/), ClinVar [https://www.ncbi. nlm.nih.gov/clinvar/], LOVD [https://databases.lovd.nl/ shared/genes/]
В качестве дополнительного калькулятора патогенности был использован биоинформатический алгоритм, рекомендованный ACMG (American College of Medical Genetics), согласно которому все варианты подразделяются на «патогенные/вероятно-патогенные», «нейтральные» и «варианты с неизвестным значением, VUS» [28]. Обнаруженные предположительно патогенные мутации вручную анализирова-
ли в геномном браузере ЮУ (Шр://:зо1^аге.Ьгоа&ш1йи1е. org/software/igv/], а затем подтверждали с помощью секве-нирования по Сэнгеру.
Секвенирование мультигенной панели позволяет одновременно включить в исследование значительно большее количество образцов ДНК по сравнению с полноэкзомным секвенированием, и, таким образом, уже на первом этапе становится возможным приблизительно оценить частоту кандидатных мутаций среди пациентов.
Результаты и обсуждение
Анализ 94 пациенток с помощью мультигенной панели выявил 264 альтернативных несинонимичных варианта. Среди них обнаружилось 127 мутаций с низкой популяционной частотой (MAF < 1%). Эта группа включала 28 транкирующих мутаций (нонсенсы, сдвиги рамки считывания, нарушения сплайс-сайтов) и 99 аминокислотных замен или других структурных вариаций, из которых 23 имели высокие показатели патогенности CADD > 25. Окончательный список обнаруженных потенциально патогенных мутаций, за вычетом ошибок секвенирования, составил 39 вариантов - 21 транкирующая мутация и 18 аминокислотных замен (таблица 1, рисунок 1).
Хотя бы один кандидатный вариант был обнаружен у 41/94 (43,6%) исследованных пациенток (Рисунок 2). В 19/94 (20.2%) случаях наиболее вероятной генетической детерминантой заболевания служили редкие белок-инактивирующие
Число обнаруженных альтернативных вариантов : 264
Рис. 1. Результаты таргетного мультигенного секвенирования BRCA-негативных пациенток с РМЖ «высокого риска»: этапы селекции кандидатных вариантов. Fs - сдвиг рамки считывания, stop - нонсенс мутация, splice - мутация сайта сплайсинга, MAF - частота в популяции минорного аллеля (по данным базы данных ExAC), SNP - однонуклеотидный полиморфизм; CADD-score - показатель патогенности, рассчитанный in silico
94 пациентки с признаками наследственного РМЖ
N = 21
обнаружены каузативные мутации
N = 20
обнаружены предположительно патогенные варианты (VUS)
N = 53
генетическая детерминанта не нацдена
рис. 2. Каузативные онкогенные мутации и кандидатные предположительно патогенные варианты, обнаруженные в выборке пациенток РМЖ «высокого риска». fs - сдвиг рамки считывания; VUS - вариант с неустановленным функциональным значением
варианты в генах BRCA1 и BRCA2, не относящиеся к числу славянских фаундер-мутаций.
В гене ATM, хорошо известном в роли онко-супрессора, было обнаружено две кандидатные каузативные мутации - сдвиг рамки считывания p.Glu73fs и аминокислотная заменаp.Val1468Phe (CADD 30). Две потенциально патогенные мутации были выявлены в гене POLE — ключевом элементе системы репарации ДНК — POLE p.Leu1171fs иp.Tyr1046Phe (CADD 26). Интересной находкой стали предположительно патогенные миссенс-мутации в гене ATRIP, ранее не упоминавшимся в связи с онкологическим риском — p.Arg702Gln (CADD 28.2) и p.Ala433Val (CADD 29.3); одна из этих мутаций оказалась рекуррентной.
11 (11,7%) пациенток несли наследственные мутации с неподтвержденным функциональным значением (VUS) в партнерах BRCA1 по системе репарации ДНК — генах анемии Фанко-ни (FANCC, FANCD2, FANCG, FANCI, FANCL, FANCB).
