CC BY
1464 Вестник защиты растений 3(89) - 2016. Материалы международной конференции
Plant Protection News, 2016, 3(89), p. 62-64
THE PROTECTION OF CEREAL CROPS FROM DISEASES IN ORGANIC AGRICULTURE
S.A. Dobrohotov, N.V. Chernyavina, A.I. Anisimov
Saint Petersburg State Agrarian University, dobrohotiov-s@mail.ru
Protecting crops, particularly cereals, from disease at the territory of organic farming in the SPbSAU conducted in accordance with the national standard for the production of organic products [2015]. We try to detect more productive resistant to diseases varieties, the optimal variants for crops rotation, efficient microbiological preparations. So, in 2015, against net blotch of barley, that greatly affecting the crop in the field of North-West Russia, the high biological effectiveness of some microbiological preparations (Fitosporin, Vostok EM-1, Biosil) were shown. Sufficient reduction of oats demerges by semiloose smut (86 %) was provided only by Fitosporin. 3 other microbiological preparations which were tested (Ekstrasol, East EM-1, Biosil) and the reference chemical fungicide - Dividend Star, practically were not effective.
УДК 577.29
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КЛЕТОЧНОЙ
БИОЛОГИИ В ОБЛАСТИ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ В.В. Долгих1, И.В. Сендерский1, С.А. Тимофеев1, А.А. Царев1, Г.В. Митина1, Е.А. Рогожин2
'Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург, Пушкин, Россия, dollslav@yahoo.com 2Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия
В работе обсуждаются первые результаты исследований, проводимых в лаборатории микробиологической защиты растений ВИЗР с использованием методов молекулярной и клеточной биологии по трем направлениям: (1) гетерологичная экспрессия белков в клетках насекомых линии Sf9 для изучения внутриклеточных энтомопатогенов; (2) получение рекомбинантных одноцепочечных антител с использованием технологии фагового дисплея для изучения и диагностики различных энтомо- и фитопатогенов, (3) повышение вирулентности природных изолятов энтомопатогенных грибов с использованием пост-геномных и генно-инженерных подходов.
Ключевые слова: клетки насекомых, микроспоридии, энтомопатогенные грибы, одноцепочечные антитела, гетерологичная экспрессия.
Современные методы генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии традиционно широко используются в области фундаментальных биологических, а также медико-биологических исследований. В последнее время они начинают находить свое применение и в области сель-ско-хозяйственной науки, включая исследования в области защиты растений. Мы кратко рассмотрим некоторые результаты использования этих методов в исследованиях, проводимых в лаборатории микробиологической защиты растений ВИЗР.
Первое направление исследований связано с гетероло-гичной экспрессией белков в клетках насекомых линии Sf9 кукурузной листовой совки Spodoptera frugiperda [Vaughn et al., 1977] для изучения внутриклеточных энтомопатогенов. Ранее мы показали, что энтомопатогенные микроспоридии (близкие к грибам внутриклеточные паразиты) секретируют в зараженную клетку белки, относящиеся к различным функциональным категориям [Долгих и др., 2010]. Наиболее интересным результатом иммунолокали-зации секретируемых белков микроспоридии Paranosema locustae в зараженных клетках жирового тела перелетной саранчи оказалось специфичное накопление гексокиназы II паразита в ядрах хозяина [Senderskiy et al., 2014]. Для дальнейшего изучения этого вопроса мы осуществили гетерологичную экспрессию гексокиназы P locustae в клетках линии Sf9. С целью обеспечения синтеза гетеро-логичного белка в цитоплазме клеток насекомых, из состава гексокиназы был удален сигнальный пептид, ответственный за ее секрецию. Проведенный эксперимент ясно показал, что гетерологичная экспрессия белка паразита
сопровождалась его специфичным накоплением в ядрах клеток Sf9, что подтверждает важную роль гексокиназы микроспоридий в воздействии на транскрипционную активность генов хозяина. В дальнейшем мы планируем использовать данную модель для выяснения роли других белков, выделяемых микроспоридиями, в патогенезе зараженной клетки и насекомого в целом, а также для гетеро-логичной экспрессии различных целевых функционально активных полипептидов.
Второе направление исследований связано с созданием библиотек рекомбинантных одноцепочечных антител (scFv-антител) на основе вариабельных фрагментов иммуноглобулинов мышей [Huston et al., 1988], иммунизированных определенным антигеном. Отбор антител, специфичных к данному антигену, из сконструированных библиотек осуществляется с использованием технологии фагового дисплея [Breitling et al., 1991]. К настоящему времени нами получены рекомбинантные scFv-антитела против: (1) глютенин-гидролизущей протеиназы клопа вредная черепашка Eurygaster integriceps, (2) белка оболочки одного из штаммов вируса картофеля Y, (3) одного из белков микроспоридии P. locustae, секретируемых паразитом в цитоплазму зараженной клетки. Наряду с поиском новых антител, в настоящее время осуществляется генно-инженерная модификация уже полученных c целью повышения их антиген-связывающей способности и стабильности.
Третье направление исследований связано с использованием генно-инженерных подходов для повышения вирулентности природных штаммов энтомопатогенных
«Эколого-генетические основы современных агротехнологий». СПб, 27-29 апреля 2016 г.
