CC BY
43
УДК 615.3 (571.6):(616.36+616.94):613.81
Т.Н.Гордейчук, С.Е.Фоменко, Н.Ф.Кушнерова, В.Г.Спрыгин
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИФЕНОЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ИЗ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ДИКОРОСОВ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ПЕЧЕНИ
ПРИ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
Тихоокеанский океанологический институт им. В.И.Ильичева, ДВО РАН, отделение биохимических технологий, г. Владивосток
РЕЗЮМЕ
В эксперименте на белых крысах-самцах изучено влияние природных комплексов, выделенных из Дальневосточных дикоросов («Калифена» - экстракт из гребней калины и «Экликита» - из гребней лимонника) на восстановление метаболических реакций, подавленных этанолом в сравнении с известным гепатопротектором «Легало-ном». Изученные экстракты обладают способностью быстрого восстановления функционального состояния печени после 7-дневной алкоголизации. Механизм их гепатопротекторного действия реализуется через антиоксидантный, мембраностабилизирующий и антигипоксический эффекты.
SUMMARY
T.N.Gordeychuk, S.E.Fomenko, N.F.Kushnerova, V.G.Sprygin
POLYPHENOL COMBINATIONS OF FAR-EASTERN WILD PLANS USED TO TREAT LIVER FUNCTIONS IN ALCOHOLIC INTOXICATION
White male rats were used in experiments to study effects of natural mixtures extracted from wild plants on ethanol-inhibited metabolic reactions. Extracts have been shown to improve liver function of the experimental rats subjected to alcohol during 7 days. Their liver protective effect can be attributed to their antioxidant, membrane stabilizing and anti-hypoxic properties.
Рациональным подходом к использованию сырья растительного происхождения является создание лечебно-профилактических средств на основе экстрактов растений, обладающих различными видами фармакологической активности, в том числе антиокси-дантным, гепатопротекторным действием. При этом перспективными источниками, на наш взгляд, являются природные комплексы, полученные из отходов переработки дикорастущих видов Дальневосточной тайги. В результате проведенных исследований нами разработаны новые биологически активные добавки (БАД): «Калифен» - из гребней (кистей, освобожденных от ягод) калины (Viburnum sargentii) и лимонника китайского (Schizandra chinensis). Выше названные комплексы запатентованы и имеют торговую марку.
В традиционной и народной медицине из лимонника и калины в качестве лекарственных средств используют в основном плоды, семена и кору [3].В виде настоев и экстрактов они применяются лишь как стимулирующие средства и источники витаминов. Однако, выявленный химический состав этих природных комплексов, основными действующими компонентами которых являются полифенольные соединения: флавоноиды, проантоцианидины, антоцианы, феноловые кислоты, а также лигнаны, органические кислоты и др., предполагает наличие широкого спектра биологической активности. Причем полифенолы составляют до 40% сухого остатка. Известно, что полифенолы благодаря проявлению ими анти-окислительных свойств и способности выступать ловушками свободных радикалов [16], защищают организм от проявлений оксидативного стресса [10], образуют комплексы с ионами металлов [20], блокируют процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) [19], взаимодействуют с биологическими мембранами, меняя их структурные характеристики
[7].
В связи с этим, в задачу наших исследований входило изучение влияния природных комплексов «Эк-ликит» и «Калифен» на состояние антиоксидантной системы печени, липидного обмена и ПОЛ при поражении этиловым спиртом.
Препараты готовили следующим образом: высушенные при 40-50оС и измельченные гребни экстрагировали 40% этанолом. В процессе реперколяции из 1 кг сырья выход экстракта составлял 1 л. Низкая токсичность (ЬБ50 для «Калифена» составляет 36 мл/кг, для «Экликита» - 28 мл/кг) и безопасность при длительных введениях в желудок и парентерально позволили провести экспериментальные исследования по изучению гепатопротекторного эффекта на модели алкогольной интоксикации. Схема эксперимента заимствована из работы А.ва]^ й а1. [12] как скрининговая модель оценки гепатопротекторной активности. В качестве препарата сравнения был использован гепатопротектор «Легалон».