Таким образом, применение таргетной панели позволило с высокой долей уверенности назвать каузативные мутации в 21/94 (22,3%) больных предположительно наследственным РМЖ с неизвестной ранее генетической детерминан-той, причем у 19 пациенток причиной заболе-
вания были редкие мутации BRCA1 и BRCA2, а в оставшихся двух случаях были нарушены функции генов ATM и POLE. Что касается обнаруженных нами 17 миссенс-мутации в генах ERCC2, BRCA2, BRIP1, NBN, BLM, LCK, ATRIP, ATM, POLE, RECQL, FANCG, FANCC, FANCB, FANCD2, то в пользу мнения об их предрасполагающей онкогенной роли говорят высокие расчетные показатели патогенности (CADD score 25-34), низкая частота в популяции и известные онкосупрессорные функции затронутых генов, однако онкогенный потенциал и клиническую значимость этих вариантов еще предстоит подтвердить с помощью молекулярно-эпидемиоло-гического или функционального подходов.
Доля «объяснённых» нами случаев рМЖ значительно превышает соответствующие цифры, опубликованные другими исследовательскими группами (таблица 1). так, по данным Myriad Genetic Laboratories [27], применение 25-генной панели у 252.223 больных с признаками семейной агрегации рмЖ и рЯ выявило патогенные мутации только в 9.8% случаев. По-видимому, причина необычно высокой эффективности применения нашей панели была не в ее расширенном составе (31 локус), а в особенностях селекции пациентов для тестирования. Дело в том, что в данное исследование
Таблица 2. Список предположительно патогенных мутаций,обнаруженных c помощью таргетного мультигенного секвенирования у 94 пациенток с признаками наследственного РМЖ, негативных по «славянским» фаундер-мутациям
BRCA1/2, CHEK2, BLM, NBN
Тип мутации CADD score Ген Описание Мутация R>A Rs dbSNP ExAC Normal, % ExAC Cancer, % OR p-value Носители (n)
frameshift 34 ATM ATM serine/threonine kinase p.Glu73fs CAG>C 762089971 0,001 0,000 0,0 1 1
missense 29,9 ATM ATM serine/threonine kinase p.Val1468Phe G>T 1
missense 29,9 ATRIP ATR interacting protein p.Arg391Gln G>A 142899473 0,081 0,047 0,6 0,206 1
missense 29,6 ATRIP ATR interacting protein p.Ala433Val C>T 2
missense 25 BLM Bloom syndrome, RecQ helicase-like p.Asp64Val A>T 140382474 0,029 0,053 1,9 0,136 2
missense 27,1 BLM Bloom syndrome, RecQ helicase-like p.Ala703Val C>T 1
frameshift 35 BRCA1 breast cancer 1, early onset p.Arg1747fs TTTTC>T 80357975 0,001 0,000 0,0 1
splice_site 26,8 BRCA1 breast cancer 1, early onset na C>A 80358094 1
stop_ gained 37 BRCA1 breast cancer 1, early onset p.Tyr1584* G>C 80357433 1
frameshift 35 BRCA1 breast cancer 1, early onset p.Leu1205fs TAGAC>T 80357868_ 0.001 0,000 0,0 1 1
frameshift 12,26 BRCA1 breast cancer 1, early onset p.Lys654fs CT>C 80357522 0,001 1
frameshift 29,6 BRCA1 breast cancer 1, early onset p.Arg504fs CG>C 80357908 0,001 1
frameshift 29,1 BRCA1 breast cancer 1, early onset p.Leu502fs CTTTAA>C 80357888 0,002 0,000 0,0 1 1
