CC BY
150
Актуальн проблемы сучасно!' медицины
УДК 616+615-001.27
Гертман В.З., Пушкарь Е.С., Пономаренко С.В.
РАЗРАБОТКА ПАРАМЕТРОВ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ ФОТОДИНАМИЧНОЙ ТЕРАПИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СВЕТА В ОПТИЧЕСКОМ ДИАПАЗОНЕ И ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА МЕТИЛЕНОВОГО СИНЕГО
ГУ «Институт медицинской радиологии им. С.П. Григорьева Национальной академии медицинских наук Украины», г. Харьков
ГУ «Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова Национальной академии медицинских наук Украины», г. Харьков
Проведены исследования in vitro по разработке эффективной схемы антибактериальной фотодинамической терапии (ФДТ) для лечения инфицированных локальных радиационно-индуцированных повреждений кожи. Целью работы является подбор оптимальной концентрации, времени экспозиции выбранного фотосенсибилизатора (метиленового синего) и параметров экспозиции облучения с помощью светодиодного (LED) красного света (А - 6Э0-650 нм) для проведения антибактериальной ФДТ. Исследования проводились in vitro на культурах Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa в чашках Петри. В качестве фотосенсибилизатора использовался водный раствор красителя метиленового синего в виде аппликаций 0,1% и 0,05% раствора. Источником светодиодного излучения служил фотонный аппарат «БАРВА-LED / 6Э0». Установлено, что отдельные компоненты ФДТ - фотосенсибилизатор метиленовый синий и светодиодное излучение - не оказывали заметного антимикробного действия. При сочетании выбранных оптимальных параметров фотосенсибилизатора (0,1% водный раствор метиленового синего) и фотодиодного излучения (А - 6Э0-650 нм, 45 Дж / см ), т.е. при фотодинамическом действии, происходила гибель 99,8-99,98 % микробных клеток тест-штаммов S. aureus и P. аeruginosa. Полученные результаты позволяют рекомендовать данную схему антибактериальной ФДТ для проведения исследований in vivo.
Ключевые слова: фотодинамическая терапия, метиленовый синий, фотодиодное излучение, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
Работа выполнялась в рамках плановой научно-исследовательской работы «Вивчення ефективностi фотодинамiчноï те-рапп для лкування iнфiкованих променевих ушкоджень шюри», № гос. регистрации 0114U000058.
В незаживающих язвах различного генеза, а тем более на поверхности лучевых язв, довольно редко встречается бактериальная монокультура, обычно микробный пейзаж представлен полимикробным обсеменением [2]. По данным ряда авторов, в долго незаживающих язвах, в том числе лучевого генеза, чаще всего встречаются ассоциации из 2-3-х видов микробов, при этом лидирующее положение среди микрофлоры занимают Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa [2,4].
Известно, что традиционным методом лечения инфицированных лучевых язв является ан-тибиотикотерапия. Однако, подобное лечение значительно усложняется развитием резистентности микробов к антибиотикам. На этом фоне в последнее десятилетие стало активно развиваться направление с использованием альтернативных немедикаментозных методов лечения инфицированных ран и язв. В этом плане одним из перспективных направлений в медицине является фототерапия, в частности, фотодинамическая терапия (ФДТ).
ФДТ является светозависимой методологией и включает в себя два основных компонента -световое излучение различных длин волн в оптическом диапазоне и фотосенсибилизатор (ФС), способный накапливаться в клетках-мишенях [7].
Главное назначение фотосенсибилизатора -это способность поглощать падающую энергию направленного светового потока с развитием фотохимической реакции и передачей образо-
вавшейся энергии возбуждения присутствующему в тканях молекулярному кислороду, что приводит к образованию большого количества активных форм кислорода (АФК), прежде всего синглетного кислорода (1О2) и супероксид анион радикала кислорода (О2- •). Последние запускают целую цепь окислительных процессов, которые приводят к гибели клеток-мишеней посредством апоптоза или некроза [7].
Метод ФДТ широко применяется в онкологии, хирургии и других областях медицины. Одним из новых направлений в использовании ФДТ является лечение инфицированных дефектов кожи и мягких тканей [6,8]. Для этих целей применяются различные виды фотосенсибилизаторов.