Эксперимент проводили на крысах-самцах Вистар массой тела 130-180 г, содержавшихся на стандартном рационе питания. В течение 7 дней крысам вводили внутрибрюшинно этиловый спирт в дозе 7,5 мл на 1 кг массы тела животного 2 раза в сутки. После последнего дня введения этанола крысы перорально получали «Калифен» и «Экликит» в дозе 0,2 мл на 100 г массы в течение 7 дней. «Легалон» вводили по
этой же схеме в виде взвеси в 1% крахмальном клейстере в дозе 100 мг/кг массы тела. Животные были разделены на следующие группы: 1-я - контроль (ин-тактные); 2-я - введение 33% этанола; 3-я - введение 33% этанола в течение 7 дней с последующей отменой (депривация); 4-я - введение «Легалона» после 7дневной алкоголизации; 5-я - введение «Калифена» после 7 - дневной алкоголизации; 6-я - введение «Экликита» после 7-дневной алкоголизации.
Экстракт общих липидов из ткани печени готовили методом 1Ро1сИ й а1. [11]. Для разделения фосфо-липидных фракций применяли метод двумерной хроматографии, разработанный У.1.8уе1асИеу, У.Е.УаБкоуБку [18]. Результаты выражали в % от суммарного содержания фосфолипидов. Хроматографическое распределение нейтральных липидов и их количественное определение проводили методом одномерной тонкослойной хроматографии в ситстеме растворителей, описанных в^Ашейа [6]. Определение активности лизосомальных ферментов: р-галактозидазы и р-глюкозидазы проводили по методу А.А.Покровского [4]. Малоновый диальдегид (МДА) определяли по методу М.С.Гончаренко и
А.Н.Латиновой [2]. Антиоксидантную ситему печени исследовали по активности ферментов - супероксид-дисмутазы (СОД) [5], глутатионредуктазы (ГР) [15] и величине восстановленного глутатиона (Г-8И) [15]. Определение лактата проводили энзиматическим методом [8], НАД+ [13].
В таблице 1 приведены биохимические параметры животных, подвергшихся воздействию алкоголя и последующего введения «Легалона» и экстрактов «Калифена», «Экликита». Алкогольная интоксикация, вызванная введением 33% этилового спирта, сопровождается достоверным снижением активности мембраносвязанной лизосомальной р-глюкозидазы на 15% (р<0,05) в результате мембраноповреждающего эффекта этанола. Увеличение активности цитозольной р-галактозидазы на 13% (р<0,05) обусловле-
но увеличением проницаемости мембран лизосом и выходом матричного фермента.
Нарушается соотношение компонентов антиокси-дантной защиты. Увеличение активности СОД в 3 раза (р<0,001) связано с образованием из этанола гидроксиэтиловых свободных радикалов, которые активируют микросомальные ферменты монооксиге-назной системы [1]. Снижение активности ГР на 61% (р<0,05) и количества восстановленного глутатиона на 14% (р<0,05) свидетельствует о снижении способности печени эффективно осуществлять детоксикацию. В результате активируется перекисное окисление липидов, что подтверждается увеличением количества МДА на 35% относительно контроля (р<0,05).
Снижение содержания НАД+ на 49% (р<0,05), являющегося коферментом алкогольдегидрогеназы, свидетельствует о высокой интенсивности окисления этанола, накоплении восстановленной формы кофер-мента (НАДН) и, соотвественно, нарушении функционирования аэробного гликолиза. Об этом свидетельствует увеличение количества лактата на 42% (р<0,05). В содержании фракций нейтральных липидов печени (рис.) отмечалось увеличение количества холестерина (ХС) на 13% (18,01±0,23%, в контроле 15,99±0,42%, р<0,001); триацилглицерина (ТАГ) на 4% (20,50±0,23%, в контроле 19,69±0,24%, р<0,05) и свободных жирных кислот (СЖК) на 18% (14,67±0,34%, в контроле 17,25±0,27%, р<0,001). Произошло снижение содержания эфиров холестерина (ЭХС) на 14% (19,42±0,61%, в контроле 16,75±0,89%, р<0,05). Эти изменения обусловлены усилением периферического липолиза (стрессовая реакция на этанол), в результате которого происходит поступление жирных кислот и глицерина в печень из жировых депо с последующей этерификацией в ТАГ, что может приводить к жировому перерождению печени [14]. Увеличение количества холестерина (ХС) связано с усилением его синтеза из ацетил-КоА, образовавшегося при окислении этанола.