frameshift 33 BRCA1 breast cancer 1, early onset p.Ser282fs ATGAG>A 80357919 1
frameshift BRCA2 breast cancer 2, early onset p.Lys157fs A>AT 1
frameshift 28 BRCA2 breast cancer 2, early onset p.Ala938fs TAAAC>T 80359351 0,002 1
stop_ gained 35 BRCA2 breast cancer 2, early onset p.Gln2100* C>T 1
frameshift 36 BRCA2 breast cancer 2, early onset p.Pro2334fs G>GT 754611265 0,001 1
missense 31 BRCA2 breast cancer 2, early onset p.Thr2515Ile C>T 28897744 0,066 0,142 2,2 0,003 1
frameshift BRCA2 breast cancer 2, early onset p.Ile2840fs CA>C 1
stop_ gained 37 BRCA2 breast cancer 2, early onset p.Tyr2905* T>A 1
frameshift 35 BRCA2 breast cancer 2, early onset p.His3010fs AT>A 80359742 1
splice_site 23,3 BRCA2 breast cancer 2, early onset na A>G 81002862 0,004 0,000 0,0 1 1
stop_ gained 47 BRCA2 breast cancer 2, early onset p.Lys3104* A>T 1
frameshift BRCA2 breast cancer 2, early onset p.Thr3137fs CTTACT>C 1
missense 27,6 BRIP1 BRCA1 interacting protein C-terminal helicase 1 p.Arg173Cys G>A 4988345 0,253 0,388 1,5 0,004
missense 33 ERCC2 excision repair cross-complementation group 2 p.Arg592His C>T 147224585 0,029 0,061 2,1 0,085 1
missense 32 FANCA Fanconi anemia, complementation group A p.Arg1409Trp G>A 139478274 0,019 0,026 1,4 0,532 1
missense 25,4 FANCC Fanconi anemia, complementation group C p.Asp195Val T>A 1800365 0,281 0,499 1,8 0
missense 34 FANCD2 Fanconi anemia, complementation group D2 p.Pro279Leu C>T 1
missense 34 FANCG Fanconi anemia, complementation group G p.Arg563Gln C>T 1
frameshift 35 FANCL Fanconi anemia, complementation group L p.Thr372fs G>GTAAT 759217526 0,272 0,406 1,5 0,008
missense 25,2 FANCM Fanconi anemia, complementation group M p.Leu1136Ser T>C 770989272 0,002 1
missense 27,7 LCK LCK proto-oncogene, Src family tyrosine kinase p.Val272Met G>A 1
missense 26,6 NBN nibrin p.Arg215Trp G>A 34767364 0,298 0,273 0,9 0,687
frameshift POLE polymerase (DNA directed), epsilon, catalytic subunit p.Leu1171fs G>GT 1
missense 32 POLE polymerase (DNA directed), epsilon, catalytic subunit p.Leu1110Ile G>T 1
missense 26 POLE polymerase (DNA directed), epsilon, catalytic subunit p.Tyr1046Phe T>A 1
missense 29,4 RECQL4 RecQ protein-like 4 p.Gly809Arg C>T 769977498 0,016 0,037 2,4 0,159 1
вошли пациентки с максимально выраженной предрасположенностью к РМЖ. Действительно, 43/93 (46%) исследованной нами выборки составили случаи билатеральных РМЖ и первично-множественных раков (РМЖ + РЯ), из которых 70% (30/43) имели к тому же необычно молодой возраст на момент диагноза первой опухоли и/ или случаи РМЖ среди кровных родственниц. В группе первично-множественных раков процент выявления патогенных мутаций был достоверно выше, чем в группе монолатеральных РМЖ с семейной историей или ранней манифестацией [14/43 (32.6%) vs. 6/51 (11.8%), рХ2 = 0.014]. Вероятно, такая выборка пациенток оказалась особенно генетически обогащенной в плане «раковых» мутаций.