Фотосенсибилизатор - это особое вещество, способное селективно накапливаться в таргет-ных клетках и впоследствии активно воздействовать на них под влиянием видимого света с длиной волны, соответствующей максимуму поглощения конкретного ФС. Для ФДТ разработано большое количество ФС с различными путями введения в организм: энтеральный, парентеральный, ингаляционный, аппликационный [8].
Для лечения ран и поверхностных повреждений кожи и мягких тканей чаще всего используют аппликационное введение ФС. В этом плане фотосенсибилизирующими свойствами обладают некоторые красители (метиленовый синий, бриллиантовый зеленый, генциан-виолет), фитопрепараты (хлорофилипт, новоиманин) [1, 5].
В1СНИК ВДНЗУ «Украгнська медична стоматологгчна академя»
Цель работы
Подбор оптимальной концентрации, времени экспозиции избранного фотосенсибилизатора (метиленового синего) и параметров экспозиции облучения светодиодным красным светом (А = 630-650 нм) для проведения антибактериальной фотодинамической терапии.
Материал и методы исследования
Исследования проводились in vitro на суточных микробных культурах Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa в чашках Петри диаметром 35 мм с питательным агаром. Использовались референтные штаммы S. aureus АТСС 25923 и P. аeruginosа АТСС 27853, полученные из Музея живых микроорганизмов ГУ «ИМИ НАМН».
Микробная нагрузка на одну чашку Петри составляла 3107 или 3106 микробных клеток стафилококка или синегнойной палочки соответственно. Число живых микроорганизмов определяли методом серийных разведений с последующим высевом на соответствующие питательные среды (для стафилококка маннит-солевой агар, для синегнойной палочки - питательный агар) [3]. Посевы культивировали в течение 18 часов при температуре 37 0С. Идентификацию тест-штаммов проводили по морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам. Концентрацию микроорганизмов определяли путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) с учетом разведения исследуемого материала. Для удобства полученные результаты выражали в десятичных логарифмах количества микроорганизмов в 1 мл - lg КоЕ/мл.
В качестве ФС использовался водный раствор красителя метиленового синего
(МеШу1епит соеги1еит - С16Н18С^^3Н2О) в виде аппликаций 0,1 и 0,05 % растворов. При подборе наиболее эффективной концентрации ФС исследования проводили для каждого вида бактерий. На поверхность, засеянную соответствующим видом микроорганизма, наносили салфетку, смоченную 0,1 или 0,05 % раствором метиленового синего. Экспозиция ФС составляла З0 мин.
Источником немонохроматического светодиодного красного излучения служил фотонный аппарат «БАРВА-LED/630». Условия светового воздействия были следующими:
- длина волны - 630-650 нм;
- мощность красного излучения - 25 мВт;
- плотность мощности на поверхности - 3 мВт/см2;
- плотность энергии за сеанс - 45 Дж/см ;
- экспозиция света - 20, 30 и 60 мин. Контролем служил показатель роста тест-
штаммов, которые не подвергались какому-либо воздействию, а содержались в условиях фонового освещения в течение 60 мин.
Опыты проводили в трех повторах. Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами статистики с помощью пакета программ STATISTICA. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Для выяснения оптимальных параметров избранного варианта фотодинамической терапии на первом этапе работы было проведено исследование противомикробной активности ФС ме-тиленового синего в зависимости от его концентрации. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Изменение количества жизнеспособных бактерий под действием фотосенсибилизатора метиленового синего в разных концентрациях при экспозиции 30 мин
Вид бактерий Концентрация ФС Среднее количество бактерий, (М ± m), lg КОЕ/мл
Опыт Контроль
S. aureus 0,1 % 7,28 ± 0,19 7,31 ± 0,15
S. aureus 0,05 % 7,30 ± 0,11
P. аeruginosa 0,1 % 7,29 ± 0,13 7,33 ± 0,06
P. аeruginosa 0,05 % 7,32 ± 0,17
Таблица 2
Изменение количества жизнеспособных бактерий под действием светодиодного красного излучения (диапазон длин волн от 630 до 650 нм)
Вид бактерий Среднее количество бактерий, (М ± m), lg КОЕ/мл
Контроль Опыт, время облучения, минуты
20 30 60
S. aureus 7,52 ± 0,14 7,51 ± 0,16 7,49 ± 0,15 7,49 ± 0,18
P. аeruginosa 7,27 ± 0,08 7,28 ± 0,13 7,22 ± 0,11 7,21 ± 0,16
Анализ полученных данных показал, что 0,1 % и 0,05 % растворы метиленового синего не понижали значимо количество жизнеспособных клеток бактерий, то есть сам по себе ФС не обладал противомикробным эффектом. Так, независимо от концентрации ФС, выживаемость микробных клеток сохранялась на уровне 90100 % (проценты считали от числа абсолютного
количества бактерий).
