CC BY
24
Тимофеев С. А.1,2, Сендерский И. В.2, Павлова О.А.2, Долгих В.В.2 ©
'Санкт-Петербургский государственный университет; ^Всероссийский научноисследовательский институт защиты растений РАСХН
ГЕТЕРОЛОГИЧНАЯ ЭКСПРЕССИЯ В ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТКАХ КАК МЕТОД ИЗУЧЕНИЯ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ МИКРОСПОРИДИЙ
Аннотация
Предложен новый подход - использование дрожжевой клетки в качестве модели для изучения молекулярных основ паразито-хозяинных отношений облигатных внутриклеточных паразитов микроспоридий со своими хозяевами. Экспериментально подтверждена возможность применения разработанной методики для демонстрации секреции паразитом в клетку хозяина конкретных белковых молекул, способных вмешиваться в регуляторные пути и сигнальные каскады зараженной клетки.
Ключевые слова: микроспоридии, паразито-хозяинные отношения, дрожжи, гетерологичная экспрессия, секреторные белки.
Keywords: microsporidia, host-parasite interactions, yeast, heterologous expression, secretory proteins.
Микроспоридии - группа родственных грибам облигатных внутриклеточных эукариотических паразитов, освоивших чрезвычайно широкий круг хозяев, от протистов до млекопитающих. Крайняя степень специализации представителей этого таксона к внутриклеточному паразитизму, экономическая и медицинская значимость делает актуальным изучение их взаимоотношений с хозяином. На сегодняшний день, молекулярные основы воздействия микроспоридий на своих хозяев изучены крайне слабо. Во многом это связано с методическими трудностями работы с данными паразитами, т.к. микроспоридии не культивируются вне клетки хозяина [1].
Одним из механизмов воздействия внутриклеточных паразитов на своих хозяев является секреция белков, способных вмешиваться в регуляторные пути и сигнальные каскады зараженной клетки. Такие белковые факторы патогенности были описаны у представителей других групп внутриклеточных паразитов, таких как Apicomplexa и Kinetoplastida [2]. Для изучения подобных механизмов у микроспоридий мы предлагаем оригинальный подход -использование дрожжевой клетки в качестве модельной системы. Данный подход основывается на филогенетической близости микроспоридий и дрожжей [3;4], из чего можно предположить, что секреторный аппарат последних сможет правильно распознать N-концевой сигнальный пептид в составе белков паразита, ответственный за секрецию данных молекул. Таким образом, если встроить полноразмерные копии изучаемых генов в геном дрожжевых грибов и осуществить их экспрессию, секреция соответствующих белков в культуральную жидкость будет означать, что и в клетках паразита данный белок секретируется за пределы цитоплазматической мембраны.
В качестве объекта изучения в данной работе была выбрана паразито-хозяинная система микроспоридия-насекомое: Paranosema locustae - Locusta migratoria. Геном данного вида микроспоридии был полностью расшифрован французскими коллегами, что позволило с помощью компьютерного анализа выявить белки потенциально способные воздействовать на клетку хозяина, т.е. обладающие N- концевым сигнальным пептидом, необходимым для секреции молекулы за пределы цитоплазматической мембраны паразита [5]. Среди обнаруженных последовательностей присутствовал ряд ферментов, таких как эстеразы или протеиназы, но наиболее интересной оказалась группа из нескольких десятков, так называемых обогащенных лейциновыми повторами белков или LRR белков. Эта уникальная группа отсутствует у других внутриклеточных паразитов и демонстрирует сходство аминокислотных
© Тимофеев С. А., Сендерский И. В., Павлова О.А., Долгих В.В., 2014 г.
последовательностей с протеикиназами, Ras-подобными ГТФазами и ингибиторами РНКаз бактерий и высших растений [5]. Поскольку перечисленные белки широко участвуют в передаче внутриклеточных сигналов, а секреторные сигнальные пептиды обнаруживаются только в составе LRR-белков микроспоридий, есть все основания полагать, что данная множественная группа генов является основным инструментом вмешательства паразита в сигнальные каскады и регуляторные процессы хозяина.
Для экспериментального изучения с применением предложенной нами методики мы выбрали два LRR белка, соответствующие 204 и 515 открытой рамке считывания в геноме P. locustae, а также обладающую сигнальным секреторным пептидом протеазу. Последовательности, кодирующие данные белки были PCR амплифицированы, клонированы в составе вектора pPic3.5 и встроены в геном метилотрофных дрожжей Pichiapastoris, в которых далее была осуществлена гетерологичная экспрессия белков паразита. Из дрожжевых клеток и культуральной среды, в которой осуществлялась экспрессия, были приготовлены белковые пробы, каждая из которых была проанализирована на предмет взаимодействия с ранее полученными антителами к изучаемым белкам с помощью иммуноблотинга. Полученные данные, представленные на рисунке 1, демонстрируют, что оба LRR белка P. locustae накапливаются как в дрожжевых клетках, так и в соответствующей культуральной среде. В то же время, протеаза обнаруживается только в клетках дрожжей. Секреция пептида микроспоридии дрожжевой клеткой, которую мы наблюдаем для обоих LRR белков, означает наличие таковой секреции и у самого паразита, т.к. тонкий процесс распознавания сигнальной последовательности не может происходить случайным образом. В то же время, отсутствие секреции в дрожжевой системе, которое мы наблюдаем для протеазы P. locustae, не может дать нам никаких данных о поведении данного белка у паразита. Это связано с тем, что причиной этого явления может быть как то, что белок изначально не является секреторным у микроспоридии, так и то, что секреторная система дрожжевой клетки не смогла распознать сигнальную последовательность другого, хоть и родственного организма.