Существенно, что большинство обнаруженных мутаций оказались редкими транкирующи-ми вариантами генов ВЯСЛ1 и ВЯСЛ2, которые не были ранее включены в алгоритмы стандартной диагностики. У 8 пациенток с дефектами гена ВЯСЛ1 был известен рецепторный статус опухолей, и 6 из них оказались трижды-негативными, что является чертой, характерной для ВЯСЛ1 -опосредованного патогенеза [25]. У носительниц мутаций ВЯСЛ2 все 7 информативных карцином были эстроген-позитивными. Одна из обнаруженных редких мутаций, ВЯСЛ1 с.196Ме1Л, уже описана нами ранее [13], она также встречается в Италии, Польше, Канаде [6, 8]; остальные мутации обнаружены нами в российской популяции впервые. Особый интерес вызвала повторяющаяся в данной выборке тран-кирующая мутация в гене ВЯСЛ1 p.Лrg1747fs, найденная в двух индексных случаях.
Полученные данные свидетельствуют о том, что значительная доля пациенток-носительниц мутаций ВЯСЛ1 и ВЯСЛ2 может остаться не диагностированной, если мы будем полагаться только на тестирование стандартного набора славянских фаундер-мутаций — ВЯСЛ1 5382ШС; ВЯСЛ1 4153delЛ; ВЯСЛ1 185delЛG; ВЯСЛ2 6174delT. Данное наблюдение имеет большую клиническую значимость, поскольку является основанием для расширения диагностической панели для мониторинга лиц с повышенным онкологическим риском и внедрением в клиническую диагностику мультигенного тар-гетного секвенирования.
Безусловно, использование мультигенных панелей имеет некоторые недостатки, затрудняющие их распространение. К числу последних можно отнести сложность лабораторных процедур и процессинга данных, относительно высокую стоимость, и главное — отсутствие стандартов в интерпретации данных. Однако следует признать, что этот подход является мощным диагностическим инструментом и позволяет опре-
делить причину заболевания у существенной доли считавшихся ранее BRCA1/2-негативными пациентов, способствует улучшению результатов лечения у больных с наследственным раком и возрастанию эффективности скрининга лиц с повышенной предрасположенностью к РМЖ.
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 16-45-02011.
ЛИТЕРАТУРА
1. Afghahi A., Kurian W. A. The changing landscape of genetic testing for inherited breast cancer predisposition // Curr. Treat. Options in Oncol. - 2017. - Vol. 18. - P. 27.
2. Balanovsky O., Rootsi S., Pshenichnov A. et al. Two sources of the Russian patrilineal heritage in their Eurasian context // Am. J. Hum. Genet. - 2008. - Vol. 82. - P. 236-250.
3. Chong H.K., Wang T., Lu H-M. et al. The Validation and Clinical Implementation of BRCAplus: A Comprehensive High-Risk Breast Cancer Diagnostic Assay // PLoS ONE.
- 2014. - Vol. 9(5). - P. e97408.
4. Crawford B., Adams S.B., Sittler T. et al. Multi-gene panel testing for hereditary cancer predisposition in unsolved high-risk breast and ovarian cancer patients // Breast Cancer Res Treat. - 2017. - Vol. 163(2). - P. 383-390.
5. Cybulski C., Carrot-Zhang J., Kluzniak W. et al. Germline RECQL mutations are associated with breast cancer susceptibility // Nat. Genet. - 2015. - Vol. 47. - P. 643-646.
6. Curci A., Capasso I., Romano A. et al. Characterization of 2 novel and 2 recurring BRCA1 germline mutations in breast and/or ovarian carcinoma patients from the area of Naples // Int. J. Oncol. - 2002. - Vol. 20. - № 5. - P. 963-970.
7. Desmond A., Kurian A.W., Gabree M. et al. Clinical Actionability of Multigene Panel Testing for Hereditary Breast and Ovarian Cancer Risk Assessment // JAMA Oncol. - 2015. - Vol. 1(7). - P. 943-951.
8. Gayther S.A., Harrington P., Russell P. et al. Frequently occurring germ-line mutations of the BRCA1 gene in ovarian cancer families from Russia // Am J. Hum Genet.
- 1997. - Vol. 60. - № 5. - P. 1239-1242.
9. Graffeo R., Livraghi L., Pagani O. et al. Time to incorporate germline multigene panel testing into breast and ovarian cancer patient care // Breast Cancer Res Treat. - 2016.
- Vol. 160. - P. 393-410.