65
грибов и проводится совместно с сотрудниками ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. На основании последовательностей двух токсинов-блокаторов ионных каналов насекомых из яда пауков созданы конструкциии для их встраивания в геном энтомопатогенных грибов родов Beauveria, Metarhizium, Lecanicillium и последую-
Библиографический
Долгих ВВ, Павлова ОА, Сендерский ИВ, Пэн Г. 2010. Секреторные белки микроспоридии Paranosema locustae и их участие в патогенном воздействии на организм перелетной саранчи Locusta migratoria. Вестник Защиты Растений. N1: 48-51. Breitling, F., Dübel, S., Seehaus, T., Klewinghaus, I. and Little, M. 1991. A
surface expression vector for antibody screening. Gene 104, 147-53. Huston, J. S.; Levinson, D.; Mudgett-Hunter, M.; Tai, M. S.; Novotny, J.; Margolies, M. N.; Crea, R. (1988). "Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain
щей гетерологичной экспрессии в секретируемой форме под контролем сильных промоторов. В настоящее время подбираются условия для эффективной трансформации различных штаммов грибов созданными конструкциями.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (№№ 15-0404968, 15-08-04247, 16-34-60217).
список (References)
Fv analogue produced in Escherichia coli". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 85 (16): 5879-5883. Senderskiy IV, Timofeev SA, Seliverstova EV, Pavlova OA, Dolgikh VV. 2014. Secretion of Antonospora (Paranosema) locustae proteins into infected cells suggests an active role of microsporidia in the control of host programs and metabolic processes. PLoS One. 9(4):e93585. doi: 10.1371/ journal.pone.0093585 Vaughn JL, Goodwin RH, Tompkins GJ, McCawley P (1977). "The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae)". In Vitro 13 (4): 213-217.
Plant Protection News, 2016, 3(89), p. 64-65
APPLICATION OF MOLECULAR AND CELL BIOLOGY APPROACHES
IN THE FIELD OF PLANT PROTECTION
V.V. Dolgikh1, IV. Senderskiy1, S.A. Timofeev1, A.A. Tsarev1, G.V. Mitina1, E.A. Rogozhin2
'All-Russian Institute of Plant Protection, dollslav@yahoo.com 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, RAS
The paper discusses the first results of the experiments carried out in the laboratory of microbiological control of All-Russian Institute of Plant Protection that use methods of molecular and cell biology in three areas: (1) the expression of heterologous proteins in Sf9 insect sell line to study the intracellular entomopathogens; (2) construction and selection scFv-antibodies using phage display technology for the study and diagnostic of entomo- and phytopathogens; (3) increasing the virulence of natural rooMTOB of entomopathogenic fungi using post-genomic and genetic engineering approaches.
УДК: 631.524.86:632.4:633.1: 577.21
ДНК-АНАЛИЗ СОРТОВ ОЗИМОГО И ЯРОВОГО ТРИТИКАЛЕ, РАЙОНИРОВАННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ, НА НАЛИЧИЕ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К БУРОЙ, СТЕБЛЕВОЙ И ЖЕЛТОЙ РЖАВЧИНЕ
Т.В. Долматович, А.А. Булойчик Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь, T.Dolmatovich@igc.bas-net.by С помощью ДНК-маркеров проведен анализ сортов озимого и ярового тритикале, внесенных в Государственный реестр сортов Республики Беларусь, на наличие генов устойчивости к бурой, стеблевой и желтой ржавчине пшеницы. Проанализированы маркеры, сцепленные с генами устойчивости: Lr1, Lr9, Lr10, Lr19/Sr25, Lr20/Sr15/Pm1, Lr21, Lr24/ Sr24, Lr25/Pm7, Lr26/Yr9/Sr31/Pm8, Lr28, Lr34/Yr18/Pm38, Lr35/Sr39, Lr37/Sr38/Yr17, Lr47, Sr2, Sr22, Sr26, Sr36, Sr40, Sr44, Sr45, Sr50 и Sr1RSAmigo, Yr5, Yr10 и Yr26. Показано, что в районированных в Республике Беларусь сортах озимого и ярового тритикале присутствуют гены устойчивости Lr25/Pm7, Lr26/Yr9/Sr31/Рт8, Sr2, Yr5 и Yr10. Выделенные сорта тритикале могут служить источниками эффективных генов устойчивости к возбудителям бурой, стеблевой и желтой ржавчины.
Ключевые слова: молекулярные маркеры.
Использование генетически устойчивых сортов является наиболее экономически и экологически эффективным методом контроля болезней, позволяющим снизить или элиминировать применение фунгицидов и свести к минимуму потери урожая от заболеваний. Тритикале поражаются физиологическими формами ржавчинных заболеваний пшеницы: бурой (Puccinia triticina f.sp.tritici Erikss.^, стеблевой (P. graminis f.. tritici Erikss. and Henning) и желтой (P. striiformis f. tritici Erikss..) ржавчины.
Целью нашей работы являлось проведение ДНК-анализа сортов озимого и ярового тритикале, внесенных в Государственный реестр сортов Республики Беларусь,
на присутствие генов устойчивости к бурой, стеблевой и желтой ржавчине пшеницы.
В работе использовано 42 молекулярных маркера, сцепленных с генами устойчивости: Lr1, Lr9, Lr10, Lr19/ Бг25, Lr20/Sr15/Pm1, Lr21, Lr24/Sr24, Lr25/Pm7, Lr26/Yr9/ Бг31/Рт8, Lr28, Lr34/Yr18/Pm38, Lr35/Sr39, Lr37/Sr38/ Yr17, Lr47, Бг2, Бг22, Бг26, Бг36, Бг40, Sr44, Бг45, Бг50 и Yr5, Yr10 и Yr26.
Маркерный анализ 19 сортов озимого и 7 ярового тритикале, внесенных в Государственный реестр Республики Беларусь в 2014-2015 гг. показал, что в изученных сортах присутствуют фрагменты амплификации, сцепленные с ге-