Таблица 1
Эффективность «Легалона» и экстрактов из гребней калины и лимонника при поражении печени этиловым спиртом (М+м)
Биохимические параметры 1 группа (контроль) 2 группа (этанол) 3 группа (депривация) 4 группа (депривация + «Легалон») 5 группа (депривация + калина) 6 группа (депривация + лимонник)
Р-глюкозидаза, мкмоль/г/мин 0,171+0,01 0,146+0,01* 0,124+0,05* 0,175+0,01 0,172+0,01 0,172±0,01
Р-галактозидаза, мкмоль/г/мин 0,395+0,02 0,446+0,02* 0,420+0,01 0,340+0,02 0,367+0,01 0,330±0,02
СОД, ед/мг белка 108,5+11,0 344,9+13,0* 314,5+12,3* 162,6+11,8* 120,7+10,3 126,4±10,8
ГР, нмоль/мин/мг белка 1,31+0,15 0,51+0,08* 0,59+0,09* 0,86+0,13* 1,18+0,14 1,13±0,12
Г-8И, мкг/мл 28,2+0,15 24,2+0,09* 25,2+0,16* 26,6+0,16* *27,8+0,16 *28,6±0,06
Лактат, мкмоль/г 6,45+0,09 9,13+0,35* 8,03+0,36* 7,55+0,44* 6,54+0,43 6,22±0,19
МДА, мкмоль/г 68,91+1,7 92,94+1,4* 84,93+1,9* 69,68+1,2 70,10+1,8 66,10±0,8
НАД+ , мкмоль/г 0,51+0,04 0,26+0,03* 0,28+0,04* 0,52+0,03 0,60+0,02* 0,62±0,02*
Примечание: * справа - достоверные различия с контролем (р<0,05); * слева - достоверные различия с 4-й группой (р<0,05).
ТАГ сжк эжк хс эхе
Рис. Влияние «Легалона» и экстрактов из гребней калины и лимонника на содержание нейтральных липидов (в % от контроля) в ткани печени крыс при интоксикации этиловым спиртом.
ТАГ - триацилглицерины, СЖК - свободные жирные кислоты, ЭЖК - эфиры жирных кислот, ХС -холестерин, ЭХС - эфиры холестерина; Ш - этанол, □ - депривация, □ - депривация + «Легалон»,
и - депривация + «Калифен», Н - депривация + «Экликит». * - р< 0,05; ** - р< 0,01.
Уменьшение количества эфиров холестерина обусловлено нарушением этерифицирующей функции печени, что может быть следствием ингибирования активности АХАТ (ацил-КоА: холестерол-
ацилтрансферазы) под действием этанола [9]. Нарушение этой функции проявляется и в снижении количества общих фосфолипидов на 24% (70,20±3,43%, контроль 55,20±1,75% (этанол), р<0,05).
Среди фосфолипидных фракций (табл. 2) уменьшилось количество основного структурного компонента мембран гепатоцитов-фосфатидилхолина (ФХ) на 11% (р<0,05) и фосфатидилсерина (ФС) на 19% (р<0,05). Заметно повысилось количество лизофос-фатидилхолина (ЛФХ) и лизофосфатидилэтанолами-на (ЛФЭ) в среднем на 30-40% (р<0,05), что связано с увеличением активности фосфолипазы А2 [17]. Повысился уровень фосфатидилинозита (ФИ) на 28% (р<0,05). Изменения в содержании фракционного состава фосфолипидов свидетельствуют о повышении проницаемости мембран гепатоцитов.
Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что при воздействии этилового спирта отмечалось выраженное гепато-тропное его действие, которое проявилось в виде существенных сдвигов в липидном и углеводном обмене печени, а также в разбалансировке ферментных систем.