10. Hall M.J., Obeid E., Daly M.B. Multigene panels to evaluate hereditary cancer risk: reckless or relevant? // J. Clin. Oncol. - 2016. - Vol. 34. - P. 4186-4187.
11. Hauke J., Horvath J., Groß E. et al. Gene panel testing of 5589 BRCA1/2-negative index patients with breast cancer in a routine diagnostic setting: results of the German Consortium for Hereditary Breast and Ovarian Cancer // Cancer Med. - 2018. - Vol. 7(4). - P. 1349-1358.
12. Hoyer J., Vasileiou G., Uebe S. et al. Addition of triple negativity of breast cancer as an indicator for germline mutations in predisposing genes increases sensitivity of clinical selection criteria // BMC Cancer. - 2018. - Vol. 18(1). - P. 926.
13. lyevleva A.G., Suspitsin E.N., Kroeze K. et al. Non-founder BRCA1 mutations in Russian breast cancer patients // Cancer Lett. - 2010. - Vol. 298. - P. 258-263.
14. Kast K., Rhiem K., Wappenschmidt B. et al. Prevalence of BRCA1/2 germline mutations in 21 401 families with
breast and ovarian cancer // J. Med. Genet. - 2016. -Vol. 53. - P. 465-471.
15. Kiiski J.I., Pelttari L.M., Khan S. et al. Exorne sequencing identifies FANCM as a susceptibility gene for triple-negative breast cancer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2014.
- Vol. 111. - P. 15172-15177.
16. Kircher M., Witten D.M., Jain P. et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants // Nat Genet. - 2014. - Vol. 46(3). - P. 310-315.
17. Kuchenbaecker K.B., Hopper J.L., Barnes D.R. et al. Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers // JAMA.
- 2017. - Vol. 317(23). - P. 2402-2416.
18. LaDuca H., Stuenkel A.J., Dolinsky J.S. et al. Utilization of multigene panels in hereditary cancer predisposition testing: analysis of more than 2,000 patients // Genet. Med. - 2014. - Vol. 16. - P. 830-837.
19. Lu H.M., Li S., Black M.H., Lee S. et al. Association of Breast and ovarian Cancers With Predisposition Genes Identified by Large-Scale Sequencing // JAMA oncol. -2018. - doi:10.1001/jamaoncol.2018.2956.
20. Mainiero M.B., Lourenco A., Mahoney M.C. et al. ACR appropriateness criteria breast cancer screening // J. Am. Coll. Radiol. - 2013. - Vol. 10. - P. 11-14.
21. Michailidou K., Lindstrom S., Dennis J. et al. Association analysis identifies 65 new breast cancer risk loci // Nature. - 2017. - Vol. 551. - № 7678. - P. 92-94.
22. NCCN Guidelines Version 2.2019.
23. Nelson H.D., Pappas M., Zakher B. et al. Risk assessment, genetic counseling, and genetic testing for BRCA-related cancer in women: a systematic review to update the U.S. Preventive Services Task Force recommendation // Ann Intern. Med. - 2014. - Vol. 160. - P. 255-266.
24. Njiaju U.O., Olopade O.I. Genetic determinants of breast cancer risk: a review of current literature and issues pertaining to clinical application // Breast J. - 2012. - Vol. 18. - P. 436-442.
25. Palacios J., Robles-Frías M.J., Castilla M.A. et al. The molecular pathology of hereditary breast cancer // Patho-biology. - 2008. - Vol. 75(2). - P. 85-94.
26. Park J.S., Lee S.T., Nam E.J. et al. Variants of cancer susceptibility genes in Korean BRCA1/2 mutation-negative patients with high risk for hereditary breast cancer // BMC Cancer. - 2018. - Vol. 18(1). - P. 83.
27. Rosenthal E.T., Bernhisel R., Brown K. et al. Clinical testing with a panel of 25 genes associated with increased cancer risk results in a significant increase in clinically significant findings across a broad range of cancer histories // Cancer Genet. - 2017. - Vol. 218-219. - P. 58-68.
