CC BY
87
использование зртозтомим лмвюиим
для определения токсичности лекарственных средств
И.А. Злацкий
Российский университет дружбы народов Москва, Россия
Аннотация. Отмечена эффективность использования $р1го81отиш ambiguum для определения токсичности лекарственных средств. Исследовано влияние воды с различным изотопным составом на выживаемость биосенсора. Определена роль дейтерия в жизнедеятельности эукариот.
Ключевые слова: биосенсор, токсичность, вода с изотопным составом.
Для проведения биотестирования и анализа образцов водорастворимых лекарственных препаратов и сырья для их приготовления, оптимальным является использование в качестве тест-объектов свободноживущих в объемной фазе Простейших (Protozoa). Spirostomum ambiguum (Ehrenberg, 1833) широко применяется как тест-культура для токсикологических и фармакологических исследований [1—4]. Данные модели, удобные при культивировании не прихотливы в кормлении, крупны, что удобно при наблюдении за их состоянием в исследуемом образце. Простейшие одновременно могут совмещать функции клетки и организма. Реакции организма не зависят от концентрации эффектов на границе раздела фаз. Инфузории являются оли-готрофами, что позволяет улавливать реакцию на любой химический лиганд в водном растворе отличном от нормы. Использование одноклеточных, вместе с изменениями температуры влияет на скорость гибели, что позволяет описать этот эффект с использованием уравнений химической кинетики [2].
Реакция инфузорий на ксенобиотики подобна реакции многоклеточных организмов. В частности нами была обнаружена связь S. ambiguum между реакцией и результатом клин испытаний глицина с наполнением различными лигандами [3]. Будучи потревоженной, клетка дает мгновенный ответ, сокращаясь по своей длине в 2—3 раза. Параметры
сокращения зависят от температуры. В норме 5". ambiguum совершает свободные передвижения в толще раствора с характерным чередованием сжатия/вытягивания клетки. В среде, содержащей компоненты фармацевтических препаратов, такое передвижение может сопровождаться конвульсивными подергиваниями, фиксацией около стенки ячейки, прецессионными движениями и другими отклонениями [1]. При благоприятных условиях характеризуется высокой подвижностью как в горизонтальном, так и вертикальном направлении. Клетки 5. ambiguum в благоприятных условиях (слабоминерализованная среда культивирования или дистиллированная вода, 19—29 °С, рН = 7) не гибнут в течение времени, превышающем клеточный цикл (около 20 часов) [1].
При внесении в среду определенных химических веществ клетки погибают в течение интервала времени, являющегося функцией как концентрации, так и температуры [1; 4]. Гибели клетки предшествует формирование переходного состояния с изменением морфометрических характеристик и оптических свойств (зернистости цитоплазмы), а также целый комплекс специфических поведенческих реакций. Низкомолекулярные лиганды — компоненты лекарственных препаратов приводят, в основном, к «истончению» клетки. Для некоторых соединений возможны и иные морфометриче-
—--—-
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
Злацкий И.А. Использование Spirostomum ambiguum для определения токсичности лекарственных средств
—--—
скис изменения, например, в 2% растворе тяжелой воды Б. ambiguum приобретает колбообразную форму (рис.). По мере истощения токсиканта в среде клетка может вернуться из переходного лиганд-индуцируемого в исходное состояние, принимая естественную форму. Таким образом, устанавливается динамическое равновесие клетка — промежуточное состояние. Смещение равновесия вправо сопровождается гибелью клетки [1].
Тх,
100 80 60 40 Э0 0
0 50 100 150 10000 100000
D, ppm
Рис. Диаграмма «Концентрация D в воде» — «Время жизни S. ambigua».
100% соответствует 55 ± 5 минутам (28 °С)
Данный метод нами был опробован для анализа образцов воды с различным содержанием дейтерия. Установка для исследования состояла из следующих частей: стеклянной ячейки с пятью лунками и проточным термостатированием, электротермометра для контроля однородности прогрева, стереомикроскопа МБС-10 для наблюдения за поведением инфузории. Для освещения использовали маломощные лампы (10 Вт) дневного света. В каждую из лунок планшета вносили по 150 мкл исследуемого образца или дистиллированной воды (контроль). Далее в каждую из лунок с помощью микродозатора отсаживали по одной инфузории S. ambi-guum. Время жизни клетки рассчитывали как интервал от момента посадки до гибели клетки. Гибель клетки констатировали либо по разрыву мембраны с выходом содержимого протоплазмы наружу, либо по обездвиживанию с отсутствием со-
кратительной реакции на механическое раздражение. Для каждого водного образца время жизни рассчитывалось как среднее из пяти измерений. На всем использованном интервале температур и времени инкубации не было отмечено ни гибели, ни угнетения активности, ни морфологических изменений клеток инфузорий в дистиллированной воде (контрольный опыт).