Через 7 дней после отмены этанола (рис, табл. 1, 2) большинство изученных биохимических параметров к норме не возвратилось. Осталась пониженной активность р-глюкозидазы (27%; р<0,05). Сохранялось рассогласование активности ферментов системы антиоксидантной защиты (увеличение СОД в 2,9 раза, снижение активности ГР на 55%) и достоверно пониженное количество восстановленного глутатио-на. Содержание НАД+ через 7 дней после окончания алкогольной интоксикации осталось на уровне такового показателя во 2-й группе. Также зафиксирован достоверно повышенный уровень лактата (8,03+0,36 мкмоль/г), что на 25% превышает контрольную вели-
чину. Содержание ТАГ и СЖК сохранялось повышенным, то есть жировая инфильтрация печени не устранялась (рис). Количество общих фосфолипидов оставалось на 13% меньше контрольного уровня и составляло 60,28±2,19 против 68,70±2,17% (р<0,05). На 24% по сравнению с контролем снизилось содержание ЭХС (с 19,42±0,61 до 14,75±1,42%, р<0,001). Следовательно, этерифицирующая функция печени при отмене этанола в течение 7 дней не восстановилась.
Сохранялся высокий уровень ЛФХ (увеличение на 25% по сравнению с контролем, р<0,05) (табл. 2), что свидетельствует о повышенной активности фос-фолипаз. Следует отметить снижение количества основного фосфолипида митохондрий дифосфати-дилглицерина (ДФГ) на 19% (р<0,05) по сравнению с контролем, чего не отмечалось после 7-дневной интоксикации этанолом.
Таким образом, отмена этанола в течение 7 дней сопровождалась не полным восстановлением функционального состояния печени крыс. По нашему мнению, период отмены токсического агента является стрессом для организма, так как возросли величины изменений некоторых изученных биохимических параметров по отношению к интактным животным (увеличилось количество СЖК и снизилось содержание ЭХС, ДФГ и ФС).
Исследования по применению гепатопротектора «Легалона» и экстрактов из гребней калины и лимонника в период отмены этанола показал, что полученный биологический эффект влияния был в общем идентичен, но в ряде случаев имел разную степень выраженности. Так, при действии всех трех исследуемых препаратов нормализовалась активность ли-зосомальных гидролаз, уровень НАД+, содержание ТАГ и СЖК. То есть, препараты обладают выраженным гепатопротекторным эффектом. В то же время при действии «Легалона» оставались повышенными количество лактата и активность СОД, пониженными активность ГР и уровень Г-8И. При действии «Кали-фена» и «Экликита» эти величины соответствовали
Таблица 2
Влияние «Легалона» и экстрактов из гребней калины и лимонника на фосфолипидный состав печени крыс при интоксикации этиловым спиртом (в % от суммы всех фракций)
Биохимические параметры 1 группа (контроль) 2 группа (этанол) 3 группа (депривация) 4 группа (депривация + «Легалон») 5 группа (депривация + калина) 6 группа (депривация + лимонник)
ФХ 48,46+0,58 43,10+1,25* 46,83+1,90 47,90+1,05 47,78±1,08 50,10±1,08
ЛФХ 2,53+0,13 3,55+0,16* 3,15+0,15* 2,14+0,21 2,58+0,14 2,64±0,20
СМ 6,00+0,46 5,94+0,61 5,60+0,13 5,56+0,38 5,37+0,15 5,61±0,32
ФЭ 26,36+0,86 27,92+1,34 23,06+2,20 27,70+1,01 27,64+0,65 24,35±1,62
ЛФЭ 2,70+0,20 3,51+0,25* 2,50+0,11 1,75+0,15* 1,88+0,14* 1,49±0,11*
ФС 3,81+0,26 3,08+0,19* 2,74+0,33* 3,97+0,28 3,34+0,19 3,59±0,12
ФИ 4,44+0,33 5,70+0,52* 4,11+0,13 5,80+0,23* 5,53+0,13* 5,90±0,18*
ФК 1,64+0,14 1,57+0,18 1,68+0,19 1,05+0,07* 1,21+0,12* 2,12±0,14*
ДФГ 4,24+0,22 5,03+0,57 3,42+0,14* 4,15+0,39 4,65+0,39 4,19±0,16
Примечание: * - достоверные различия с контролем (р<0,05). ФХ - фосфатидилхолин, ЛФХ - лизофосфати-дилхолин, СМ - сфингомиелин, ФЭ - фосфатидилэтаноламин, ЛФЭ -лизофосфатидилэтанола-мин, ФС - фосфатидилферин, ФИ - фосфатидилинозит, ФК - фосфатидная кислота, ДФГ - ди-фосфатидилглицерин.