Во второй серии экспериментов были проведены исследования по выяснению противомик-робной активности сверх ярких светодиодов в оптическом диапазоне при длине волны 630650 нм. Чашки Петри, засеянные тест-штаммами, облучали потоком света при разной экспозиции - 20, 30 и 60 мин. Результаты ис-
АктуальН проблеми сучасно!' медицины
следования представлены в таблице 2.
Анализ результатов действия светодиодного красного излучения продемонстрировал его незначительное влияние на жизнеспособность как S. aureus, так и P. Aeruginosa (табл. 2). Так, освещение в течение 20 мин практически не уменьшало количество S. aureus и P. aeruginosa, микробы сохраняли способность к размножению в 98-100 % случаев. При освещении с экспозицией 30 мин наблюдалась тенденция к снижению количества выживших микробов (относительно контроля), особенно в культуре P. aeruginosa (на 20 %, p > 0,05). При экспозиции света 60 мин количество живых бактерий S. aureus оставалось на том же уровне (94 %), как и при предыдущей экспозиции. При 60-минутном световом облучении культуры P. aeruginosa наблюдалось недостоверное увеличение гибели микробов на 22 % (p > 0,05).
Выявленную тенденцию к снижению количества жизнеспособных клеток очевидно можно
при его резных экспозициях по покэзэтелям
связать с наличием в клетках микроорганизмов эндогенных фотосенсибилизаторов с максимумом поглощения красного света, которые относятся к классу порфиринов. Это может объяснить факты восприимчивости микроорганизмов к действию некоторых видов излучения [7].
Эксперименты, проводившиеся на следующем этапе работы, были направлены на выяснение наибольшей антимикробной эффективности плотности световой энергии на поверхности 10 см2 за сеанс при экспозициях 20, 30 и 60 мин. При этом определение данного параметра светового излучения проводили совместно с ФС метиленовым синим, чтобы оценить значимость длительности световой экспозиции для антимикробного эффекта. Использовали водный раствор фотосенсибилизатора метиленового синего в 0,1 % концентрации при его экспозиции 30 мин. Полученные данные приведены в таблице 3.
Таблица 3
Выбор оптимальной плотности энергии светового излучения <оличества жизнеспособных микробов (мощность 25 мВт/см2)
Вид бактерий Концентрация ФС Время действия ФС, мин Экспозиция светового излучения мин Плотность энергии светового излучения, Дж/см Среднее количество выживших бактерш (М ± m), lg КОЕ/мл
S. aureus 0,1 % 30 20 30 Дж/см2 6,11 ± 0,15*
S. aureus 0,1 % 30 30 45 Дж/см2 4,98 ± 0,23*
S. aureus 0,1 % 30 60 90 Дж/см2 4,12 ± 0,17*
S. aureus Контроль 0 0 0 0 7,53 ± 0,17
P. aeruginosa 0,1 % 30 20 30 Дж/см2 5,07 ± 0,31*
P. aeruginosa 0,1 % 30 30 45 Дж/см2 5,08 ± 0,24*
P. aeruginosa 0,1 % 30 60 90 Дж/см2 4,98 ± 0,26*
P. aeruginosa Контроль 0 0 0 0 7,12 ± 0,07
Примечание: * - разница достоверна по отношению к контр
Продемонстрированные в табл. 3 результаты свидетельствуют о том, что фоновое излучение (контроль) не вызывает гибели микробных клеток. При обработке исследуемых микроорганизмов 0,1 % раствором метиленового синего уже при экспозиции светового излучения 20 мин с плотностью энергии на поверхности за сеанс 30 Дж/см2 происходила гибель 98 % микробных клеток стафилококка и 99,4 % синегнойной палочки (p < 0,05).
