CC BY
86
Известия Саратовского университета. 2010. Т. 10. Сер. Хпмпя Биология. Экология, вып. 1
УДК 535+57 (023)
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАНОЧАСТИЦ ТЮ2 ПРИ ФОТОДИНАМИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ СВЕТОДИОДНОГО СИНЕГО (405 нм) ИЗЛУЧЕНИЯ НА МИКРООРГАНИЗМЫ
Е.С. Тучина, Н.М. Абаева, В.В. Тучин
Саратовский государственный университет E-mail: [email protected] E-mail: [email protected]
ночастицы изначально находится в триплет-ном состоянии. Аналогичная молекула фотосенсибилизатора содержит связанный, каталитически неактивный синглетный кислород. Только под влиянием фотовоздействия его молекула переходит в триплетное состояние и становится готовой к участию в активизации кислорода среды [9].
Широко известно, что наночастицы серебра обладают выраженным бактерицидным эффектом. Антимикробную активность демонстрируют наночастицы меди, цинка, железа, оксидов металлов [8, 9]. Существенные преимущества перед серебряными нано-частицами имеют наночастицы диоксида титана. Титан не относится к группе тяжелых металлов, не является ксенобиотиком, эффективно генерирует синглетный кислород [9].
Целью работы являлось изучение действия синего (405 нм) излучения в сочетании с наночастицами диоксида титана на различные микроорганизмы.
Материалы и методы
Объектами исследования являлись микроорганизмы: Staphylococcus aureus 209 Р, Escherichia coli 113-13, Candida albicans 184 (ГИСК им. JI.A. Тарасевича, г. Москва). Микроорганизмы выращивали при температуре 37°С на ГРМ-агаре.
В качестве источника синего излучения использовали светодиод с максимумом спектра испускания X = 405±20 нм и плотностью мощности 31.5 мВт/см2. Во всех экспериментах режим излучения был непрерывный. Время облучения варьировали от 5 до 30 мин.
© Е.С. Тучина, ИМ. Абаева, В.В. Тучин,. Z010
Исследованы закономерности индуцированного синим излучением изменения численности популяции Staphylococcus aureus, Escherichia coti, Candida albicans в присутствии наночастиц. Подавляющий эффект действия синего излучения на бактерии S. aureus не носил дозозависимого харатера. Ключевые слова: фотодинамическая терапия, микроорганизмы, диоксид титана,
Using ТЮг Nanoparticles for the Photodynamic Action of Led Blue (405 nm) Radiation on Microorganisms
E.S. Tuchina, N.M. Abaeva, V.V. Tuchin
The regularities of radiation-induced changes in the population quantity of Staphylococcus aureus, Escherichia coii, Candida albicans in the presence of blue LED light and nanoparticles were studied. The effect of the blue radiation on the bacteria S. aureus was not dose-dependent.
Key words: phototherapy, microorganisms, titanium dioxide.
В настоящее время фотодинамическое воздействие используется для лечения раковых заболеваний, при антимикробной терапии, все более распространено при проведении различных физиотерапевтических и косметических процедур [1-5]. Данный метод основан на сочетанном действии лазерных или светодиодных источников излучения и красителей-фотосенсибилизаторов [3-5].
Известно более 400 веществ, обладающих свойствами фотосенсибилизаторов, среди которых производные хлоринов, бензо-порфиринов, нафтало- и фталоцианинов [1-6]. Альтернативой или дополнением к существующим фотосенсибилизаторам могут стать наночастицы различной природы и структуры [7~9].
Нанокатализаторы принципиально отличаются от фотосенсибилизаторов механизмом генерации активных форм кислорода. Молекула кислорода на поверхности на-
Е. С
Тучпна, МЛ Абаева, ß.ß. Тучин. Использование наночастщ ТЮ2
В качестве фотокатализатора использовали наночастицы диоксида титана (ТЮ2) в концентрации 0.02%.