28. Richards S., Aziz N., Bale S. et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology // Genet. Med. - 2015. - Vol. 17. -P. 405-423.
29. Sokolenko A., Imyanitov E. Multigene testing for breast cancer risk assessment: an illusion of added clinical value // Chin. Clin. Oncol. - 2017. - Vol. 6(2). - P. 15.
30. Sokolenko A.P., lyevleva A.G., Preobrazhenskaya E.V. et al. High prevalence and breast cancer predisposing role of the BLM c.1642 C>T (Q548X) mutation in Russia // Int. J. Cancer. - 2012. - Vol. 130. - P. 2867-2873.
31. Sokolenko A.P., Rozanov M.E., Mitiushkina N.V. et al. Founder mutations in early-onset, familial and bilateral
breast cancer patients from Russia // Fam Cancer. -2007. - Vol. 6. - P. 281-286.
32. Stadler Z.K., Schrader K.A., Vijai J. et al. Cancer genomics and inherited risk // J. Clin. Oncol. - 2014. - Vol. 32(7). - P. 687-698.
33. Thompson E.R.., Doyle M.A., Ryland G.L. et al. Exome sequencing identifies rare deleterious mutations in DNA repair genes FANCC and BLM as potential breast cancer susceptibility alleles // PLoS Genet. - 2012. - Vol. 8. - P. e1002894.
34. Tung N., Battelli C., Allen B. et al. Frequency of mutations in individuals with breast cancer referred for BRCA1 and BRCA2 testing using next-generation sequencing with a 25-gene panel // Cancer. - 2015. - Vol. 121(1). - P. 25-33.
35. Tung N., Domchek S.M., Stadler Z. et al. Counselling framework for moderate-penetrance cancer-susceptibility mutations // Nat. Rev. Clin. Oncol. - 2016. - Vol. 13(9). - P. 581-588.
36. van den Akker J., Mishne G. et al. A machine learning model to determine the accuracy of variant calls in capture-based next generation sequencing // BMC Genom-ics. - 2018. - Vol. 19(1). - P. 263.
nocTynma b pegamnro 07.12.2018 r.
K.A. Zagorodnev13, E.N. Suspitsin13, A.P. Sokolenko13, A.A. Romanko13, M.O. Anisimova13, I.V. Bizin1, E.S. Kuligina1, E.N. Imyanitov1,2,3,4
Application of the targeted multigene sequencing for the search of hereditary breast cancer mutations in Russian patients
Understanding of the molecular-genetic pathogenesis of hereditary cancer syndrome is extremely important for developing of personal therapeutic approaches and for improving the effectiveness of preventive measures. Today, the optimal solution for the search of causative germ-line mutations in hereditary breast cancer (BC) patients is the next-generation sequencing-based multigene mutational screening. The authors have assembled a targeted panel of 31 genes, based on their potential involvement in the cancer susceptibility and taking into account the frequency of pathogenic alleles in the Russian population. It includes the "canonical" genes of hereditary breast cancer (BRCA1, BRCA2, BRIP1, PALB2, TP53, ATM, NBN), the recently identified "novel" genes (BLM, FANCD2, POLE, FANCM, RAD51C, MRE11A, RECQL, as well as some other genes involved in DNA repair, apoptosis and genome stability maintenance. 94 patients with hereditary BC of unknown genetic etiology were subjected to targeted sequencing. As a result, causative germ-line mutations were identified in 21/94 (22.3%) patients. Importantly, 19 patients harbored rare non-founder BRCA1 and BRCA2 mutations. In the remaining two cases, the functions of the ATM (p.Glu73fs) and POLE (p.Leu1171fs) genes were disrupted. The obtained data are of evident clinical importance; they argue for the expanding of diagnostic panels for monitoring at-risk individuals and for moving the standards of routine clinical diagnostics towards the targeted next-generation sequencing of multigene panels.
Key words: hereditary breast cancer, targeted multigene sequencing