При увеличении экспозиции освещения до 30 мин и повышении плотности энергии на поверхности до 45 Дж/см2 происходила значительная элиминация бактерий S. aureus - количество жизнеспособных клеток составляло всего 0,2 -0,02 % относительно контроля (p < 0,05). Примерно такие же показатели наблюдались при анализе результатов действия ФДТ на тест-штамм P. seruginosa.
При увеличении времени воздействия до 60 мин (плотность энергии на поверхности 90 Дж/см2) наблюдалась тенденция к усилению антимикробного эффекта.
I, р < 0,05.
Выводы и перспективы дальнейших исследований
При действии на микробные клетки отдельных составляющих комплекса фотодинамической терапии (фотосенсибилизатор метилено-вый синий и облучение сверхяркими светодио-дами в красном участке оптического спектра) не выявлено достоверного снижения количества жизнеспособных клеток относительно контроля.
Обработка микроорганизмов фотосенсибилизатором с последующим светодиодным облучением, то есть воздействие на микроорганизмы ФДТ, оказывало выраженный противомикроб-ный эффект как на грамположительные (стафилококки), так и на грам-отрицательные бактерии.
С увеличением плотности энергии светового излучения при проведении ФДТ противомикроб-ный эффект возрастает.
Последовательное использование фотосенсибилизатора (0,1 % водного раствора метиле-нового синего) и немонохроматического фотодиодного излучения (длина волны 630 - 650 нм, экспозиция 30 мин) вызывает гибель 99,8-99,98 % микробных клеток тест-штаммов S. aureus и P. eeruginosa.
В1СНИК ВДНЗУ «Украгнська медична стоматол.ог%чна академя»
На основании проведенных in vitro экспериментов подобраны оптимальные параметры концентрации и экспозиции фотосенсибилизатора, а также дозы плотности поверхностной энергии излучения, что обусловило выбор этих компонентов ФДТ для проведения дальнейших исследований in vivo в терапии инфицированных локальных радиационно-индуцированных повреждений кожи.
Литература
1. Садыков Р.А. Возможности метиленовой сини в фотодинамической инактивации антибиотикорезистентных штаммов бактерий / Р.А. Садыков, Л.В. Баженова, К.Р. Касымова, Р.Р. Садыков // Фотобюлопя та фотомедицина. - 2011. - № 1. - С. 84-87.
2. Гайдуль К.В. Раневая инфекция. Этиология, диагностика и антимикробная терапия. Краткое информационное пособие для практических врачей / К.В. Гайдуль, А.А. Муконин. - Новосибирск : ООО «АБОЛмед», 2005. - 31 с.
3. Лабинская А.С. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований / А.С Лабинская, А.П. Блин-кова, А.С. Ещина. - М. : Медицина, 2004. - 576 с.
4. Медицинские средства профилактики и терапии радиационных поражений. Учебное пособие / А.Н. Гребенюк, В.И. Легеза, В.Б. Назаров, А.А. Томашевский. - СПб. : ООО Издательство ФОЛИАНТ, 2011. - 92 с.
5. Плавский В.Ю. Первичный отбор фотосенсибилизаторов для антимикробной фотодинамической терапии из экстрактов и настоек лекарственных растений / В.Ю. Плавский, Л.Г. Плавская, А.И. Третьякова [и др.] // Лазерно-информационные технологии в медицине, биологии и геоэкологии-2010: труды XVIII между-нар. конф. 7-11 сентября 2010 г., п. Абрау-Дюрсо, г. Новороссийск, Краснодарский край. - Новороссийск, 2010. - С. 24-25.