Для проведения экспериментов использовали схему, разработанную ранее [10]. Для создания асептических условий иммунологический пол и старо ль ны й 96-луночный планшет помещали в стеклянный или пластиковый корпус. Источник света располагали над ячейками планшета. При постановке опытов использовали суточную культуру исследуемого штамма. Бактериальную взвесь готовили в стерильном физиологическом растворе; конечная концентрация составляла 5 тыс. микробных клеток на 1 мл. Из разведения микроорганизмов 10000 мк/мл 0.1 мл взвеси вносили в 0.9 мл раствора фотокатализатора, инкубировали в течение 10 мин необходимого времени без доступа света. Из конечного разведения, а также из раствора фотокатализатора бактериальную взвесь в объеме 0.2 мл вносили в ячейки планшета. Воздействие проводили на бактериальные клетки во взвеси, находящейся в соответствующих ячейках, последовательно увеличивая дозу излучения. После воздействия взвеси бактерий переносили на чашки Петри с плотной питательной средой и равномерно распределяли по поверхности стерильным шпателем. Учет результатов проводили путем подсчета числа колониеобразующих единиц (КОЕ) через 24-72 ч после инкубации при 37°С. Контролем служили взвеси бактерий, не обработанные наночастицами и не подвергнутые облучению. Каждый экспе-
римент проводили в десятикратной повтор-ности.
Результаты
Установлено, что микроорганизмы S. aureus чувствительны к действию синего излучения. Последовательное увеличение времени облучения от 5 до 30 мин приводило к сокращению числа колоний на 30-77%. На следующем этапе изучали действие синего излучения на клетки S. aureus, обработанные диоксидом титана. Показано, что при использовании фотокатализатора чувствительность данных микроорганизмов к действию синего излучения возрастает. Отмечено уменьшение числа колоний на 60-80% после воздействия в течение 5-30 мин. Необходимо отметить, что эффект синего излучения не носил зависимого от дозы характера. Число КОЕ после 10-15 мин облучения было выше, чем после 5 мин. После 30 мин воздействия снова наблюдалось снижение численности. Данная динамика сохранялась и после обработки клеток S. aureus фотокатализатором (рис.1).
Для дальнейших исследований в качестве модельного объекта использовали грамотрицательные микроорганизмы Е. coli. Было установлено, что данный микроорганизм устойчив к действию синего излучения. Уменьшение числа колоний происходило на 7-10% и недостоверно отличалось от контроля. Применение диоксида титана для обработки клеток Е. coli также не обеспечивало бактерицидного действия излучения (рис.2).
^ 120 1 о юо Н 80 -60 -40 -20 -0
1
10
15
30
Время, мин
Рис. 1. Действие синего (405 нм) светодиодного излучения на микроорганизмы S. aureus: Ш - синее излучение; 0 - синее излучение + TiO?.
Биология
51
О 5 10 15 30
Время, мин
Рис.2. Действие синего (405 им) светодиодного излучения на микроорганизмы Е. coli: 0 - синее излучение; 0 - синее излучение + ТЮ2
На следующем этапе работы изучали чувствительность дрожжей С. albicans к фотодинамическому воздействию. Облучение клеток данного вида микроорганизмов синим светом обеспечивало незначительный угнетающий эффект. Сокращение числа КОЕ от-
мечено на 10-15 % при варьировании времени облучения от 5 до 30 мин. После обработки клеток С. albicans диоксидом титана и облучении синим светом произошло уменьшение числа колоний на 10-20% (рис.3).
120 п
0J
О 100 -
80 -
60 -
40 -
20 -
0 -
А
ю
Л
15
30
Время, мин
Рис. 3 . Действие синего (405 нм) светодиодного излучения на микроорганизмы С. Albicans: 0 - синее излучение; □ - синее излучение + ТЮг
Обсуждение
В последние десятилетия лазерная и световая терапия, в том числе и с использованием синего (400-420 нм) излучения, активно развивается и находит широкое применение при лечении заболеваний, вызванных различными микроорганизмами.
В ходе исследований установлено, что S. aureus был наиболее чувствителен к фотодинамическому воздействию. Клеточная стенка грамположительного типа, характерная для данного вида, обусловливает адгезию моле-
кул фото катализатора на своей поверхности, а пористая структура пептидогликана не может препятствовать проникновению активных форм кислорода внутрь клетки [5, 6]. Также известно, что в клетках S. aureus содержатся разнообразные порфирины. Слож-ноорганизованные молекулы порфиринов имеют максимум поглощения в пределах от 400 до 420 нм и выступают в качестве эндогенных фотосенсибилизаторов, т.е. в их присутствии под действием излучения усиливается выход синглетного кислорода [11, 12].