А в С
Рис. 1. Вестерн-блот анализ дрожжевых проб с антителами против белков P. locustae, демонстрирующий распознавание дрожжевой клеткой сигнальных секреторных последовательностей в составе двух LRR белков P. locustae. 1 - проба дрожжевых клеток до индукции экспрессии метанолом; 2 - проба дрожжевых клеток после индукции экспрессии; 3 -контрольная проба дрожжевых клеток (в которых была осуществлена экспрессия другого белка P. locustae); 4 - проба культуральной среды, 5 - контрольная проба культуральной среды. А - экспрессия LRR ORF 204 (42 кДа); B - экспрессия LRR ORF 515 (79 кДа); C - экспрессия протеазы (55кДа).
Не смотря на прогресс, достигнутый в медицине и биологии, до сих пор остаются не решенными большое количество важных задач []. На основании представленных в этой статье экспериментальных данных можно сделать вывод о том, что предложенный нами подход -использование дрожжевой клетки в качестве модельной системы, действительно может быть использован для изучения белковых факторов патогенности микроспоридий. В частности, данная методика позволяет выбрать из большого количества белков-кандидатов на участие в воздействии паразита на хозяина те ферменты, которые действительно секретируются микроспоридией в зараженную клетку и приступить к их дальнейшему функциональному анализу.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований
(№ 12-04-01517-а).
Литература
Долгих В.В., Сендерский И.В. и др. Использование антител к молекулярным шаперонам семейства Hsp70 микроспоридий в изучении секретома внутриклеточных паразитов // Паразитология. - 2012. - С. 479-471.
Ravindran S., Boothroyd J.C. - Secretion of proteins into host cells by Apicomplexan parasites. // Traffic.
2008. Vol. 9. P. 647-656
Capella-Gutierrez S et al. Phylogenomics supports microsporidia as the earliest diverging clade of sequenced fungi // BMC Biology. - 2012. - V. 10. - P. 47-59.
Keeling P.J. et al. Evidence from beta-tubulin phylogeny that microsporidia evolved from within the fungi // Mol. Biol. Evol. - 2000. -V. 17. - P. 23-31.
Долгих В. В. И др. Секреторные белки микроспоридии paranosema locustae и их участие в патогенном воздействии на организм перелетной саранчи locusta migratoria // Вестник защиты растений. - 2010. - С. 48-51.
Федулкина В.А. и др. Трансляционная клеточная иммунотерапия при аллотрансплантации трупной почки у урологических больных // Альманах клинической медицины. - 2013. - №28. - С. 25-31. Марченко Т.В., Морозов Ю.А., Дементьева И.И., Вая Л.В. Эффективность и безопасность бикарбонатных диализирующих растворов с уксусной и молочной кислотами при проведении программного гемодиализа у пациентов с хронической почечной недостаточностью в терминальной стадии. // Альманах клинической медицины. - 2013. - №28. - С. 32-36.
Когония Л.М. и др. Ладонно-подошвенная эритродизестезия - серьезное осложнение при применении капецитабина (Собственный опыт). // Альманах клинической медицины. - 2013. -№28. - С. 37-40.
Терпигорев С.А., Корсакова Н.А., Палеев Ф.Н., Гуревич Л.Е., Ильченко В.А. Прогностическое значение морфологического исследования биоптатов легочной ткани больных саркоидозом и неспецифической интерстициальной пневмонией. // Альманах клинической медицины. - 2013. -№28. - С. 41-47.
Шитов А.Ю. Молекулы средней массы как показатель «гипербарической интоксикации» у водолазов. // Альманах клинической медицины. - 2013. - №28. - С. 48-52.
Ульянов А.В. Профилактика раневых осложнений при ампутации бедра у больных острой и хронической артериальной ишемией методом лазерного облучения. // Альманах клинической медицины. - 2013. - №28. - С. 53-57.
Алаев Д.С., Котова И.В. Нефролитиаз при первичном гиперпаратиреозе. // Альманах клинической медицины. - 2013. - №28. - С. 58-60.
Шапкин Ю.Г., Ефимов Е.В., Хорошкевич А.В. результаты лечения больных с синдромом диабетической стопы. // Альманах клинической медицины. - 2013. - №28. - С. 61-64.
Куликов Д.А., Машков А.Е. и др. Компежация мышечной джфункции ^ямой кишки. // Биофизика. 2010. Т. 55. № 6. С. 1147-1148.
Mashkov A.E., Kulikov A.V., Shumsky V.I. et al. Experience of anal insufficiency treatment using medullary transplantation in experiment and clinic. // Альманах клинической медицины. 2011. № 25. С. 13-16.
Маpcагишвили Л.Г., Бобылёв А.Г. и др. Влияние фуллеpенов С60 на амилоиды Х-белка // Биофизика. 2009. Т. 54. № 2. С. 202-205.
Marsagishvili L.G., Bobylev A.G. et al. Effect of fullerenes С60 on X-protein amyloids. // Biophysics.
2009. Т. 54. № 2. С. 135-138.
Belosludtsev K.N., Garmash S.A. et al. Study of the mechanisms of cytotoxic effect of uranyl nitrate. // Biophysics. 2012. Т. 57. № 5. С. 607-612.
Никитин А.А., Казанцева И.А., Спиридонова Н.З., Горбачева Ю.В., Стучилов В.А., Лапшин В.П., Степанова Е.А. Болезнь Кимуры (описание редкого наблюдения). // Альманах клинической медицины. - 2013. - №28. - С. 65-69.