контрольному уровню. Обращает на себя внимание факт более высокого содержания НАД+ в печени крыс, получавших природные экстракты. При введении «Легалона» эта величина была на 18% меньше. Также следует обратить внимание на уровень эфиров холестерина в печени крыс 4-й и 5-й групп. Так, при введении «Легалона» уровень ЭХС соответствовал контрольной величине (соответственно, 19,0+1,49 и 19,42+0,61%). При введении экстрактов из гребней калины и лимонника содержание ЭХС составляло 24,27+0,92 и 23,14±1,59%, соответственно, что на 25% выше контрольного уровня (р<0,001). По нашему мнению, данный феномен обусловлен поступлением в гепатоцит возросшего потока холестерина в этерифицированной форме в составе липопротеидов высокой плотности. То есть, введение «Калифена» и «Экликита» сопровождается гипохолестеринемиче-ским эффектом.
«Легалон» и исследуемые препараты проявляли одинаковую восстанавливающую способность фос-фолипидного обмена, что говорит о нормализации этерифицирующей функции печени.
На основании вышеизложенного следует отметить, что растительные экстракты из гребней калины и лимонника обладают выраженным гепатозащит-ным действием при алкогольной интоксикации. Восстановление функционального состояния печени происходит более эффективно по сравнению с «Ле-галоном». Механизм действия исследуемых природных комплексов реализуется через антиоксидантный, мембраностабилизирующий и антигипоксический эффекты.
ЛИТЕРАТУРА
1. Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А. Общие механизмы токсического действия.-Л., 1986.280 с.
2. Гончаренко М.С., Латинова А.М. Метод оценки перекисного окисления липидов//Лаб. дело.-1985.-№1.-С.60-61.
3. Лекарственные растения: Справочное пособие/ Под ред. Н.И. Гринкевич.-М.: Высш. Школа, 1991.398 с.
4. Покровский А.А. Биохимические методы исследований в клинике.-М.: Медицина, 1969.-625 с.
5. Чумаков В.Н., Осинская Л.В. Количественный метод определения активности цинк-, медь-зависимой супероксиддисмутазы в биологическом материале// Вопр. мед. химии.-1977.-№5.-С.712-716.
6. Amenta J.S. A rapid chemical method for quantification of lipids separated by thin-layer chromatography //J. Lipid Res.-1964.-Vol.5, №2.-P.270-272.
7. Arora A., Byrem T.M., Nair M.G. et al. Modulation of liposomal membrane fluidity by flavonoids and isoflavonoids//Arch. Biochem. Biophys.-2000.-Vol.373, №1.-P.102-109.
8. Bergmeier H.U. Methods of еnzymatic аnalysis.-Third Ed.-Weinheim, 1984.-Vol.6.-701 p.
9. Carrasco M.P, Segovia J.L., Marco C. Incorporation of exogenous precursors into neutral lipids and phospholipids in rat hepatocytes: effect of ethanol in vitro//Biochem. Pharmacol.-1998.-Vol.56.-P.1639-1644.
10. de Groot H., Rauen U. Tissue injury by reactive oxygen species and the protective effects of flavonoids// Fundam. Clin. Pharmacol.-1998.-Vol.12, №3.-P.249-255.
11. Folch G., Less M., Sloane-Stanley G.H. A simple metod for the isolation and purification of total lipids from animal tissues//J.Biol.Chem.-1957.-Vol.226.-P.497-509.
12. Gajdos A., Gajdos-Torok M., Horn R. Therapeutic effect of the (+)- catechin on biochemical disorders of the liver in the ethanol intoxicated rat//Chem. Res. Seances. Soc. Biol. Fil.-1972.-Vol.166, №2.-Р.277-279.
13. Klingenberg M. Diphosphopyridin nucleotide (DPN).-New York, 1963.-590 p.
14. Lieber C.S. Alcohol and the liver: Metabolism of ethanol, metabolic effects and pathogenesis of injury//
Acta. Med. Scan.-1985.-№11.-703 p.