52
Нд^/чнып отдеп
Е.С Тучпна, U.M. Лбаева, В.В. Тучин. Использование наночастиц ТЮг
Наличие подобных молекул-мишеней в бактериальной клетке повышает ее чувствительность к действию синего излучения. Тем не менее полного подавления роста S. aureus отмечено не было. Вероятно, это связано с наличием особых механизмов устойчивости, направленых на устранение, «тушение» молекул синглетного кислорода. В частности, эту функцию в клетках микроорганизмов выполняют такие ферментные комплексы, как каталаза, пероксидаза, супероксиддисму-таза [13].
Показано, что бактерии Е. coli были устойчивы к синему излучению, а также к его действию в сочетании с фотокатализатором. Клетки Е. coli имеют клеточную стенку грам-отрицательного типа: на поверхности содержится липополисахарид, образующий труднопроницаемую внешнюю мембрану [5]. Ввиду подобного строения взаимодействие наночастиц с поверхностью клетки затруднено, Время существования активных форм кислорода, образующихся в окружающей среде, недостаточно для того, чтобы проникнуть внутрь клетки и вызвать ее гибель.
Синее излучение не оказывало угнетающего воздействия на дрожжи С, albicans. Фотодинамический эффект при использовании наночастиц также был недостаточен для угнетения клеток данного микроорганизма. Дрожжи Candida являются эукариотически-ми организмами: их ядерный аппарат заключен в собственную оболочку [5, 13]. Количества образующихся активных форм кислорода при действии излучения с данными параметрами недостаточно, чтобы вызвать существенные изменения в структуре клеточной мембраны, органелл или генетического аппарата.
Таким образом, было установлено, что реакция микроорганизмов на действие синего излучения в сочетании с наночастицами зависит от строения их клеток и физиологических особенностей.
Выражаем признательность J1.E. Доло-тову за разработку светодиодного облучателя и помощь при проведении экспериментов.
Работа выполнена при финансовой поддержке аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 гг.)» (госконтракты №2.1.1/4989, №2.2.1.1/2950), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России (2009-2013 гг.)» (госконтракт №02.740.11.0484).
Библиографический список
1. Dougherty T.J. Photodynamic therapy // Medical radiology innovations in radiation oncology. 1988. №1. P. 175-188.
2. Бриль Т.Е. Молекулярные аспекты биологического действия низкоинтенсивного лазерного излучения // Актуальные проблемы патологии. Саратов, 2001. С. 124 -136.
3. Васильев Н.Е., Огиренко А.П. Антимикробная фотодинамическая терапия // Лазерная медицина. 2002. Т.6, №1. С.32-38.
4. Дуванский В. А. Фотодинамическая терапия в комплексном лечении больных с острыми гнойными заболеваниями мягких тканей // Лазерная медицина. 2003. Т.7, № 4. С.41-45.
5. НатЫгп M.R., Hasan Т. Photodynamic therapy: a new antimicrobial approach to infectious disease? // J. Photochem. Photobiol. 2004. №3. P.436-450.
6. Demidova T.N., Hamblin M.R. Photodynamic therapy targeted to pathogens // Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 2004. №17. P.245-254.
7. Feng O. L, Wu J., Chen G. O. et al. A mechanistic study of the antibacterial effect of silver ions on Escherichia coii and Staphylococcus aureus // J. Biomed. Mater. Res. 2000. №52. P.6624)68.
8. Sunada K., Watanabe Т., Hashimoto K. Studies on photokil-ling of bacteria on TiCh thin film // J. Photochem. Photobiol. 2003. №156. P.227-233.
9. Баллюзек Ф.В., Куркаев А.С., Сентле Л. Нанотехноло-гии в медицине. СПб., 2008. 103 с.
10. Тучина Е.С., Тучин В.В., Алыпшулер Г.Б., Ярославский И.В. Фотодинамическое воздействие красного (625 нм) излучения на бактерии вида Propionibacterium acnes, обработанные фотосенсибилизатором // Естественные и технические науки. 2008. №2(34). С.90-93.
11. Lamhrechts S.A., Demidova T.N., Aalders М.С, et al. Photodynamic therapy for Staphylococcus aureus infected burn wounds in mice // J. Photochem. Photobiol. 2005. №4. P.503-509.
12. Дерябин Д.Г. Стафилококки: экология и патогенность. Екатеринбург, 2000. 238 с.
13. Ермилова Е.В. Молекулярные аспекты адаптации прокариот. СПб., 2007. 299 с.
Бнолотя
53