6. Странадко Е.Ф. Фотодинамическая терапия гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей / Е.Ф. Странадко // Фотобюлопя та фотомедицина. - 2011. - № 2. - С. 14-19.
7. Узденский А.Б. Клеточно-молекулярные механизмы фотодинамической терапии / А.Б. Узденский. - М. : Наука, 2010. - 321 с.
8. Jori G. Photodynamic therapy in the treatment of microbial infections: basic principles and perspective applications / G. Jori, С. Fabris, М. Soncin [et al.] // Lasers Surg Med. - 2006. - Vol. 38 (5). - P. 468-481.
Реферат
РОЗРОБКА ПАРАМЕТР1В АНТИБАКТЕР1АЛЬНО1 ФОТОДИНАМ1ЧНО1 ТЕРАПИ З ВИКОРИСТАННЯМ СВ1ТЛА В ОПТИЧНОМУ Д1АПАЗОН1 I ФОТОСЕНСИБ1Л1ЗАТОРА МЕТИЛЕНОВОГО СИНЬОГО Гертман В.З., Пушкар О.С., Пономаренко С.В.
Ключов1 слова: фотодинам1чна терагля, метиленовий сижй, фотодюдне випромшювання, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
Проведено дослщження in vitro з розробки ефективно'Г схеми антибактерiальноT фотодинамiчноT терапп (ФДТ) для лкування шфкованих локальних радiацiйно-iндукованих пошкоджень шюри. Метою роботи став п^^р оптимально' концентраций часу експозицп обраного фотосенсиб^затора (метиле-нового синього) i параметрiв експозицп опромшення за допомогою св^лодюдного (LED) червоного свн тла (А - 630-650 нм) для проведення антибактерiальноT ФДТ. Дослщження проводилися in vitro на культурах Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa в чашках Петрк В якост фотосенсиб^зато-ра використовувався водний розчин барвника метиленового синього у виглядi аплкацш 0,1% i 0,05% розчину. Джерелом свп"лодюдного випромшювання служив фотонний апарат «БАРВА-LED / 630». Встановлено, що окремi компоненти фДт - метиленовий синш фотосенсиб^затор i свп"лодюдне випромшювання - не проявили пом^ного антимiкробного ефекту. Комбша^я обраного оптимального фотосенсиб^затора (0,1% водного розчину метиленового синього) i фотодюдного випромшювання (А - 630-650 нм, 45 Дж / см2), тобто з фотодинамiчною дieю, привела до знищення 99,8-99,98 % мiкробних кл^ин тест-штамiв S. aureus i P. aeruginosa. Отриман результати дозволяють рекомендувати цю ан-тибактерiальну схему ФДТ для дослщжень in vivo.
Summary
ELABORATION OF PARAMETERS FOR ANTIBACTERIAL PHOTODYNAMIC THERAPY WITH USING LIGHT IN OPTICAL RANGE AND METHYLENE BLUE PHOTOSENSITIZER Gertman V. Z., Pushkar O. S., Ponomarenko S. V.
Key words: photodynamic therapy, methylene blue, photodiode radiation, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
This in vitro study focuses on the elaboration of effective scheme of antibacterial photodynamic therapy (PDT) to treat infected local radiation-induced skin injuries. The purpose of the work is to select optimal concentration, exposure time of the photosensitizer (methylene blue) and exposure parametres of irradiation with light-emitting diode (LED) red light (А - 630-650 nm) for antibacterial PDT. The studies were performed in vitro on Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa germ cultures in the Petri dishes. Methylene blue aqueous solution in the form of 0, 1% and 0, 05% solution applications was used as a photosensitizer. A source of LED radiation was a photon devise "BARVA-LED/630". It was found that separate components of PDT - methylene blue photosensitizer and LED radiation - did not produce a noticeable antimicrobial effect. The combination of selected optimal photosensitizer (methylene blue 0, 1% aqueous solution) and photodiode radiation (А - 630-650 nm, 45 J/cm2) with photodynamic action, led to complete elimination of microorganisms (P. aeruginosa and S. aureus). The obtained results enables to recommend this antibacterial PDT scheme for further in vivo studies.