15. Moron M.S., Depierre T.W., Mannervik B. Levels of glutathione, gluthatione reductase and gluthatione S-transferase activities in rat lung and liver//Biochem. Biophys. Acta.-1979.-Vol.582.-P.67-78.
16. Packer L., Rimbach G., Virgili F. Antioxidant activity and biologic properties of a procyanidin-rich extract from pine (Pinus maritima) bark pycnogenol//Free Radic.Biol.Med.-1999.-Vol.27, №5-6.-P.704-724.
17. Purdon A.D., Patelunas D., Smith J.B. Evidence for the release of arachidonic acid through the selectiv action of phospholipase A2 in thrombin-stimulated
human platelets//Biochim. Biophys. Acta: Lipids and lipid. Metab.-1987.-Vol. 920 .-L85, №3.-P.205-214.
18. Svetachev V.I., Vaskovsky V.E. A simplified technique for thin layer microchromatography of lipids //J. Chromatography.-1972.-Vol.67.- P.376-378.
19. Vasilieva O.V., Lyubistky O.B., Klebanov G.I. et al. Effect of antioxidants on the kinetics of chain lipid peroxidation in liposomes//Membr. Cell. Biol.-1998.-Vol.12, №2.-P.223-231.
20. van Asker S.A., van Balen G.P., van den Berg D.J. et al. Influence of iron chelation on the antioxidant activity of flavonoids//Biochem. Pharmacol.-1998.-Vol.56, №8.-P.935-943.
□ □□
УДК 611-071.3
В.И.Хабаров, Д.В.Фроловский ПАРАМЕТРИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ АНАТОМИЧЕСКИХ СТРУКТУР
Новосибирский государственный технический университет, г. Новосибирск
РЕЗЮМЕ
В работе рассматривается подход к моделированию анатомических структур с использованием тригонометрических интерполяционных сумм. Решается задача деформации сеточной модели градиентным спуском.
SUMMARY V.I. Khabarov, D.V. Frolovski
PARAMETRIC MODEL OF ANATOMIC STRUCTURES
The paper describes anatomic structure model created with the help of trigonometric interpolation sums. Gradient descent has been used to solve the problem net model deformation.
В настоящее время разработано достаточно большое количество методов для трехмерного моделирования человеческого тела. Наиболее простыми и широко распространенными, являются способы, основанные на объемных элементах или триангуляции. Но, несмотря на их хорошую эффективность в построении биомедицинских изображений и задачах анализа, они не применимы в программах, где требуется более высокий порядок непрерывности представления.
Обычно не возможно получить совершенно верные и точные математические представления анатомических структур. Однако цифровые морфологические данные, извлеченные из этих способов изображения (например, координаты дискретных множеств точек на анатомически структурах) дают обильную эмпирическую информацию о конструкции приближенных представлений.
Тригонометрические интерполяционные суммы. Рассмотрим гладкую вещественную функцию ф,
определенную на р-мерном кубе У=[-1 1]х...х[-1 1].
Сумма
Ф(vl,...,vp)= X С(ф)к1,.
1=1
С{ф)
^-1,.
exp IX М- (vi+1) (2.1)
X
=1 /ТТ.
і, ехр| -У,]жк,=,
1-1
(2.2)
определяет тригонометрическую интерполяционную сумму (Т18) относительно множества
К..^Ур) V: V,. = ^/Ыг -I
= 0,...,2-1,, = 1,...,р
Т = (2 N ) точек в V. В Выражениях (2.1) и (2.2)
к,, = О,...,2 -1,/ И,,. = 1... р и ] = 4—\
Выражение (2.2) - это известное р-мерное векторное преобразование Фурье. его обратное преобразование дано в (2.1). Эти преобразования широко используются вследствие наличия эффективных алгоритмов для их вычислений.
Морфологическая информация об анатомической структуре М, т.е. контур, поверхность или 3-мерный объект человеческого тела, состоит из координат (х, у, 7) ограниченного множества в из точек М. Требуется вычислить параметрическое представление М на основе этих данных.
Для этой цели выберем произвольную гладкую
с