Для характеристик биологической активности водных образцов использовали диаграммы «доза— ответ» (зависимость времени жизни от концентрации дейтерия) и зависимости времени жизни сво-бодноживущей инфузории S. ambiguum от температуры. Полученные результаты позволили получить параметр энергии активации процесса клеточного перехода или гибели, не зависящего от состояния культуры клеток и находящегося во взаимно однозначном соответствии с химическим составом исследуемого водного образца. Вид температурных зависимостей по сохранению или нарушению линейности в аррениусовских координатах может также указывать на неаддитивные эффекты (синергизма или антагонизма) при комбинированном действии многокомпонентных смесей загрязняющих веществ.
При определении роли дейтерия в жизнедеятельности эукариотической клетки нами было установлено, что зависимость времени жизни клеточного биосенсора от содержания дейтерия в воде (в интервалах от 0 до 99%) имеет колоколообраз-ную форму с явно выраженными зонами угнетения жизнедеятельности как при избытке, так и при недостатке последнего (см. рис.).
Полученные результаты свидетельствуют о необходимости дейтерия для обеспечения нормального функционирования клетки. Кроме того, было показано, что с помощью изменения соотношения H/D, возможно управление субпопуляцион-ным составом полиморфной культуры [2]. Также отмечена эффективность использования Spirosto-mum ambiguum для определения токсичности лекарственных средств.
ЛИТЕРАТУРА
1. Nalecz-Jawecki G. Spirotox-Spirostomum ambiguum acute toxicity test-10 years of experience // Environ. Toxicol. 2004. V. 19(4). P. 359—64.
2. Сыроешкин А.В., Суздалева О.В., Кискина Л.П., Долгополова В.А., Быканова С.Н., Плетенева Т.В. Кинетическое описание взаимодействия клетки с низкомолекулярными лигандами // Вестник РУДН. Серия: Медицина. 2002. № 3. С. 25—32.
—--—-
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
The Journal of scientific articles "Health and Education Millennium", 2016. Vol. 18. No 8
3. Bykanova S.N., Kin'ko T.Y., Voloshina T.A., Sy-roeshkin A.B., Komissarova I.A. New drug MP-33 technology and composition choice // Supplement to the European Journal of Pharmaceutical Sciences. 5—6 June 2003. Helsinki., 2003. Vol. 19. Suppl. 1. P. 41.
4. Ershov Yu.A., Pleteneva T.V., Siniuk T.F., Dolgo-polova V.A. Determination of growth parameters of the Paramecium caudatum test-systemduring standardization of studies of biological activity of chemicals // Biull. Eksp. Biol. Med. 1999. V. 127. P. 717—720.
SPIROSTOMUM AMBIGUUM use
for determining toxicity of drugs
I.A. Zlatskiy
Peoples Friendship University of Russia Moscow, Russia
Annotation. Noted the efficiency Spirostomum ambiguum to determine the toxicity of drugs. The effect of water with different isotopic composition on the survival of the biosensor. Determined deuterium role in eukaryotic life.
Key words: biosensor, toxicity, water with an isotopic composition.
REFERENCES
1. Nalecz-Jawecki G. Spirotox-Spirostomum ambiguum acute toxicity test-10 years of experience. Environ. Toxicol, 2004, vol. 19(4), pp. 359—64.
2. Syroeshkin A.V., Suzdaleva O.V., Kiskin L.P., Dol-gopolov V.A., Bykanova S.N., Pleteneva T.V. Kinetic description of the interaction of cells with low molecular weight ligands. Bulletin of Peoples' Friendship University. Series: Medicine, 2002, vol. 3, pp. 25—32.
3. Bykanova S.N., Kin'ko T.Y., Voloshina T.A., Syroeshkin A.B., Komissarova I.A. New drug MP-33 technology and composition choice. Supplement to the European Journal of Pharmaceutical Sciences, 5—6 June 2003. Helsinki., 2003. Vol. 19, Suppl. 1. P. 41.
4. Ershov Yu.A., Pleteneva T.V., Siniuk T.F., Dolgo-polova V.A. Determination of growth parameters of the Paramecium caudatum test-systemduring standardization of studies of biological activity of chemicals. Biull. Eksp. Biol. Med, 1999, vol. 127, pp. 717—720.
